专利名称：马钱子总碱的提取分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种中药有效成分的提取方法，特别是涉及一种从中药马钱子中提取马钱子总生物碱的方法，属于药物技术领域。
背景技术：
马钱子又名番木鳖，始载于《本早纲目》，味苦，寒性，有大毒，归肝，脾经，功效为通络止痛，散结消肿。临床上用与风湿顽痹，麻木瘫痪，跌打损伤，痈疽肿痛，小儿麻痹后遗症， 类风湿性关节炎等疾病；但具有剧毒的特性严重影响其在临床上的应用，所谓“毒药猛剂善起沉疴”。马钱子的治疗量为O. 3-0. 6g，过量易出现中毒，如何合理安全使用马钱子，成为近年的研究热点之一。
研究表明，总生物碱是马钱子中最主要的有效部位，包括马钱子碱、士的宁、番木鳖次碱、马钱子新碱、番木鳖甙、依卡精等，其中马钱子中的主要生物碱成分中马钱子碱具有抗炎、镇痛作用，而其中士的宁是中枢神经兴奋剂，主要在临床上治疗面瘫，神经麻痹等， 同时其为主要的毒性成分，基本无抗炎、镇痛作用；文献报道小鼠灌服士的宁、马钱子碱、马钱子仁的LD50分别为3. 27mg/kg、233mg/kg和234. 5mg/kg ;小鼠腹腔注射上述药物的LD50 分别为1. 53mg/kg、69. 77mg/kg和76mg/kg，其口服中毒剂量成人为5 10mg，口服致死量为30mg。表明士的宁是马钱子中的主要毒性成分。有文献报道，分别用士的宁和马钱子碱给小鼠灌胃，两者的LD50分别为3. 27mg/kg和233mg/kg，由此可以得知士的宁的安全性很低，如果能除去马钱子总生物碱中的部分士的宁，则既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎镇痛的药理活性，提高临床用药的安全性。因此，现代研究中需要一种能降低士的宁含量的马钱子总碱的提取方法。有文献报道，分别用士的宁和马钱子碱给小鼠灌胃，两者的LD50 分别为3. 27mg/kg和233mg/kg，由此可以得知士的宁的安全性很低，如果能除去马钱子总碱中的部分士的宁，则既能降低其毒性，又能保留其原有的抗炎镇痛的药理活性，提高临床用药的安全性。因此，现代研究中需要一种能降低士的宁含量的马钱子 总碱的提取方法。发明内容
本发明的目的在于提供一种安全、成本低、收率高、能有效降低士的宁含量的马钱子总生物碱的提取方法。主要是利用马钱子碱在多种溶剂中的溶解度大于士的宁，因此可以通过不同的溶剂提取达到马钱子碱和士的宁分离的效果。
本发明是通过以下技术方案实现的
方法一
(I)酸水提取-有机溶剂萃取法取马钱子粉碎成粗粉，加酸液提取，合并提取液， 过滤，滤液调整PH值至10-11，碱化后的溶液用有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品；
(2)溶剂-分步萃取法步骤⑴中得到的马钱子总碱粗品加溶剂溶解提取，提取液过滤，滤液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱。
方法二
酸水提取-有机溶剂萃取法可以用醇提取-有机溶剂萃取法代替。
醇提取-有机溶剂萃取法步骤为取马钱子粉碎成粗粉，加乙醇回流提取，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，调整pH值至10-11,碱化后的溶液用有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品。
纯化方法仍采用溶剂-分步萃取法，操作同方法一。
方法三
酸水提取-有机溶剂萃取法还可以用碱化-有机溶剂萃取法代替。
碱化-有机溶剂萃取法步骤为取马钱子粉碎成粗粉，加碱液提取，合并提取液， 过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品；其中，碱液是指氢氧化I丐溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种。
纯化方法仍采用溶剂-分步萃取法，操作同方法一。
方法四
溶剂-分步萃取法可以用硫酸盐-盐酸盐分步结晶法代替。
硫酸盐-盐酸盐分步结晶法步骤为步骤(I)中得到的马钱子总碱粗品加硫酸盐， 使士的宁形成结晶，滤除部分士的宁的母液加入盐酸形成马钱子碱盐酸盐，通过重结晶法纯化马钱子碱。
马钱子总碱粗品由上述方法一或方法二或方法三记载的方法得到。
基于上述工艺过程，发明人又进行了进一步的研究，细化各步骤的参数，从而筛选出最优方案，具体内容如下
酸水提取-有机溶剂萃取法中的酸液是指O. 5mol/L-5mol/L的盐酸、O. 5mol/ L-2mol/L的硫酸、O. 5mol/L-5mol/L盐酸乙醇溶液、O. 5mol/L_2mol/L硫酸乙醇溶液中的一种；酸液用量为5-12倍量，加热回流次数为1-3次，每次O. 5-2小时；提取方法为渗漉法， 回流法、搅拌法中的一种，优选的方案是酸液是指lmol/L的盐酸；加热回流法；酸液用量10 倍量；加热回流2次，每次1. 5小时。
溶剂-分步萃取法中提取马钱子总碱粗品的溶剂是指甲醇、水、碱水、乙酸乙酯溶液中的一种；优选碱水溶液，碱水溶液可用氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种或几种；优选氨水溶液。萃取溶剂为乙酸乙酯，其乙酸乙酯的用量为O. 5-4倍量；萃取次数为2-6次。优选I倍量，萃取4次。
