专利名称：一种c型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗及其制备方法，本发明所涉及的疫苗是C型口蹄疫疫苗及制备方法，特别是一种是C型口蹄疫亚单位基因工程疫苗及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是一种能够感染包括牛、羊、猪等主要家畜在内的多种偶蹄动物的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其病原体为口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)。FMDV属于微 RNA科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，共包括 A、C、0、AsiaI、SAT I, SAT II 及 SAT III 型 7 个血清型，各血清型之间无交叉保护力。FMDV的病毒粒子直径20-25nm，为正二十面体结构，近似圆形；基因组为全长8500 (nt)的正链RNA，包括一个开放阅读框(open reading frame，0RF)，5，-非编码区(5，-Untraslated Region, 5，-UTR)禾口 3，一非编码区(3，-Untraslated Region, 3’-UTR) ；ORF编码病毒多聚蛋白，依赖于自身编码的蛋白酶(L、2A、3C)及少数的宿主因子， 在经过3级裂解后，形成4种病毒结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VPl)和9种非结构蛋白(Lab、 Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)；四种结构蛋白各60分子构成病毒颗粒，VPl靠近由五个原粒组成病毒表面的小洞，VP2和VP3位于远端，VP4则完全位于衣壳里面。其中VPl是FMDV 最主要的结构蛋白，其上含有一个高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) (RGD)基序的G-H环(G-H Loop)，是细胞的吸附位点的主要成分，又是重要的中和位点，一般位于VPl的140-160位氨基酸残基。另外在VPl的C端还存在一个主要的连续性抗原位点οC型FMDV共有4个抗原位点，位点A位于VPl的G-H环上，位点C位于VPl的C 末端(约15个氨基酸残基)，是一个独立的连续性位点，位点D是C型FMDV的很重要的位点，是位于衣壳蛋白三重轴周围的一个不连续性位点，另外VPl的C端部分氨基酸也参与位点D的构成。位点B位于VPl的β B-C和VPl的β H-I环上。C型FMDV的抗原位点与0型 FMDV的抗原位点相比，0型FMDV的位点A与位点C共同构成位点1，而C型FMDV位点A和 C是两个独立的连续性位点。C型FMDV的VP3上包括了 B-B knob在内的多个抗原位点，并且与其他小RNA病毒一样，VP3是结构蛋白中结构最为保守的。因此，VP3也可以作为基因工程疫苗制备的基点。口蹄疫病毒各型之间抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。尽管目前国内外对口蹄疫的病原学、血清分型、诊断和疫苗等方面做了大量的研究，但是对C型口蹄疫的疫苗研究并没有很大的进展。C型FMD较其它血清型的FMD流行范围较小，但在我国周边国家都有过流行史，因此有必要对其疫苗加强研究，以作为战略储备。使用灭活疫苗仍是控制FMD的主要手段，但是其在生产、运输、使用中存在着安全问题和不便，因此开发新型疫苗是解决这些问题的有效途径
发明内容
