专利名称：两种含不同CpG序列PCV2-ORF2基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因疫苗使用的佐剂和其制备方法，具体是两种含有14个CpG-ODN重复基序及18个CpG-ODN重复基序的PCV20RF2基因核酸疫苗。
背景技术：
基因疫苗(gene vaccine)是近年来随着基因治疗而发展起来的第三代疫苗。它是将编码某一特定保护性抗原蛋白的外源基因与真核表达载体进行重组后，直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达出抗原蛋白质引起机体的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与常规疫苗相比，基因疫苗具有如下优点免疫效果好；不散毒，无污染； 保护性免疫持续时间长；方法简便、价格低廉；核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能；便于贮藏和运输；不受个体已有的免疫反应(如母源抗体)的影响。猪圆环病毒是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型PCV-1与PCV-2。PCV-2含有两个主要阅读框ORFl和0FR2。其中0RF2为702bp， 编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。在核酸疫苗的免疫应答过程中，高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫水平，增强抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG-ODN (CpG寡聚脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序列已被证实能作为疫苗的高效免疫增强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。近来大量免疫学研究证实含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果(1)诱导B细胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2) 抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK) 细胞的裂解活性和干扰素(IFN-Y)分泌。但CpG-ODN具有种属特异性，本发明中的CpG-ODN 都是经过实验证实对猪具有免疫增强作用的序列。
图1 :PCV2的0RF2基因的PCR扩增产物，其中条带1为DNA标准DL 2000,条带2、 3、4、7、9为阳性PCR产物(0RF2)，条带5、6、8为阴性PCR产物。图2 重组质粒pVAXl-0RF2的PCR鉴定，其中条带1为DNA标准DL 2000，条带2_5 为从pVAXl-0RF2上PCR扩增出的0RF2片段，条带6为阳性对照(从PCV2病毒DNA上扩增出的0RF2片段)。图3 免疫荧光检测结果，其中图A为pVAXl-0RF2-CpG(14CpG)转染组间接免疫荧光检测结果(IOOx放大)，图B为pVAXl-0RF2转染组间接免疫荧光检测结果(IOOx放大)， 图C为pVAXl空载体转染组间接免疫荧光检测结果(100倍放大)。图4 仔猪平均日增重记录结果图5 猪体温检测结果图
图6 猪外周血抗体水平检测结果图7 病理组织切片图，其中，左侧一列(A组)为PBS组，中间一列(B组)为空载体组，右侧一列(C组)为疫苗(14CpG)注射组。图8 攻毒后组织病理变化。
发明内容
本发明的第一个目的足提供两种新的供猪免疫疫苗使用的CpG-ODN基序，可使 DNA疫苗产生更有效的免疫反应。本发明的第二个目的是提供本发明核酸疫苗的制备方法。本发明CpG-ODN作为免疫增强剂的优越性制备方法简单，易于保存和运输；质量易于控制，易规模化生产，成本低廉，易于保存和运输；安全性好。细胞因子是机体内本身存在的免疫调节分子，对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调节网络的控制；易于构建和改造，利用分子生物学技术在基因水平可实现人们所期望的免疫应答强度和类型。
具体实施例方式本发明的佐剂的制备方法详述如下(1)人工合成不同的CpG-ODN基序14 个 CpG-ODN 重复基序
GTCGTTTAACGTTTGACGTTTCGTCGTTTTAACGTTTTGACGTTTCAACGTTTGACGTTTCAACGTTTTGAC GTTTCAACGTTTGACGTTTCAACGTTTTGACGTT (SEQ ID NO :1)18 个 CpG-ODN 重复基序
AACGTCAAACGTTAAAACGACGAAACGTCAAACGTAAAGACGAAAACGTCAAAACGTTAAAACGACGAAAC GTCAAACGTAAAGACGAAAACGTCAAAACGTTAAAACGACGAAACGTCAAACGTTAAACGACGA (SEQ IDNO 2)利用引物ORFk、0RF2r扩增出PCV2SD1株的完整0RF2基因，序列如下ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTC CGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCT CTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAGAACGCCCTTCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCA ATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAG GTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGA TGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCTGCCATACCATAACCC AGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAAC AACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGA AAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACC CCCCACTTAACCCTAAGTGA(SEQ ID NO 3)(2)采用基因工程重组技术，选择合适的含酶切位点，将目的基因和CpG-ODN序列克隆入真核细胞表达载体PVAXl ；
