白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学中昆虫体内稳定表达的内参基因技术领域，具体地涉及白 背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因筛选方法及应用。
【背景技术】
[0002] 白背飞虱White-backedplanthopper(Sogatellafurcifera(Horvdth))，属节肢 动物门，昆虫纲，半翅目，飞虱科，一生经历3个发育阶段，包括卵期、若虫期和成虫期，成虫 具有迀飞习性。白背飞虱在我国分布广泛，包括华南、华中、华北、东北以及西南稻区，西北 稻区可达新疆自治区的米泉等地都有其分布。水稻是白背飞虱适宜寄主，白背飞虱不仅可 以刺吸水稻韧皮部汁液，还可以传播多种病毒病，给水稻生产造成重大损失。
[0003] 白背飞虱完成一个生命周期需要经过卵、若虫、成虫三种虫态，属于渐变态昆虫。 白背飞虱一年发生3~4代，雄成虫较雌成虫羽化早，雌成虫一生只交配1次，雄成虫可 交配3~4次，雌虫产卵的部位集中于稻株基部。白背飞虱存在着形态和行为的多态现 象，即迀飞型（以长翅型为代表）和居留型（以短翅型为代表），温度对白背飞虱翅型的 分化起着重要的作用，但一般情况下白背飞虱短翅型雄虫极少见。近年来，实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)技术以其快速、灵敏、准确、重复性高、可定量、适用范围广等特点优势，已被 广泛应用于基因表达分析。在使用相对定量方法时需要一个在实验组和对照组中表达量恒 定的参考基因作为检测目的基因在特定条件下表达水平变化的参照物，用来归一化二者的 实验数据，这里的参考基因即为内参基因。一个内参基因在特定的实验条件下能持续稳定 的表达是其可应用的基本前提。理想的内参基因应该满足以下条件：不存在假基因，以避免 基因组DNA的扩增；高度或中度表达；稳定表达于不同类型的细胞和组织；表达水平与目标 基因相似；不受任何内源性或外源性因素的影响。常用的内参基因都是维持正常的细胞生 命活动所必须的基因，如八(^111、185、64?011、1\1131111等，但是没有一种内参基因1111?^表达水 平在所有的条件下是一成不变的，一些内参基因在某种特定条件下，其表达可能发生变化。 因此，研宄不同的环境条件下，某一有机体内基因的表达情况，内参基因的选择至关重要。 近年来，随着昆虫功能基因研宄的深入，某些功能基因在不同组织部位的表达量差异很大， 研宄这种差异形成的原因，对于其功能的阐明有着重要的意义。本发明提供了筛选白背飞 虱不同组织部位稳定表达内参基因的方法，并验证来了最稳定的内参基因为RPL9,为未来 白背飞虱功能基因的研宄提供理论基础。
【发明内容】
[0004]本发明提供的白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因，为白背飞虱不同组织 部位内参基因的选择提供依据。
[0005] 同时提供该内参基因的筛选方法及应用。
[0006] 本发明根据NCBI已经公开发表的其它昆虫相关基因序列，设计简并引物，PCR获 得白背飞虱6个常用内参基因部分核苷酸序列，经过克隆、测序以及与NCBI数据库Blast比对，确定为白背飞虱内参基因的部分序列；随后又基于此序列设计特异性的定量引物，建 立基于SYBRGreenI染料技术的RT-qPCR方法，利用荧光定量PCR技术筛选出了白背飞虱 不同组织部位最稳定的内参基因，从而为今后研宄不同组织部位基因表达水平以及白背飞 虱的基因功能方面建立坚实的基础。
[0007] 白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因RPL9,其核苷酸序列为SEQIDN0 :7。
[0008] 白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因RPL9的筛选方法，包括如下步骤：
[0009] (1)白背飞虱饲养：白背飞虱为实验室饲养种群，饲养于人工气候箱中，饲养条件 是27±1°C，75±5%，光周期为16h光照：8h黑暗；
[0010] (2)获得内参基因序列：GenBank数据库公开的白背飞虱18S序列，登录号为 JX556779. 1 ;RPL9和RPL10的序列由转录组测序获得，所述获得的具体过程为利用Ion ProtonII测序平台，对白背飞虱唾液腺组织总RNA进行高通量测序，根据注释结果查找获 得RPL9和RPL10的序列，与数据库中的序列Blast比对，确定了RPL9和RPL10的部分序列， 见SEQIDN0 :7和SEQIDN0 :8 ;基于NCBI已经公开的相关基因序列，设计合成了 6个白 背飞虱内参基因简并引物，序列如下：
[0012] (3)确定白背飞虱内参基因序列：简并引物PCR扩增获得序列进行克隆并测序，将 获得序列与NCBI数据库进行Blast比对，以确定内参基因序列，见SEQIDNO:1、SEQID NO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8 ;
[0013] (4)设计特异性的荧光定量引物：基于获得白背飞虱内参基因序列，设计特异性 荧光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲线法确定其扩增特异性，并设置10倍梯度稀释 建立标准曲线，确立每对引物的扩增效率；
[0014]
[0015] (5)提取白背飞虱头部、胸部、腹部、雄性成虫和雌性成虫样本的总RNA，分别反转 录合成cDNA进行实时荧光定量PCR分析；