本发明提供一 C型口蹄疫亚单位基因工程疫苗及其制备方法。本发明的C型口蹄疫亚单位疫苗的主要组成为由C型口蹄疫的结构蛋白VPl和 VP3按蛋白含量1 1构成的混合物。本发明的一个实施例中，在疫苗中还混合有206油佐，其中C型口蹄疫病毒的重组结构蛋白VPl和VP3体积之和与206油佐的体积比为1 1即VP1+VP3 (体积)/206佐剂体积=1 1 ；而C型口蹄疫病毒的结构蛋白VPl和VP3为重组蛋白。本发明的C型口蹄疫亚单位疫苗中的重组C型口蹄疫病毒的结构蛋白VPl和VP3 均为C型口蹄疫病毒基因VPl和VP3的真核表达产物，本发明的C型口蹄疫的结构蛋白VPl 和VP3优选为C型口蹄疫抗原基因VPl和VP3在中国仓鼠卵巢细胞(即胞CHO/dhfr-细胞)表达系统表达的产物。本发明的C型口蹄疫的结构蛋白VPl和VP3的制备方法是以C型口蹄疫病毒为模板，分别采用VPl引物和VP3引物进行PCR扩增，再由将PCR得到的产物分别与pCI-neo 真核表达载体连接，分别得到重组质粒pCI-VPl和pCI-VP3，再用重组质粒pCI-VPl和 PCI-VP3分别转染仓鼠卵巢细胞CHO/dhfr-细胞得到表达产物。在本发明所述的C型口蹄疫的结构蛋白基因VPl和VP3的制备方法中所用的扩增 VPl和VP3的引物分别为VPl 引物上游引物5‘ -GCGAATTCACCACGACCACTGGTGAATCT-3 ‘下游引物5'-GCCTCGAGCTGCTTCGCGGGCGCGATGAG-3‘；所用VP3引物分别是VP3 引物上游引物5'-GCGAATTCGGAATCTTTCCCGTCGCGTGC-3‘下游引物5'-GCCTCGAGTTGTTGTCTAGCGTCCACCG-3‘。本发明所述的C型口蹄疫的结构蛋白VPl和VP3的最佳制备方法是将C型口蹄疫病毒模板 lOOng，dNTP (IOmM) 5 μ 1，IOXpfu buffer 5 μ 1, pfu DNA polymerase 5U 分别和VPl和VP3的上下游引物各50pmol、补无菌的超纯水至总体积为50 μ 1，混合均勻，按以下的扩增条件扩增94°C lOmin，然后于以下条件进行30个循环94°C lmin,56°C lmin, 72°C 40s，最后72°C延伸8min ；再将得到的VPl和VP3基因片段与pCI-neo真核表达载体连接，得到重组质粒pCI-VPl和pCI-VP3 ；将pCI-VPl和pCI_VP3重组质粒分别转染中国仓鼠卵巢细胞(CHOdhfr-细胞)，筛选重组的高表达单克隆细胞株后得到表达产物。本发明的疫苗由于采用了 C型口蹄疫的结构蛋白VPl和VP3按蛋白含量1 1构成的混合物，使其有良好的免疫效果；特别是当疫苗中还混合有206油佐，且其中C型口蹄疫病毒的重组结构蛋白VPl和VP3与206油佐的体积比为1 1时其免疫效果为最佳。基因工程亚单位疫苗(Subunit Vaccine)又被称为重组亚单位疫苗或生物重组亚单位疫苗，主要是采用各种基因工程手段制备病原体亚单位成分，以此作为抗原来制备疫苗。目前使用的策略主要是使用各种表达系统(如大肠杆菌表达系统、真核表达系统、昆虫表达系统等)表达抗原的亚单位成分，以此来制备免疫原。现有技术中大肠杆菌往往是以包涵体的形式表达外源重组蛋白，这类蛋白质由于缺乏正常的折叠，不能形成类似于天然蛋白质的构象，所以，以这类重组蛋白作为抗原制备疫苗，很难取得理想的保护效果。本发明中由于采用了哺乳动物细胞进行表达，所得到的蛋白经翻译加工后，其结构与生物学特性更接近于天然蛋白，故此，由其制备的疫苗免疫原性更强。为了提高重组蛋白的免疫原性，本发明的最佳实施例中使用了中国仓鼠卵巢细胞(CHO dhfr-细胞)，与其它表达系统相比，CHO具有以下一些优点1)具有准确的翻译后折叠及修饰功能，被表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。2)具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化。幻具有重组基因的高效扩增和表达能力。4)具有贴壁生长特性，具有较高的耐受剪切力和渗透压能力。也可以进行悬浮培养，表达水平较高。OCHO属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白质，利于外源蛋白的分离。在CHO细胞表达载体中有两类选择标记。neo等是非扩增基因，这种选择标记对目的基因的拷贝数没有影响。另一类选择标记具有扩增基因的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶(dhfr)、谷氨酰胺合成酶(GQ等。当携带共扩增基因的表达载体转染CHO细胞后，随着培养基中选择性药物浓度的逐渐增加，共扩增基因的拷贝数不断增加；同时，其侧翼的DNA片段也会相应得到扩增， 使目的基因的拷贝数增加几百到几千倍，从而达到目的基因的高效表达。