4
(3)用步骤( 所得的重组质粒载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测序鉴定后，再进行扩增培养；(4)大量提取和纯化目的基因的重组质粒DNA。(5)免疫原性的检测实施例1. PCR扩增0RF2基因根据PCV2SD1 株(Gene bank accession number :DQ346683)全序列设计如下 PCR 引物。引物序列为 0RF2s :5，-ATCgCTAgCgCCgCCACCATgACgTATCCAA-3‘ ；0RF2r :5，-gCCgCg AAgCnTCgCTTAgggTTAAgT-3',为便于克隆，在上游引物和下游引物中分别添加了 Nhe I酶切位点和Hind III酶切位点。PCR反应体系如下10XPCR buffer 5 μ 1 ；dNTP Mixture 4 μ 1 ；P5s 2 μ 1 ；P5r 2 μ 1 ；模板 2 μ 1 ;Ex Taq E 0. 5 μ 1 ；用 ddH20 补至 50 μ 1。PCR 扩增条件为预变性95°C 5min，变性94°C lmin，，退火55°C Imin，延伸72 °C Imin，35个循环后， 72°C 延 IOmin。PCR产物经8 %的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，表明扩增出了与0RF2相应的7(^bp的特异片段，与预期结果相符。 实施例2. pVAXl-0RF2载体的构建用限制性内切酶Hind 111/Nhe I消化PCR纯化产物和pVAXl，分别获得0RF2基因片段和线性载体PVAX1，将产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，按照上海生工胶回收试剂盒说明书进行。连接、转化、挑菌、提质粒、用限制性内切酶Hind III/Nhe I和测序鉴定。以待鉴定重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经8g/L的琼脂糖凝胶电泳分析， 结果如图2所示，表明扩增出了与0RF2相应的7(^bp的特异片段，与预期结果相符。将PCR阳性质粒送上海生工生物有限公司进行测序鉴定，测序结果与0RF2序列相符。如下所示(黑体字部分为0RF2序列)
ATGGCTGCGCGCACC ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCG CAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCG CTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAG CGAACCACAGTCAGAACGCCCTTCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTC TTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGG TTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTG CTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAAC TACTCCTCCTGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACC TGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGA CTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACG ACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCC CCACTTAACCCTAAGTGAAAGCTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACT AGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGCCCGTTTAAACCCGCT GATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCCAGCCCATCTGTTTGTTTGC实施例3. CpG-ODN的设计及合成
由上海生工生物工程有限公司合成不同的CpG-ODN基序14 个 CpG-ODN 重复基序
gtcgtttaacgtttgacgtttcgtcgttttaacgttttgacgtttcaacgtttgacgtttcaacgttttgac gtttcaacgtttgacgtttcaacgttttgacgtt18 个 CpG-ODN 重复基序
aacgtcaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgtaaagacgaaaacgtcaaaacgttaaaacgacgaaac gtcaaacgtaaagacgaaaacgtcaaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgttaaacgacga用Mlu I分别单酶切重组质粒PVAX1-0RF2和人工合成的CpG序列，取酶切产物分别在8g/L和20g/L的琼脂糖凝胶上进电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。回收片断用 DNA连接试剂盒(DNA Ligation KitVer. 2. 0)进行连接，转化DH5a感受态细胞。将Mlu I酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物有限公司测序鉴定，测序结果与人工合成的 CpG序列相符，如下所示(黑体字部分为CpG序列)14个CpG-ODN重复基序测序结果
