专利名称：丰年虾卵提取物、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及丰年虾卵提取物及其制备方法。本发明还涉及该提取物在治疗和/或预防与发炎相关的皮肤异常和与一氧化氮过量生成相关的疾病中的用途。
背景技术：
一氧化氮(.Ν0)为生物体内不稳定的自由基，现今已成为人类生理及病理学重要指标之一。一氧化氮是借助一氧化氮合成酶由L-精胺酸之端胍基的氮原子所形成。在生理状况下，低量的.NO是由存在于多种细胞(包含内皮细胞和神经元)中持续表现得钙依赖性NOS异型态(cNOS)所产生。所述低量的一氧化氮与多种生理调节相关，例如血压的控制、神经信号的传递和免疫系统功能的调节；另一方面，在病理状况下，高量的.NO则由多种细胞型态(包含内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞)中可诱发表现的钙依赖性NOS异型态(iNOS)所产生。可诱发一氧化氮高量产生的刺激因子相当多样，例如炎症性细胞素的过度制造(如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1 (IL-1)、干扰素)可诱发的一氧化氮合成酶基因的转录，进而产生高量一氧化氮，进而诱发发炎性细胞因子或其它发炎相关蛋白(例如，TNFa、IL-6、IL-1、IL-8、ICAM-U VCAM-1 和 VEGF)的过度产生。现今，全球因气 候变迁或各种污染物，例如全球暖化、温室效应、臭氧层破洞、紫外线过量、汽车排放有害气体、室内室外废气和二手烟等，已严重威胁到人类之健康。尤其过去100年来，台湾的气温已上升1.3度，是全球平均值的2倍，估计未来的夏日将漫长又炎热，使气候因素与污染物的相互作用加剧，这些外在环境的改变，将对人体产生危害，尤以防御最前线的皮肤为最。当皮肤新陈代谢减缓，阳光、紫外线、污染源，甚至生活方式与压力的侵袭，导致其逐渐失去应有的修复反应与平衡状态，此时细纹、斑点、松弛、粗糙、下垂等现象一一浮现。引发这些老化现象的原因之一是皮肤接受诸多内外刺激，会于内部产生炎症反应。根据特性与肇发原因可分为慢性炎症反应与神经性炎症反应。皮肤连番接受两种炎症反应的影响，会受到老化反应加剧、皱纹提早出现和加深、皮肤失去紧实度等问题的困扰。皮肤炎症反应已成为抗老趋势新显学，除此之外，肌肤黑色素的生成是一项极为复杂的生理反应，皮肤的炎症、氧化反应，也会导致黑色素生成，当细胞内出现炎症，会分泌细胞激素，刺激“酪氨酸酶”促使黑色素形成。再者，已知一氧化氮合成酶(特别是iNOS)与下列疾病有关:血小板凝集、体内平衡过程、组织损伤、发炎状况、休克状态、免疫病症、胃肠能动性病症和中枢神经系统疾病、糖尿病性神经病变(Epstein, The New England Journal of Medicine, 1993, 329 (27):2002-2011 ；Hobbs 等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol, 1999, 39: 191-220 ；Pfeilschfter等人，Cell Biology International, 1996, 20 (I):51_58)。现有技术也指出神经变性与糖尿病性溃瘍密切相关(N Engl J Med, Volume 343(11), September 14,2000，pp.787-793和 J.Fam.Pract, Volume 49 (II) Supplement.November 2000S40-S48)。一氧化氮合成酶亦与由一氧化氮引起的状况有关，诸如组织损伤、脑部缺血、癫痫、免疫反应和炎症反应(Mulligan 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1991,88:6338_6342)。许多严重且难治的人类疾病与发炎过程的调节异常有关，这类疾病包括传统上未视为炎症性病状的疾病，诸如癌症、动脉粥样硬化和糖尿病。类似地，诸如类风湿性关节炎、狼疮、牛皮癣和多发性硬化症的自身免疫疾病涉和患病组织中发炎过程的不当且慢性的活化，其由免疫系统中自身识别和反应机制对非自身识别和反应机制的功能障碍引起。在诸如阿尔茨海默症(Alzheimer, s disease)和帕金森氏症(Parkinson, s disease)的神经退化性疾病中，神经损伤与微神经胶质细胞的活化和促炎性蛋白(例如诱导型一氧化氮合成酶(iNOS))的含量升高有关。源于四亿年前地球上最原始的海洋浮游生物卤虫属(学名=Artemia),俗称丰年虾(Artemia Salina)、卤虫、海猴子、盐水虾、盐虫子、水马骝等，是无背甲目卤虫科下唯一的属，可当成宠物饲养，也可作为鱼饲料，是软珊瑚的主要食物之一。而在历史纪载中，当欧洲人最初进入北美大陆之时，就曾发现东北美的一些印第安原住民就以晒干的丰年虾卵做为辅助性食物。丰年虾经过漫长生物进化，已发现其极耐各种恶劣的环境，丰年虾能在连鱼类也无法生存的含盐量超过海水六倍的水域中存活。丰年虾卵被称为耐久卵，可长期抗拒外界环境中不利因素的伤害，保护其中休眠的胚胎，等到环境适合丰年虾繁殖生存时，再破壁而出，繁衍种族。