目前应用较多的是CHO/dhfr-表达系统，在dhfr基因与目的基因共转化的细胞中，随着培养基中MTX浓度的增加，dhfr基因与外源基因均明显扩增。本发明以C型口蹄疫病毒为模板，分别采用VPl 引物和VP3引物进行PCR扩增，再由将PCR得到的产物分别与pCI-neo真核表达载体连接， 分别得到重组质粒pCI-VPl和pCI-VP3，再用重组质粒pCI-VPl和pCI_VP3分别转染仓鼠卵巢细得到表达产物，由于pCI-neo哺乳动物表达载体携带有人类巨细胞病毒(CMV)的即刻早期增强子/启动子区域，能够产生高度的组成型表达，位于增强子/启动子区域下游的 β -globin/IgG嵌合内含子也能够进一步增加表达；此外，此载体含有一种哺乳动物细胞的选择性标志物一一新霉素磷酸转移酶基因，所以，通过G-418抗性筛选能够获得稳定转染的细胞。本发明所涉及的C型口蹄疫VPl基因序列和C型口蹄疫VPl氨基酸序列已经公开于 GenBank (accession number :EU 553893. 1)、C 型口蹄疫 VP3 基因序列和 C 型口蹄疫 VP3 氨基酸序列已经公开于GenBank(accession number :M90368. 1),还可参见基因序列表。本发明选取C型FMDV的VPl和VP3蛋白作为亚单位疫苗的研制对象是基于以下原因首先，C型FMDV的VPl其最主要的结构蛋白，其上含有一个高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) (RGD)基序的G-H环(G-HLoop)，是细胞的吸附位点的主要成分，又是重要的中和位点，一般位于VPl的140-160位氨基酸残基。另外在VPl的C端还存在一个主要的连续性抗原位点，接种动物可以产生中和抗体。其次，C型FMDV的VP3上包括了 B-B knob在内的多个抗原位点，并且与其他小RNA病毒一样，VP3是结构蛋白中结构最为保守的。因此，以C型FMDV的VPl和VP3蛋白作为亚单位疫苗可以有最佳的效果。本发明中采用的VP1引物和VP3，在以C型口蹄疫病毒模板进行扩增时可得到特异性的扩增产物，特别是当采用最佳的扩增条件，即权利要求7所的条件时，可筛选出重组的高表达单克隆细胞株，得到最佳的表达产物。用本发明给出的方法研制的疫苗不存在传统灭活疫苗灭活不彻底而造成毒力返强，从而导致口蹄疫的爆发问题；也不存在传统疫苗生产的大规模生物安全设备和设施，从而使其生产成本低于灭活疫苗；同时本发明给出的方法的真核表达系统的表达量较高，表达产物十分接近天然蛋白质，从而免疫动物能够获得较高的免疫保护力；比起原核表达系统，它不需要蛋白的复性、纯化等步骤，具有简单易行的特点；动物实验表明本发明提供的基因工程亚单位疫苗进行豚鼠和小鼠免疫时，不存在传统疫苗发热、红肿等副反应，免疫产前1周豚鼠的结果表明，接种该疫苗妊娠动物没有引起流产、早产和死胎现象，安全性显著高于传统疫苗，具有很好的应用前景。
图1. PCR扩增C型口蹄疫VPl目的基因，其中:M. DL 2000marker。图2. PCR扩增C型口蹄疫VP3目的基因，其中:M. DL 2000markero图3.双酶切和PCR鉴定VPl重组载体的结果，其中M. DL 2000marker。图 4. VP3 重组载体双酶切和 PCR 鉴定，其中M IDLlOOOOMarker, 1 EcoR I, Xho I 双酶切 PET-VP3 产物，2PCR 扩增 VP3 产物，M 2DL2000Markero图5. SDS-PAGE检测VPl蛋白结果，其中M为蛋白Marker ；泳道1 未浓缩VPl融合蛋白；泳道2:浓缩后的VPl融合蛋白。图6. SDS-PAGE检测VP3表达，其中=M 蛋白Marker ；泳道1和3 :VP3融合蛋白细胞上清；泳道2 :VP3融合蛋白全细胞；泳道4阴性对照；泳道5和6 :VP3融合蛋白细胞沉淀。图 7. VPl 蛋白 Western-blotting 分析，其中:M，蛋白 Marker ;1，VPl 融合蛋白禾口 ant i-FMDVC型血清IgG反应。2，阳性对照。图8. VP3纯化产物flfestern-blot检测，其中M蛋白质分子量标准，1纯化产物 Western-Blotting。图9. ELISA检测疫苗免疫小鼠后的抗体水平。图10. ELISA检测疫苗免疫豚鼠后的抗体水平。图11. ELISA检测疫苗免疫猪后的抗体水平。