醇提取-有机溶剂萃取法步骤为取马钱子粉碎成粗粉，加乙醇(50% -95%乙醇)提取(回流、渗漉、搅拌)，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，调整PH值至 10-11，碱化后的溶液用有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品。
其中优选50 %乙醇，萃取溶剂优选乙酸乙酯。
酸水提取-有机溶剂萃取法还可以用碱化-有机溶剂萃取法代替。
碱化-有机溶剂萃取法步骤为取马钱子粉碎成粗粉，加碱液提取，合并提取液， 过滤，滤液用有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品。
其中，碱液是指氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种。优选氨水提取。萃取溶剂优选氯仿或乙酸乙酯。
溶剂-分步萃取法可以用硫酸盐-盐酸盐分步结晶法代替。
硫酸盐-盐酸盐分步结晶法步骤为步骤(I)中得到的马钱子总碱粗品加硫酸盐， 使士的宁形成结晶，滤除部分士的宁的母液加入盐酸形成马钱子碱盐酸盐，通过重结晶法纯化得到马钱子碱。
本发明中的有机溶剂是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一种。
通过以上方法制得的马钱子总碱中的马钱子碱含量≥ 80%。
本发明药物的活性成分可以加入药剂学上可接受的辅料按常规工艺制备成所需制剂。如可以制成常用的片剂(分散片、泡腾片、口腔崩解片、含片、咀嚼片、泡腾片)、胶囊剂(硬胶囊、软胶囊剂)、颗粒剂、丸剂(滴丸剂)、散剂等固体制剂形式的口服药物，也可以制成糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；还可以制成膏剂、凝胶剂、软膏剂、巴布剂、 贴膏剂、搽剂、洗剂、涂膜剂等外用制剂形式的外用药物。因此，该药物组合物中除有效成分外，还可以含有药学上可以接受的辅料。
这里所述的辅料，可以根据不同的制剂有所不同，如在片剂、胶囊剂、颗粒剂等固体制剂中常用的稀释剂、崩解剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、填充剂等；在糖衆、 口服液等液体制剂形式中常用的表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂、助流剂等；在凝胶剂、软膏剂等外用制剂形式中常用的药用油性基质、水性基质、防腐剂、抗氧剂、保湿剂、透皮吸收促进剂、表面活性剂等。
其常用辅料如淀粉、乳糖、糊精、糖粉、微晶纤维素、甘露醇、木糖醇、聚乙二醇、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、改良淀粉、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、重质碳酸镁、羧甲基纤维素钠、 羟丙甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲淀粉钠、羟丙基纤维素、聚维酮K30、白陶土、预胶化淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、甜叶菊苷、甜菜碱、阿司帕坦、甘草甜素、糖精钠、枸橼酸、碳酸氢钠、碳酸钠、卡拉胶、琼脂、明胶、海藻酸钠、黄原胶、瓜耳豆胶、西黄耆胶、 阿拉伯胶、槐豆胶、刺梧桐胶、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、聚丙烯酰胺、交联型聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、卡波姆、山梨酸、山梨酸钾、羟苯乙酯、苯甲醇、尼泊金、硫柳汞、二甲基亚砜、氮酮、 三乙醇胺、氢氧化钠、甘油、丙二醇、BHT、BHA、十二烷基硫酸钠、吐温类、司盘类等。
马钱子为马钱科植物马钱(Strychnos nux-vomica L.)的干燥成熟种子经炮制所得制马钱子，具有通络止痛、消肿散结的功效，临床用于治疗风湿顽痹、麻木瘫痪、跌打损伤和痈疽肿痛等疾病。马钱子主要活性成分为总生物碱，其中生物碱成分中马钱子碱具有较好的抗炎镇痛的药理活性，是马钱子的主要有效成分，而另一含量较高的士的宁是强毒性成分，同时为无效成分，所以在提取过程中需要提高马钱子碱的含量，降低士的宁的含量。
本发明人在前期的有效部位药效筛选试验(弗氏完全佐剂致大鼠足跖急性肿胀及痛反应指数的试验)的结果表明，实验发现A组(马钱子碱含量90% ) QSmg.kg—lB组 (马钱子碱士的宁=2 1) (25mg. kg-1)和阳性药(扶他林)均可抑制由FCA引起的急性足跖肿胀和屈关节疼痛，而C组(马钱子碱士的宁=1 2) (25mg. kg-1)山组(士的宁含量90% ) (25mg. kg-1)对其效果都不明显，说明士的宁是抗炎、镇痛的无效成分和主要毒性成分。该部分详细试验记载在同日提交的另一份文件中，在此不再重复描述。
所以本发明在前期研究的基础上，进一步提纯马钱子碱的含量，降低士的宁的含量。对其工艺进行了进一步优化。
马钱子总碱中马钱子碱、士的宁在水中溶解度小，但易溶于醇、氯仿等，提取时一般采用溶剂法。对不同种类不同浓度的酸水和不同浓度的酸乙醇溶液进行溶剂的筛选，选择出马钱子碱转移率和含量较高而士的宁转移率较低的溶剂，从而确定提取溶剂。然后再用优选出的溶剂，对渗漉法、回流法和搅拌法进行比较，确定合适的提取方法。在确定了提取溶剂和提取方法的基础上，为了全面考察影响提取效果的因素，对提取方法中影响提取效果的主要因素进行考察，对提取的条件进行优选，确定提取工艺的最佳条件。