TGTACGGGCCAGATATACGCGTT'Gtcgtttaacgtttgacgtttcgtcgttttaacgttttgacgtttcaacg TTTGACGTTTCAACGTTTTGACGTTTCAACGTTTGACGTTTCAACGTTTTGACGTT CACGCGTTGACATTGA 18个CpG-ODN重复基序测序结果
TGTACGGGCCAGATATACGCGTaacgtcaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgtaaagacgaaaacgtc
aaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaacgtaaagacgaaaacgtcaaaacgttaaaacgacgaaacgtcaaac GTTAAACGACGA ACGCGTTGACATTGA实施例4.重组质粒的纯化和转染细胞按常规方法提取质粒，按!Iomega试剂盒使用说明书进行纯化。使用 Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒Gnvitrogen公司)转染正常生长的H(15细胞。实施例5.目的蛋白的表达检测将质粒和消化的H(15细胞一起转染，5% CO2、37°C培养三天后，取出玻片，用PBS 液冲洗三次，100%冷丙酮固定15 30min，再用PBS液洗涤三次；用含有5% BSA封闭2h， 冲洗三次，每次5min ；加入一抗(猪抗PCV2血清)，37°C作用池后，冲洗3次；加入二抗 (异硫氰荧光素标记的山羊抗猪IgG)，室温避光作用lh，冲洗3次；吸干，滴加50%甘油水溶液，倒置于载玻片上，荧光显微镜下观察。结果如图3所示，在转染了 pVAXl-0RF2-CpG 质粒和pVAXl-0RF2质粒的细胞培养孔中都观察到了荧光，说明有目的蛋白表达，在转染了 PVAXl空载体质粒的阴性对照组中未观察到荧光。实施例6.疫苗免疫试验及攻毒保护性试验(1)试验设计40头3周龄的仔猪，随机分成8组，每组5头，各组饲养管理条件相同。用紫外分光光度计测量所提取的含有14CpG和ISCpG的质粒浓度，调整为200μ g/ml，400y g/ml， 800 μ g/ml，耳背部肌肉注射核酸疫苗。正常对照组注射Iml PBS，空载体组注射Iml pVAXl。 于第1、14天进行疫苗免疫，于58天攻毒进行攻毒保护试验，攻毒用的PCV2SD1株病毒液为106_2TCID5(1/ml，每头猪颈部肌肉注射1ml，于77天时将剩余试验猪全部剖杀。按下表对各组进行免疫注射。表1. 1免疫接种动物试验分组情况
权利要求
1.一种含CpG重复基序的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于由PCV2SD1株的完整0RF2 和CpG-ODN重复基序插入哺乳动物真核表达载体pVAXl获得，其中所述的CpG-ODN重复基序为HCpG-ODN重复基序或18CpG-0DN重复基序。
2.如权利要求1所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的14CpG_0DN重复基序的序列如SEQ ID NO 1所示。
3.如权利要求1所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的18CpG_0DN重复基序的序列如SEQ ID NO 2所示。
4.如权利要求1-3所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的PCV2SD1株的完整 0RF2的序列如SEQ ID NO 3所示。
5.如权利要求1所述的PCV20RF2基因疫苗，其特征在于所述的PCV2SD1株的完整0RF2 是使用如下引物扩增获得0RF2s :5’ -ATCgCTAgCgCCgCCACCATgACgTATCCAA-3’0RF2r :5， -gCCgCgAAgCTTTCgCTTAgggTTAAg T-3，。
6.权利要求1-5所述基因疫苗的制备方法，其包括如下步骤(1)人工合成扩增PCV2SD1株完整0RF2的引物，在扩增0RF2的引物中引入了Hind III、Nhe I酶切位点，以PCV2SD1株的DNA为模板，应用PCR技术扩增0RF2全基因；(2)通过酶切，将0RF2基因插入pVAXl相应的多克隆位点中，产生pVAXl_0RF2重组质粒，并进行酶切和PCR鉴定；(3)人工合成HCpG-ODN重复基序和18CpG-0DN重复基序；(4)将HCpG-ODN重复基序或18CpG-0DN重复基序通过MluI单酶切，连接到已构建好的真核表达载体PVAX1-0RF2的骨架结构中，构建CpG-pVAXl-0RF2重组质粒。
7.—种能够增强疫苗免疫效果的含CpG基序的寡核苷酸，其特征在于所述寡核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 所示。
8.权利要求7所述的含CpG基序的寡核苷酸在增强核酸疫苗免疫效果中的应用。
全文摘要
本发明为两种含有14个CpG-ODN重复基序及18个CpG-ODN重复基序和表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核酸疫苗。本发明是为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)基因免疫的效果，构建含14个及18个CpG基序和PCV2-ORF2的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF2。经酶切鉴定和序列测定，将重组质粒转染PK-15细胞，经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF2可表达PCV2Cap蛋白。该核酸疫苗中插入了具有免疫增强作用的CpG-ODN重复基序，可增强核酸疫苗的免疫效果，该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生Cap蛋白，使机体不断产生抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PCV2的防控中具有广阔的应用前景。
文档编号A61K39/39GK102335440SQ20111030121
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者丛晓燕, 吴家强, 徐绍建, 时建立, 李俊, 王金宝, 程凯慧 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所