具体实施例方式实施例1 C型口蹄疫抗原基因VPl和VP3的扩增及在中国仓鼠卵巢细胞表达系统的表达1.目的基因与质粒连接转化分别以VPl引物上游引物5'-GCGAATTCACCACGACCACTGGTGAATCT-3 ‘(下划线标记为 EcoR I 酶切位点)下游引物5'-GCCTCGAGCTGCTTCGCGGGCGCGATGAG-3‘(下划线标记为 Xho I 酶切位点)；禾口 VP3弓丨物上游引物5'-GCGAATTCGGAATCTTTCCCGTCGCGTGC-3 ‘(下划线标记为 Xho I 酶切位点)下游引物5'-GCCTCGAGTTGTTGTCTAGCGTCCACCG-3‘(下划线标记为 Xho I 酶切位点)；以C型口蹄疫病毒为模板进行扩增，其中基因组模板lOOng，dNTP (IOmM) 5 μ 1,IOXpfu buffer 5μ l,pfu DNA polymerase 5U 和 VPl 引物或 VP3 引物正反引物各 50pmol、 再补无菌的超纯水至总体积为50 μ 1，混合均勻。扩增条件94°C lOmin，然后于以下条件进行30个循环94°C lmin，56°C lmin, 72°C 40s，最后 72°C延伸 8min。扩增分别得到的VPl和VP3基因进行凝胶电泳胶并回收目标VPl和VP3片段。将上述的C型口蹄疫VPl和VP3扩增产物与pCI-neo真核表达载体连接，具体步骤为(I)VPl 或VP3 目标DNA片段 QOng)、pCI_neo真核表达载体(50ng)、T4DNA Ligase 5UU0XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，补无菌的超纯水至总体积10 μ 1。(2) 16°C连接10 12小时制备成连接好载体的基因。(3)对步骤⑵连接好的样品进行PCR检测；连接产物lul，dNTP(10mM)5y 1, IOXpfu buffer 5 μ 1, pfu DNA polymerase 5U 和正反引物各 50pmol、补无菌的超纯水至总体积为50 μ 1，混合均勻；扩增条件94°C IOmin,然后于以下条件进行30个循环 940C lmin，56°C lmin，72°C 40s，最后 72°C延伸 8min。(4)连接好的 VPl 和 VP3 重组基因 IOul，10XH buffer 2ul, EcoR I (8-20U/μ 1) 和 Xho I (8-20U/ μ 1)各 1. 5ul，ddH20 定容至 20ul。(5) 1 % TBE琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察DNA条带。2.上述的C型口蹄疫VPl和VP3重组基因质粒的表达，具体如下上述的C型口蹄疫VPl或VP3重组基因质粒分别命名为pCI_VPl和pCI_VP3，将鉴定为阳性的这两种重组质粒载体菌液20μ L分别接种至6mL LB培养基中，37°C、200rpm振摇过夜。取过夜培养物20 μ L接种于6mL LB培养基中，37°C振摇培养至0D600为0. 6-1. 0 时，加入IPTG至终浓度为0. 5mM，37°C诱导8h，SDS-PAGE观察各重组菌表达情况。具体方法是将所取菌液样12，OOOrpm离心3min，弃上清。用去离子水重悬菌体至无大的细菌块残留，12. OOOrpm离心3min，弃去上清，去离子水重悬菌体。反复冻融3次， 12，OOOrpm离心3min，吸取上清，菌体用去离子水重悬。取上清和重悬菌体各20 μ L加入 5 μ L5 X Loading Buffer，混勻后煮沸7min。蛋白质Marker同样煮沸7min。按预定顺序用微量加样器吸取待分析样品5 μ L，缓慢加入加样孔。每加完一个样品，应在电极缓冲液中彻底清洗微量加样器。加蛋白质分子量标准Marker作参照。200伏电压电泳40min左右，电泳结束后，染色和脱色，待拍照，记录结果。3 C型口蹄疫VPl或VP3在中国仓鼠卵巢细胞(CHOdhfr)表达系统表达，具体如下(1)蛋白的制备分别将pCI-VPl和pCI-VP3重组质粒分别转染CHOdhfr-细胞，利用G418加压筛选稳定的含有pCI-VPl和pCI-VP3重组载体的细胞，每天传代1次，收集细胞，-20°C。(2)未纯化蛋白检测收集反复冻融的细胞使用SDS-PAGE观察结果。(4)Western-blotting对表达的所有纯化的蛋白进行Wfestern blotting分析，具体步骤如下(1)电泳取所纯化的各种蛋白制样进行SDS-PAGE。