实验例1:提取工艺技术条件的研究
本实验中，对提取溶剂、提取方法、提取时间、提取次数、提取体积的考察方法与同日提交的马钱子碱的提取工艺考核方法相同，实验结果相同。可参考另一份文件。
实验例2 :马钱子总碱分离纯化工艺条件研究
2.1提取液pH值对马钱子总碱的影响
取粉碎后的马钱子100g，加入10倍量I %盐酸加热回流2次，每次1. 5小时将药液过滤，滤液分四份加氢氧化钠调至不同的PH，浓缩干燥。测定其中马钱子碱和士的宁的量。实验结果见表I。
表I提取液pH对马钱子总碱的分离情况
权利要求
1.马钱子总碱的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤如下 (1)酸水提取-有机溶剂萃取法取马钱子粉碎成粗粉，加酸液提取，合并提取液，过滤，滤液调整PH值至10-11，碱化后的溶液用有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶齐U，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品； (2)溶剂-分步萃取法步骤(I)中得到的马钱子总碱粗品加溶剂溶解提取，提取液过滤，滤液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱。
2.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)中的酸液是指0.5mol/L-5mol/L 的盐酸、0. 5mol/L_2mol/L 的硫酸、0. 5mol/L_5mol/L 盐酸乙醇溶液、0.5mol/L_2mol/L硫酸乙醇溶液中的一种。
3.根据权利要求2所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)中的酸液是指Imo I/L的盐酸。
4.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)中酸液用量为5-12倍量，加热回流次数为1-3次，每次0. 5-2小时。
5.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中提取马钱子总碱粗品的溶剂是指甲醇、水、碱水溶液中的一种。
6.根据权利要求5所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中提取马钱子总碱粗品的溶剂是指碱水溶液。
7.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中乙酸乙酯的用量为0. 5-3倍量；萃取次数为2-6次。
8.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)的酸水提取-有机溶剂萃取法用醇提取-有机溶剂萃取法代替，具体是指取马钱子粉碎成粗粉，加乙醇回流提取，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，调整PH值至10-11，碱化后的溶液用有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品。
9.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(I)的酸水提取-有机溶剂萃取法用碱化-有机溶剂萃取法代替，具体是指取马钱子粉碎成粗粉，加碱液提取，合并提取液，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并萃取液，减压回收有机溶剂，并继续减压干燥，粉碎，即得马钱子总碱粗品。
10.根据权利要求1或8或9所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的有机溶剂是指甲苯、氯仿、乙酸乙酯中的一种。
11.根据权利要求9所述的提取分离纯化方法，其特征在于，所述的碱液是指氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、稀氨水溶液中的一种。
12.根据权利要求1所述的提取分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)的溶剂-分步萃取法用硫酸盐-盐酸盐分步结晶法代替，具体是指步骤⑴中得到的马钱子总碱粗品加硫酸盐，使士的宁形成结晶，滤除部分士的宁的母液加入盐酸形成马钱子碱盐酸盐，通过重结晶法纯化得到马钱子碱。
13.根据权利要求1或8或9或12所述的提取分离纯化方法，其特征在于，制得的马钱子总碱中的马钱子碱含量> 80*%。
14.根据权利要求1或8或9或12所述的一种马钱子总碱的提取分离纯化方法，其特征在于，将所制得的马钱子总碱加入适量辅料按常规工艺制成药剂学上可接受的制剂。
全文摘要
本发明公开了一种马钱子总碱的提取分离纯化方法，属于药品的技术领域。该方法包括将马钱子粗粉经酸水提取-有机溶剂萃取法或碱化-有机溶剂萃取法或醇提取-有机溶剂萃取法处理后得到其粗品，粗品进一步经过溶剂-分步萃取法或硫酸盐-盐酸盐分步结晶法等纯化步骤去除士的宁，制备得到纯度在80％以上的马钱子碱。
文档编号A61P29/00GK103027947SQ201110297528
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者张保献, 胡杰 申请人:北京因科瑞斯医药科技有限公司