[0016] (6)将实时荧光定量PCR实验数据输入到在线分析软件Refinder进行内参基因稳 定性分析，确立最稳定表达的内参基因。
[0017]步骤（3)中PCR扩增的反应条件如下：94 °C，3min，（94 °C，30sec，55 °C， 30sec, 72°C，lmin) 35 个循环，72°C延伸lmin，4°C保存。
[0018] 步骤（3)中核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：
[0019] 纯化步骤（2)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T 载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5a中，37°C平板培养过夜，蓝白斑筛选含目的片 段的阳性克隆菌株，对所获得的阳性克隆进行序列测序，测序所得的序列与NCBI数据库进 行BLAST比较分析，进而确定所得的核苷酸序列为白背飞虱内参基因序列。
[0020] 所述步骤⑷的方法为：提取白背飞虱的总RNA，反转录获得CDNA，然后以cDNA为 模板进行qPCR扩增，荧光染料为SYBRGreenI〇
[0021] 所述的qPCR扩增采用两步法，即95°C预变性15min，PCR反应为95°C，10sec， 60°C，32sec，40个循环，最后是溶解曲线分析，步骤为：95°C，15sec，60°Clmin，95°C， 30sec,G0°G,15sec。
[0022] 白背飞虱不同组织部位稳定表达的内参基因RPL9作为内参基因在研宄白背飞虱 不同组织部位基因表达水平中的应用。
[0023] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0024] 选取同一饲养条件（27±1°C，75±5%，光周期为16h光照：8h黑暗）下的白 背飞虱。解剖出羽化两天后雌虫和雄虫的头部、胸部、腹部组织、雌成虫整体和雄成虫整 体，分别提取总RNA，反转录合成cDNA。然后进行荧光定量PCR验证9个内参基因稳定 性情况，筛选出白背飞虱不同组织部位中最稳定的内参基因。这9个内参基因包括：延 伸因子l_a(Elongationfactor1-alpha，EF1A)、泛素（Polyubiquitin，UB)、核糖体 蛋白S18(RibosomalproteinS18，RPS18)、肌动蛋白（Actinl，ACTIN)、a-1 微管蛋白 (Alpha-l-tubulin，A1TU)、3_ 磷酸甘油酸（Glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH)、核糖体 蛋白L9(RibosomalproteinL9，RPL9)、核糖体蛋白L10(RibosomalproteinL10，RPL10) 和18SrRNA(18S)。其中18S序列在数据库已经公开发表，RPL9和RPL10的序列根据是根据 转录组测序获得。另外6个内参基因包括：EF1A，UB，RPS18,ACTIN，A1TU，GAPDH是根据数 据库已经公开的相关序列设计简并引物，PCR扩增并克隆测序，确定了部分序列。随后基于 此序列设计荧光定量相关的引物，进行实时荧光定量PCR验证。所获得数据，采用在线分析 软件RefFinder(http://www.leonxie.com/referencegene.php)进行数据分析。从而筛选 出白背飞虱不同组织部位下最稳定表达的内参基因。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0026] 1.本发明首次克隆得到白背飞虱的6个内参基因（EF1A，UB，RPS18，ACTIN，A1TU， GAPDH)部分基因片段，丰富了白背飞虱内参基因资源。
[0027] 2.本发明首次验证和比较了 9个常用内参基因（EF1A，UB，RPS18,ACTIN，A1TU， GAPDH，RPL9,RPL10,18S)在白背飞虱虫体中的表达量。
[0028] 3.本发明设计的定量PCR引物具有特异性，并具有90%以上的扩增效率，能够为 准确定量提供坚实基础。
[0029] 4.本发明利用荧光定量PCR技术首次验证并筛选出了白背飞虱不同组织部位稳 定的内参基因RPL9。
【附图说明】
[0030] 图1.白背飞虱6个内参基因（EF1A，UB，RPS18,ACTIN，A1TU，GAPDH)简并引物的 PCR电泳图；
[0031]其中：M代表DL2000DNAMarker，从上到下依次为 2000bp，1000bp，750bp，500bp， 250bp, 100bp〇 1：GAPDH；2 ：A1TU；3：ACTIN；4：UB；5 ：RPS18 ；6 ：EFlA〇
[0032] 图2.白背飞虱9个内参基因在进行荧光定量PCR实验时的溶解曲线。
[0033] 其中：横坐标代表在溶解曲线扩增阶段，从60°C到95°C之间的温度范围；纵坐标 代表SYBRGreenI荧光染料结合到目标片段的双链DNA后，进入溶解曲线扩增阶段，随温 度升高，被R0X标准化后的SYBRGreenI荧光信号值即&的导数值，峰值指在所对应的温 度下&急剧降低的拐点处的导数值。
[0034] 图3.白背飞虱9个内参基因的10倍梯度稀释扩增曲线。
[0035] 其中：横坐标代表qPCR扩增时的循环数，即Ct值；纵坐标代表在对应循环数下的 心值。图4.荧光定量PCR实验9个内参基因的Ct值绘制成盒须图，Ct值越大基