(2)转印将电泳完的凝胶切除浓缩胶后，去离子水清洗表面，然后在膜转移缓冲液中平衡30min。剪1块与凝胶相同大小的PVDF膜，在100%甲醇中浸泡^iin左右后与凝胶在缓冲液中平衡至30min结束。再剪取8块与所取PVDF大小相同滤纸，并在转移缓冲液中浸泡lOmin。然后在正极板上按四层滤纸、PVDF膜、凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，用玻璃棒轻轻挤压，赶走各层间气泡，确保各层完全接触后盖上负极板，120mA转移150min。(3)封闭转印结束后，取下PVDF膜，按照预先标记剪下蛋白质分子量标准Marker 所在区PVDF膜，置于氨基黑染色液中浸染2-aiiin，取出后用漂洗液(150mM NaCl, 50mM Tris-HCL,pH 7.5)脱色，直至背景兰色脱尽。其余PVDF膜用PBS冲洗，加入10_20mL封闭液，室温轻轻振摇池，或4°C过夜(配制封闭液时要保证脱脂奶粉充分溶解，以免未溶解的奶粉颗粒附着与膜上，影响实验效果)。(4)与一抗的结合封闭结束后，用PBST清洗PVDF膜3次，每次在摇床上振摇 IOmin,加入用PBST适当稀释的各检测抗体10mL，室温振摇1. 5h,用PBST冲洗3次，每次在摇床缓慢摇振IOmin。(5)与二抗的反应加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的与一抗相对应的二抗，室温下轻摇孵育lh，取出用PBST冲洗3次，每次在摇床缓慢摇振lOmin。(6)显色将PVDF膜转移到10_20mL底物溶液中，室温避光轻摇^iin观察显色情况，待出现条带时，立即转入PBS缓冲液中终止反应，室温保存待图像采集。4.实验结果(1)目的基因PCR结果应用PCR技术，扩增到了 VPl与VP3基因预期大小相同的目的DNA片段，在电泳图中可以看到一条600bp和650bp左右的两条特异性条带(附图1和 2)。(2)重组载体鉴定从琼脂糖凝胶中纯化的口蹄疫VPl和VP3基因DNA片段与 pCI-neo真核表达载体重组载体质粒经PCR和酶切鉴定，结果与预期结果相符(附图3和 4)。(3) SDS-PAGE检测复性蛋白SDS-PAGE检测，VPl和VP3融合蛋白复性及纯化成功。 复性后的VPl和VP3融合蛋白纯度均能达到90%以上(附图5和6)。(4) Western-blotting检测复性后的蛋白Western-blotting检测结果表明，复性后的VPl及VP3重组蛋白能够和相应血清呈阳性反应(附图7和8)。说明复性后的VPl和干扰素蛋白具有良好的反应原性。目标蛋白大小分别为38Ka和50kDa。实施例二 C型口蹄疫亚单位基因工程疫苗的配制；本实施中将前述得到的VPl和VP3真核表达产物与206没佐剂混合，制造疫苗(1)分别将VPl和VP3真核表达产物用灭菌水分别稀释至50 μ g/ml，水相。(2)将稀释好的VPl和VP3以蛋白含量1 1构成的混合物，再将所得的VPl和 VP3混合物与206油佐剂以体积比1 1混合，先以90 150r/m慢速转动搅拌2分钟后， 再以lOOOOr/m高速搅拌20分钟，静置5分钟，制成疫苗。(3)将所得乳剂在无菌条件下分装，得到C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗。实施例三C型口蹄疫亚单位基因工程疫苗的效力试验(包括小鼠、豚鼠、猪的免疫抗体测定；豚鼠的攻毒实验测定)实验1上述的一种C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗免疫力试验，具体如下
