专利名称：一种纳米颗粒药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域，具体地，涉及一种纳米颗粒药物组合物的制备方法和该制备方法得到的纳米颗粒药物组合物。
背景技术：
纳米颗粒药物组合物是指药物与纳米载体形成的粒径介于1-1OOOnm的颗粒药物组合物。纳米颗粒药物组合物与其它药物组合物相比，具有显著优势(I)超微小体积，可通过人体最小的毛细血管，不易被吞噬细胞迅速清除，延长了在循环系统中的存留时间；[2]到达网状内皮系统分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等靶部位；(3)能穿透组织间隙并被细胞吸收，有利于透皮吸收和细胞内药效发挥；(4)提高药物的生物利用度和降低毒副作用等。
例如，现有的一种纳米颗粒药物组合物的制备方法是使用丙烯酰胺聚合物将药物包封后 得到的，该制备方法得到的纳米颗粒药物组合物的药物释放难以得到控制，并且该纳米颗粒药物组合物的体内定位难以观测。发明内容
本发明的目的是克服纳米颗粒药物组合物的药物释放难以得到控制并且体内定位难以观测的缺陷，提供一种可以通过pH值和温度控制药物释放并且可以通过荧光成像观测体内定位的纳米颗粒药物组合物及其制备方法。
本发明提供了一种纳米颗粒药物组合物的制备方法，该方法包括在水中，将水溶性药物、载体蛋白介导合成的金纳米簇与亲水性聚合物接触，得到接触后的产物，并且离心分离出所述接触后的产物中的固形物；所述接触的条件使得所述亲水性聚合物能够包封所述水溶性药物和所述载体蛋白介导合成的金纳米簇，形成粒径为100-300nm的纳米颗粒； 所述亲水性聚合物中，丙烯酸结构单元和N-异丙基丙烯酰胺结构单元的总含量至少为90 重量％。
本发明还提供了上述方法制备得到的纳米颗粒药物组合物。
通过本发明提供的制备方法得到的纳米颗粒药物组合物可以通过pH值和温度控制药物释放并且可以通过荧光成像观测体内定位。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
图1A表示实施例1得到的纳米颗粒药物组合物的荧光激发和发射光谱。图1B表示实施例1得到的纳米颗粒药物组合物在365nm紫外光照射下的突光图像。图1C表示实施例I中经过透析的聚合产物在365nm紫外光照射下的图像。
图2表示实施例1得到的纳米颗粒药物组合物透射电镜图。
图3表示实施例1得到的纳米颗粒药物组合物的粒径分布。
图4表示实施例1得到的纳米颗粒药物组合物均的平均粒径-温度变化图实。
图5表示实施例1得到的纳米颗粒药物组合物的平均粒径-pH值变化图。
图6表示实施例1得到的纳米颗粒药物组合物的5-氟尿嘧啶释放曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“溶液”的范围并不限于分散质的粒子直径小于Inm的分散系(真溶液)，而是泛指均一的液态混合物，可以包括胶状分散体(胶体溶液)。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，气体和液体的体积数值均为标准状态下的数值。
本发明提供了一种纳米颗粒药物组合物的制备方法，该方法包括在水中，将水溶性药物、载体蛋白介导合成的金纳米簇与亲水性聚合物接触，得到接触后的产物，并且离心分离出所述接触后的产物中的固形物；所述接触的条件使得所述亲水性聚合物能够包封所述水溶性药物和所述载体蛋白介导合成的金纳米簇，形成粒径为100-300nm的纳米颗粒； 所述亲水性聚合物中，丙烯酸结构单元和N-异丙基丙烯酰胺结构单元的总含量至少为90 重量％。
根据本发明的制备方法，其中，优选情况下，相对于每毫克的所述水溶性药物，以载体蛋白计，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的用量为O. 5-2mg,以固体的量计，所述亲水性聚合物的用量为30-3000mg。
根据本发明的制备方法，其中，所述接触的条件使得所述亲水性聚合物只要能够包封所述水溶性药物和所述载体蛋白介导合成的金纳米簇即可，优选情况下，所述接触的条件包括温度为1-10°C，进一步优选为2-7°C;时间为10-80小时，进一步优选为30-60小时。
本发明中，所述离心的条件可以是常规的选择，例如，所述离心的条件包括速度为20000-40000X g，温 度为2-10°C，时间为30_100min。离心后，下层的沉降物即为所述产物中的固形物。所述产物中的固形物即可作为所述纳米颗粒药物组合物。
根据本发明的制备方法，其中，所述水溶性药物的选择没有特别的限制，例如可以选择室温下在水中溶解度大于5mg/ml的药物；优选情况下，为5-氟尿嘧啶、阿霉素、米托蒽醌、柔红霉素和表柔比星等水溶性抗肿瘤药物中的至少一种；进一步优选情况下，所述水溶性药物为5-氟尿嘧啶。