1. 1材料与方法1. 1. 1疫苗为按实施例2制备的C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗，命名为批号 20110305，20110320，20110401。作为对照组C型VPl 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备，命名为批号20110211 ；C型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备，命名为批号20110221 ；C型口蹄疫灭活疫苗由本实验制备，批号:20110410。。1. 1. 2试验动物和毒株体重约为20g的Balb/C成年雌性小鼠、350 450g的豚鼠购自兰州生物制品所实验动物中心，体重40kg的架子猪，购于定西猪场。C型FMDV毒株 AV104由BHK-21细胞传代并由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。1. 1. 3免疫动物(1)将Balb/C成年雌性小鼠和豚鼠随机进行分组，每组5只，猪5 只，将制备好的免疫原于0d、14d进行皮下注射，小鼠、豚鼠和猪的免疫剂量分别为100μ 1/ 只、200 μ 1/只和Iml/头。型口蹄疫灭活疫苗按上述方式进行免疫，同时设置阴性对照。以上试验动物在免疫后7d，14d，28d、35d、42d采血并进行检测。1.1.4免疫动物抗体测定1. 1. 4. 1主要试剂山羊抗小鼠IgG抗体、兔抗豚鼠IgG抗体购自Sigma公司。1. 1. 4. 2间接ELISA检测血清样本中的抗C型FMDV抗体水平间接ELISA检测血清样本中的抗C型FMDV抗体水平，具体步骤如下(1)抗原包被用ELISA包被缓冲液将C型FMDV细胞毒灭活抗原进行1 2稀释， 然后每孔50 μ L加入ELISA微量反应板中，4°C过夜。(2)封闭将包被抗原的ELISA反应板取出，弃去孔中液体后，用洗涤缓冲洗涤反应板3次，拍干。然后加入封闭液，每孔50yL，37°C作用2. ^！。(3)加待检血清封闭结束后，用洗涤缓冲液(1XPBST，pH7. 4)洗涤反应板3次， 拍干反应板。将待检血清用PBST缓冲液进行1 200稀释后加入反应板中，每孔50 μ L，每个样品重复三孔。同时将标准FMDV阴性和阳性血清进行同样稀释后加入反应板，作为阴性和阳性对照。37°C作用Ih。(4)加酶标二抗取出ELISA反应板，弃去孔中液体后，用洗涤缓冲洗涤反应板3 次，拍干反应板。将HRP-山羊抗小鼠IgG抗体按其棋盘法确定的最佳浓度进行稀释后加入反应板。每孔50 μ L，37°C作用45min。(5)显色取出ELISA反应板，弃去孔中液体后，用洗涤缓冲洗涤反应板3次，拍干反应板每孔加入OPD底物显色液100 μ L，37°C作用20min。(6)终止显色反应结束后，每孔中加入100 μ L终止液(1. 25Μ硫酸)终止反应。 用酶标仪在490nm处测定OD值。1. 2实验结果免疫后通过间接ELSA测定小鼠、豚鼠和猪体内针对C型FMD的抗体效价。所有试验组在免疫7d后可检测出抗体，二免刺激后抗体水平进一步提升国，参见附图9、10和11。 以PBS免疫阴性对照组小鼠体内一直未检测出针对C型FMD的抗体。试验2豚鼠攻毒保护试验2.1材料与方法
2. 1. 1疫苗为按实施例2制备的C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗，命名为批号 20110305，20110320，20110401。作为对照组C型VPl 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备，命名为批号20110211 ；C型 VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗由本实验制备，批号20110221 ；C型口蹄疫灭活疫苗由本实验制备，命名为批号20110410。2. 1. 2试验动物和毒株体重约为350 450g的豚鼠购自兰州生物制品所实验动物中心。C型FMDV毒株AV104由BHK-21细胞传代并由本室保存。2. 1. 3免疫动物(1)将成年雌性豚鼠随机进行分组，每组6只，制备好的免疫原于 0d、14d进行皮下注射，免疫剂量为200μ 1/只。型VPl 口蹄疫基因工程亚单位疫苗；C 型VP3 口蹄疫基因工程亚单位疫苗和C型口蹄疫灭活疫苗按上述方式进行免疫，同时设置阴性对照。免疫观天后所有实验动物采用IOOLD5tl攻毒。2. 1. 4结果判定病毒对照组4/5发病时免疫组5/5保护；或对照组4/5发病时免疫组4/5保护以上保护可判为疫苗合格。2. 2试验结果与讨论2. 2. 1试验结果分别用50和IOOLD5tl/只型FMDV毒株AV104攻毒14天，对照豚鼠全部发病，而C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗免疫组的保护率为83.3%，详见表1、表2。表1. C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗与灭活疫苗免疫力比较试验结果
权利要求
1.一种C型口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于疫苗的主要组成为由C型口蹄疫的结构蛋白VPl和VP3按蛋白含量1 1构成的混合物。
2.如权利要求1所述的C型口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于疫苗中还混合有206油佐， 其中的C型口蹄疫病毒的结构蛋白VPl和VP3体积之和与206油佐的体积比为1 1，而C 型口蹄疫病毒的结构蛋白VPl和VP3为重组蛋白。
3.如权利要求1或2所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于疫苗中的重组C型口蹄疫病毒的结构蛋白VPl和VP3均为C型口蹄疫病毒基因VPl和VP3的真核表达产物。
4.如权利要求3所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于疫苗中的C型口蹄疫的结构蛋白VPl和VP3均为C型口蹄疫抗原基因VPl和VP3在中国仓鼠卵巢细胞表达系统表达的产物。
5.用于制备如权利要求4所述的C型口蹄疫的结构蛋白VPl和VP3的方法，其特征在于以C型口蹄疫病毒为模板，分别采用VPl引物和VP3引物进行PCR扩增，再由将PCR得到的产物分别与pCI-neo真核表达载体连接，分别得到重组质粒pCI-VPl和pCI-VP3，再用重组质粒pCI-VPl和pCI-VP3分别转染仓鼠卵巢细胞得到表达产物。
6.权利要求5所述的C型口蹄疫的结构蛋白基因VPl和VP3的制备方法，其特征在于所用的扩增VPl和VP3的引物分别为VPl引物上游引物5 ‘ -GCGAATTCACCACGACCACTGGTGAATCT-3 ‘下游引物5 ‘ -GCCTCGAGCTGCTTCGCGGGCGCGATGAG-3 ‘；所用VP3引物分别是VP3引物上游引物5 ‘ -GCGAATTCGGAATCTTTCCCGTCGCGTGC-3 ‘下游引物5' -GCCTCGAGTTGTTGTCTAGCGTCCACCG-3 ‘。
7.如权利要求6所述的C型口蹄疫的结构蛋白VPl和VP3的制备方法，其特征在于将 C 型□蹄疫病毒模板 lOOng，dNTP(10mM)5y l,10Xpfu buffer 5 μ 1, pfu DNA polymerase 5U分别和VPl和VP3的上下游引物各50pmol、补无菌的超纯水至总体积为50 μ 1，混合均勻，按以下的扩增条件扩增94°C lOmin，然后于以下条件进行30个循环94°C lmin, 56°C lmin, 72°C 40s，最后72°C延伸8min ；再将得到的VPl和VP3基因片段与pCI-neo真核表达载体连接，得到重组质粒pCI-VPl和pCI-VP3 ；将pCI-VPl和pCI_VP3重组质粒分别转染CHOdhfr-细胞，筛选重组的高表达单克隆细胞株后得到表达产物。
全文摘要
本发明公开一种C型口蹄疫亚单位基因工程疫苗及其制备方法。本发明的C型口蹄疫亚单位疫苗的主要组成为由C型口蹄疫的结构蛋白VP1和VP3按蛋白含量1∶1构成的混合物，其中的C型口蹄疫病毒的结构蛋白VP1和VP3为C型口蹄疫病毒基因VP1和VP3的真核表达产物，特别是C型口蹄疫抗原基因VP1和VP3在中国仓鼠卵巢细胞(即胞CHO/dhfr-细胞)表达系统表达的产物。
文档编号A61K39/135GK102363042SQ20111030327
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者丁耀忠, 刘永生, 周建华, 张 杰, 陈豪泰, 马丽娜 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所