根据本发明的制备方法，其中，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇中，相对于每毫克的载体蛋白，金纳米簇的含量可以为O. 00004-0. 0004mmolo
根据本发明的制备方法，其中，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的选择及其制备方法可以为本领域公知的选择和制备方法，例如文献(袁媛等，牛血清载体蛋白介导合成的金纳米簇用于活细胞荧光成像，高等学校化学学报，2010，31 (11) ,2167-2172)中所述的方法，优选情况下，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的制备方法包括在碱和水存在下，将载体蛋白和氯金酸在30-40°C下混合后温育15-30小时。
其中，所述载体蛋白可以为人血清白蛋白、牛血清白蛋白和去铁铁蛋白中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，为了进一步提高成像的效果和可控释放的效果， 优选情况下，在所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的制备方法中，相对于每毫克的载体蛋白，氯金酸的用量为O. 00004-0. 0004mmol,碱的用量为O. 0004-0. 004mmol,水的用量为 O. 01-0.1ml ;所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
其中，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇可以为该制备方法得到的产品，具体地， 指该方法得到的经过或未经过透析的完成所述温育后的液体。
所述透析是指将所述完成所述温育后的液体置于用透析膜隔离的透析囊中，并且使含有所述完成所述温育后的液体的透析囊浸没或部分浸没于透析液中。所述透析膜可以为能够截留分子量12000以上物质的透析膜，例如购自北京拜耳迪生物技术有限公司的货号为16051-01的产品。所述透析液是指渗透压低于所述完成所述温育后的液体的液体， 例如去离子水。其中，相对于每毫升的所述完成所述温育后的液体，所述透析膜的用量为 5-20cm2，所述透析液的用量为lOO-lOOOml，进行透析的时间可以为1_15天。
根据本发明的制备方法，其中，为了进一步提高成像的效果和可控释放的效果，优选情况下，所述亲水性聚合物的分子量为12000-60000Da，所述亲水性聚合物中，丙烯酸结构单元和N-异丙基丙烯酰胺结构单元的重量比为1: 3-14。其中，所述亲水性聚合物的分子量是指重均分子量，其数值是以超速离心沉降速度法测定得到的数值。
根据本发明的制备方法，其中，所述亲水性聚合物制备方法可以包括在惰性气体保护下，将含有丙烯酸和N-异丙基丙烯酰胺的单体与引发剂在水溶液聚合条件下接触，得到聚合产物；所述单体中，丙烯酸和N-异丙基丙烯酰胺的总含量至少为90重量％。
其中，所述惰性气体可以为氮气。其中，丙烯酸和N-异丙基丙烯酰胺的重量比可以为1: 3-14。其中，丙烯酸和所述引发剂的重量比可以为1: 0.3-2。其中，所述引发剂可以为过硫酸钾、过硫酸铵和偶氮二异丁腈中的至少一种。其中，所述水溶液聚合条件可以包括单体总浓度为0. 5-2重量％ ;温度为65-75°C，时间为7_10小时。其中，所述聚合产物可以为所述水溶液聚合条件下完成接触后的液相产物，也可以是该液相产物经离心后分离得到的下层沉降物。
其中，为了达到提高交联的效果，优选情况下，所述单体可以进一步含有N， N'-亚甲基双丙烯酰胺。其中，丙烯酸和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的重量比可以为 1 0. 7-2. 4。
其中，所述亲水性聚合物可以是由上述制备方法得到的产品，具体地，指该方法得到的经过或未经过透析的聚合产物。
所述透析是指将所述聚合产物置于用透析膜隔离的透析囊中，并且使含有所述聚合产物的透析囊浸没或部分浸没于透析液中。所述透析膜可以为能够截留分子量12000以上物质的透析膜，例如购自北京拜耳迪生物技术有限公司的货号为16051-01的产品。所述透析液是指渗透压低于所述聚合产物的液体，例如去离子水。其中，相对于每克所述聚合产物，所述透析膜的用量为5-20cm2,所述透析液的用量为100-1000ml,进行所述透析的时间为1-15天。
本发明还提供了上述方法制备得到的纳米颗粒药物组合物。
根据本发明特别优选的一种实施方式，本发明提供的纳米颗粒药物组合物的制备方法包括如下步骤
(I)在碱和水存在下，将载体蛋白和氯金酸在30_40°C下混合后温育15-30小时； 并且任选地，透析分离得到完成所述温育后的液体中分子量大于12000的组分；
相对于每毫克的载体蛋白，氯金酸的用量为O. 00004-0. 0004mmol，碱的用量为 O. 0004-0. 004mmol,水的用量为O. 01-0.1ml ;所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾；
(2)在惰性气体保护下，将含有丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺和可选的N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的单体与引发剂在水溶液聚合条件下接触，得到聚合产物；并且任选地，透析分离得到所述聚合产物中分子量大于12000的组分；
所述单体中，丙烯酸和N-异丙基丙烯酰胺的总含量至少为90重量％ ；
优选地，相对于I 重量份的丙烯酸，N-异丙基丙烯酰胺的用量为3-14重量份，N, N'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为O. 7-2. 4重量份，所述引发剂的用量为O. 3-2重量份，所述引发剂可以为过硫酸钾、过硫酸铵和偶氮二异丁腈中的至少一种，单体总浓度为O. 5-2 重量％，温度为65-75°C，时间为7-10小时；
(3)在水中，将水溶性药物、载体蛋白介导合成的金纳米簇与亲水性聚合物接触， 得到接触后的产物，并且离心分离出所述接触后的产物中的固形物；
所述载体蛋白介导合成的金纳米簇为步骤(I)得到的所述完成所述温育后的液体和/或所述完成所述温育后的液体中分子量大于12000的组分；所述亲水性聚合物为步骤(2)得到的聚合产物和/或所述聚合产物中分子量大于12000的组分；
相对于每毫克的所述水溶性药物，以载体蛋白计，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的用量为O. 5-2mg,以固体的量计，所述亲水性聚合物的用量为30-3000mg ;所述接触的条件包括温度为1-10°C，进一步优选为2-7°C;时间为10-80小时，进一步优选为30-60 小时；
所述离心的条件包括速度为20000-40000 X g，温度为2_10 V，时间为 30_100mino
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的制备方法以及通过本发明提供的纳米颗粒药物组合物。
(I)将ImL氯金酸水溶液(10mmol/L，37°C )、5mL牛血清白蛋白(BSA)溶液(50mg/ mL, 37°C )和O.1mL浓度为lmol/L的NaOH溶液混合均匀后置于37°C摇床温育24h后，得到完成所述温育后的液体。
(2)称取O. 1833g的N-异丙基丙烯酰胺、O. 02703g过硫酸钾、O. 0308g的N， N'-亚甲基双丙烯酰胺和O. 0129g的丙烯酸于IOOml三口烧瓶中，在氮气保护下用25ml 三次蒸馏水搅拌溶解后升温至70°C，保持9小时，得到液相产物。将所得液相产物在 40000Xg、7°C条件下离心I小时后分离得到的下层沉降物。将所述下层沉降物置于用透析膜(能够截留分子量12000以上物质的透析膜，购自北京拜耳迪生物技术有限公司的货号为16051-01的产品)隔离的透析囊中，并且使含有所述下层沉降物的透析囊浸没于去离子水中。相对于每克所述聚合产物，所述透析膜的用量为5cm2，去离子水的用量为100ml，进行所述透析的时间为7天，得到经过透析的聚合产物。经过超速离心沉降速度法测得该聚合产物中亲水性聚合物的重均分子量为52000Da。
(3)取20mg的步骤(I)得到的完成所述温育后的液体(以牛血清白蛋白的量计)、 IOmg的5-氟尿喃唳与300mg的步骤(2)得到的经过透析的聚合产物(以固体的量计)加入到IOml三次蒸馏水中，混合均匀后放入4°C冰箱中孵育48小时，得到接触后的产物，将接触后的产物在40000Xg、7°C条件下离心I小时后分离出所述接触后的产物中的固形物。
该固形物即为通过本发明提供的制备方法制备得到的纳米颗粒药物组合物。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的制备方法以及通过本发明提供的纳米颗粒药物组合物，并且通过以下步骤完成
(I)将 5mL 氯金酸水溶液(10mmol/L, 37 °C )、5mL BSA 溶液(50mg/mL, 37 °C )和 0. 5mL lmol/L NaOH溶液混合均匀后置于37°C摇床温育24h后，得到完成所述温育后的液体。
(2)称取O. 1611g的N-异丙基丙烯酰胺、0.02703g过硫酸钾、0.0308g的N， N'-亚甲基双丙烯酰胺和O. 0257g的丙烯酸于IOOml三口烧瓶中，在氮气保护下用25ml 三次蒸馏水搅拌溶解后升温至70°C，保持9小时，得到液相产物。将所得液相产物在 40000Xg、7°C条件下离心I小时后分离得到的下层沉降物。将所述下层沉降物置于用透析膜(能够截留分子量12000以上物质的透析膜，例如购自北京拜耳迪生物技术有限公司的货号为16051-01的产品)隔离的透析囊中，并且使含有所述下层沉降物的透析囊浸没于去离子水中。相对于每克所述聚合产物，所述透析膜的用量为20cm2，去离子水的用量为 1000ml，进行所述透析的时间为7天，得到经过透析的聚合产物。经过超速离心沉降速度法测得该聚合产物中亲水性聚合物的重均分子量为52000Da。
(3)取2mg的步骤(I)得到的完成所述温育后的液体(以牛血清白蛋白的量计)、 2mg的5-氟尿喃唳与300mg的步骤(2)得到的经过透析的聚合产物(以固体的量计)加入到IOml三次蒸馏水中，混合均匀后放入4°C冰箱中孵育48小时，得到接触后的产物，将接触后的产物在40000Xg、7°C条件下离心I小时后分离出所述接触后的产物中的固形物。
该固形物即为通过本发明提供的制备方法制备得到的纳米颗粒药物组合物。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的制备方法以及通过本发明提供的纳米颗粒药物组合物，并且通过以下步骤完成
(I)将 IOmL 氯金酸水溶液(10mmol/L，37°C )、5mL BSA 溶液(50mg/mL, 37°C )和 ImL lmol/L NaOH溶液混合均匀后置于37°C摇床温育24h后，得到完成所述温育后的液体。
(2)称取0. 1358g的N-异丙基丙烯酰胺、0.01352g过硫酸钾、0.0308g的N， N'-亚甲基双丙烯酰胺和0.0432g的丙烯酸于IOOml三口烧瓶中，在氮气保护下用25ml 三次蒸馏水搅拌溶解后升温至70°C，保持9小时，得到液相产物。将所得液相产物在 40000Xg、7°C条件下离心I小时后分离得到的下层沉降物。将所述下层沉降物置于用透析膜(能够截留分子量12000以上物质的透析膜，例如购自北京拜耳迪生物技术有限公司的货号为16051-01的产品)隔离的透析囊中，并且使含有所述下层沉降物的透析囊浸没于去离子水中。相对于每克所述聚合产物，所述透析膜的用量为IOcm2，去离子水的用量为500ml，进行所述透析的时间为7天，得到经过透析的聚合产物。
经过超速离心沉降速度法测得该聚合产物中亲水性聚合物的重均分子量为 52000Da。
(3)取0.05mg的步骤(I)得到的完成所述温育后的液体(以牛血清白蛋白的量计)、0· Img的5-氟尿喃唳与300mg的步骤(2)得到的经过透析的聚合产物(以固体的量计)加入到IOml三次蒸馏水中，混合均匀后放入4°C冰箱中孵育48小时，得到接触后的产物，将接触后的产物在40000Xg、7°C条件下离心I小时后分离出所述接触后的产物中的固形物。
该固形物即为通过本发明提供的制备方法制备得到的纳米颗粒药物组合物。
测试实施例1
将实施例1-3得到的纳米颗粒药物组合物分别按如下方法进行荧光激发和发射光谱测试、显微形态观察、粒径分布测试和药物可控释放的测试
通过Pekin Elmer Instruments (Shanghai) Co. Ltd 公司 LS-55 型的突光 / 憐光 / 发光分光光度计，测得实施例1得到的纳米颗粒药物组合物如图1A所示的荧光激发和发射光谱。并且实施例1得到的纳米颗粒药物组合物在365nm紫外光照射下具有如图1B所示的荧光图像。
通过透射电镜(美国FEI，Tecnai G220S-TWIN，200kV)观察实施例1得到的纳米颗粒药物组合物，可见实施例1得到的纳米颗粒药物组合物如图2所示的显微形态，其粒径为200nm左右。
通过激光粒度仪对实施例1得到的纳米颗粒药物组合物进行动态光散射 (Zetasizer NanoZS)测定,测得实施例1得到的纳米颗粒药物组合物具有如图3所示的粒径分布，其平均粒径为221nm，分散系数为O. 102。
分别在20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C和 5(TC下(分别通过从 20°C加热至 50°C以及从50° C冷却至20°C实现所述温度梯度)，通过激光粒度仪测定实施例1得到的纳米颗粒药物组合物的平均粒径，可见实施例1得到的纳米颗粒药物组合物具有如图4所示的平均粒径-温度变化图。实施例1得到的纳米颗粒药物组合物具有随温度升高，粒径变小的温度敏感特性。
分别在pH值为3、5、7和9的条件下，通过激光粒度仪测定实施例1得到的纳米颗粒药物组合物的平均粒径，可见实施例1得到的纳米颗粒药物组合物具有如图5所示的平均粒径-pH值变化图。从该可以看出实施例1得到的纳米颗粒药物组合物显示了 pH敏感特性。在pH从3变化到7. 6的过程中，粒径逐渐变大；在pH从7. 6变化到9的过程中，粒径逐渐变小。
分别在(l)25°C，pH值为7. 4的情况下，(2)37°C，pH值为7. 4的情况下，(3)37。。， PH值为5.3的情况下，按照文献(陈琼等，5-氟尿嘧啶脂质体的制备与评价，中华医药杂志，2006年第6卷第9期976-978页)中的方法，测定实施例1得到的纳米颗粒药物组合物的5-氟尿嘧啶的释放曲线，可见实施例1得到的纳米颗粒药物组合物具有如图6所示的 5-氟尿嘧啶的释放曲线。
对实施例2和3得到的纳米颗粒药物组合物进行如上相同的测试，得到与如上基本相同的检测结果，本发明在此不再赘述。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
权利要求
1.一种纳米颗粒药物组合物的制备方法，该方法包括在水中，将水溶性药物、载体蛋白介导合成的金纳米簇与亲水性聚合物接触，得到接触后的产物，并且离心分离出所述接触后的产物中的固形物；所述接触的条件使得所述亲水性聚合物能够包封所述水溶性药物和所述载体蛋白介导合成的金纳米簇，形成粒径为100-300nm的纳米颗粒；所述亲水性聚合物中，丙烯酸结构单元和N-异丙基丙烯酰胺结构单元的总含量至少为90重量％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，相对于每毫克的所述水溶性药物，以载体蛋白计，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的用量为O. 5-2mg，所述亲水性聚合物的用量为30-3000mgo
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述接触的条件包括温度为1-10°C，时间为10-80小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述接触的条件包括温度为2-7°C，时间为30-60小时。
5.根据权利要求1、2或4所述的制备方法，其中，所述水溶性药物为5-氟尿嘧啶、阿霉素、米托蒽醌、柔红霉素和表柔比星中的至少一种。
6.根据权利要求1、2或4所述的制备方法，其中，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇中，相对于每毫克的载体蛋白，金纳米簇的含量为O. 00004-0. 0004mmolo
7.根据权利要求1、2或4所述的制备方法，其中，所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的制备方法包括在碱和水存在下，将载体蛋白和氯金酸在30-40°C下混合后温育15-30小时。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在所述载体蛋白介导合成的金纳米簇的制备方法中，相对于每毫克的载体蛋白，氯金酸的用量为O. 00004-0. 0004mmol，碱的用量为O.0004-0. 004mmol,水的用量为O. 01-0.1ml ;所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
9.根据权利要求1、2、4、6或8所述的制备方法，其中，所述亲水性聚合物的重均分子量为12000-60000Da，所述亲水性聚合物中，丙烯酸结构单元和N-异丙基丙烯酰胺结构单元的重量比为1: 3-14。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的制备方法得到的纳米颗粒药物组合物。
全文摘要
本发明提供了一种纳米颗粒药物组合物的制备方法，该方法包括在水中，将水溶性药物、载体蛋白介导合成的金纳米簇与亲水性聚合物接触，得到接触后的产物，并且离心分离出所述接触后的产物中的固形物；所述接触的条件使得所述亲水性聚合物能够包封所述水溶性药物和所述载体蛋白介导合成的金纳米簇，形成粒径为100-300nm的纳米颗粒；所述亲水性聚合物中，丙烯酸结构单元和N-异丙基丙烯酰胺结构单元的总含量至少为90重量％。本发明还提供了上述方法制备得到的纳米颗粒药物组合物。通过本发明提供的制备方法得到的纳米颗粒药物组合物可以通过pH值和温度控制药物释放并且可以通过荧光成像观测体内定位。
文档编号A61K45/00GK103006565SQ20111030129
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者聂广军, 吴雁, 苏世帅, 孙云, 王海 申请人:国家纳米科学中心