目前已发现，丰年虾卵在长期高强度的紫外线、辐射线照射下，高温干旱，以及在有毒溶剂中，皆表现出令人惊叹的生命力和活动力。1978年法国和俄国科学家将丰年虾卵送上外层空间，长达96小时接受外层空间极恶劣的环境，例如极温、大量宇宙辐射线照射等。当这些卵被带回地 球后，在接下来的一二十年中做了大量的研究，包括孵化率和卵的化学成分改变等，结果显示带回的丰年虾卵有高达96%的孵化率。依照丰年虾的生活史及其从成虫到幼虫的过程，有各种对抗外界不利环境的分子，以保护丰年虾卵渡过极端不利的环境，例如P26、青蒿琥酯(Artemin)、二鸟苷四磷酸(diguanosine tetraphosphate,GP4G)和海藻糖(Trehalose)。其中二鸟苷四憐酸已证实具有多种疗效，例如欧洲专利第1049455号揭示其可加强皮肤免疫系统，刺激皮肤细胞再生，并且同时由改善角质隔层的辅助提供紫外防护；中国台湾专利公开第200640475号揭示其可刺激真皮或表皮大分子合成和/或防止其降解；日本专利公开第204238297号揭示二鸟苷四磷酸具有保护皮肤对抗外部压力的作用，并可促进热休克蛋白的产生；日本专利公开第204238297号、美国专利公开第2009148544号、美国专利第7，615，546和7，544，375号和法国专利第2834887号揭示二鸟苷四磷酸具有活化再生细胞功能、改善皮肤细胞状态、防止皮肤粗糙并可除皱和抗老化；中国台湾专利第1281413号揭示其可调节细胞间的联系；欧洲专利第1336402号揭示可促进头发生长和/或减少掉发。由于丰年虾卵的成分丰富，极具治疗潜力，本发明因此关注开发新颖丰年虾卵提取物、其制造方法及其用途。
发明内容
本发明提供一种制备丰年虾卵提取物的方法，其包含下列步骤:
a)提供丰年虾卵；b)逆境处理所述丰年虾卵；和c)均质化步骤b)的丰年奸卵。本发明还提供一种丰年虾卵提取物。本发明又提供一种包含本发明丰年虾卵提取物的组合物。本发明也提供一种根据本发明的丰年虾卵提取物在预防和/或治疗与发炎相关的皮肤异常中的用途。本发明还提供一种根据本发明的丰年虾卵提取物在预防和/或治疗与一氧化氮过量生成相关的疾病中的用途。本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的和优点可显而易见地在本发明的具体实施方式
和权利要求中发现。除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有本领域技术人员通常理解的含义。术语的含义和范畴应是明确的；然而，若存在任何潜在得含糊性，则本文所提供的定义优先于任何词典或外来定义。除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数，复数术语也应包括单数。除非另外指示，否则应理解为根据本申请所用的以下术语具有以下含义:
本文所用的术语“预防”表示延缓易患病个体的症状的起始或降低病症的发生。本文所用的术语“治疗”表示减少和/或改善患病个体的症状。本文所用的术语“个体”表示动物，特别是哺乳动物。根据本发明的优选实施例，“个体”是指人类。本文所用的术语“治疗有效量”表示活性成分单独或与其它治疗/药物合并使用时的用量，该用量足以显示治疗功效。本文所用的术语“载体”或“药学上可接受的载体”是指稀释剂、赋形剂、接受体或类似物，其为药物组合物制备技术领域中的一般技术人员所熟知。制备方法根据本发明，制备丰年虾卵提取物的方法可包含下列步骤:a)提供丰年虾卵；b)逆境处理所述丰年虾卵；和c)均质化步骤b)的丰年虾卵。本文所用的术语“丰年奸卵”是指Artemia Salina或Brine Shrimp的卵，丰年虫下亦称卤虫、海猴子、盐水虾、盐虫子、水马骝，属无背甲目卤虫科卤虫属。根据本发明的丰年虾卵的收集方法、取得期间和取得条件为本领域技术人员所熟知，并无特殊限制。根据本发明，将收集而得的丰年虾卵经受逆境，在本发明的一个具体的优选实施例中，所述逆境是盐逆境、UV逆境、热逆境和酸逆境。在本发明的一个具体的优选实施例中，所述盐逆境是用约2 %至约5 %的盐水处理约6至约12小时；优选用约3%之盐水处理约12小时。所述盐优选是氯化钠、氯化镁或氯化钾。在本发明的一个具体的优选实施例中，所述UV逆境是用UV照射约12至约24小时，且照射强度为约6000至约lOOOOmW/cm2 ;优选照射约18小时。在本发明的一个具体的优选实施例中，所述热逆境是于约95°C至约105°C处理约3至约7分钟；优选于约100°C煮沸约5分钟。在本发明的一个具体的优选实施例中，所述酸逆境是用约IN至约4N的氢离子浓度处理约20至约40分钟；优选地，所述酸逆境是用约2N的氢离子浓度处理约30分钟。所述氢离子优选由硫酸或盐酸提供。根据本发明的方法，步骤c)均质化步骤b)的丰年虾卵是为取得提取物的处理步骤。优选地，经过步骤b)逆境处理后的丰年虾卵首先经过滤杂质和清洗后，再进行均质化。所述过滤杂质和清洗的手段是本领域技术人员可以完成的。根据本发明的均质丰年虾卵的方法可以是一般细胞破碎方法，例如使用细胞破碎仪或超音波震荡仪进行。为使均质化可方便进行，可先将经逆境处理的丰年虾卵加入水中，优选地，是用约3至约10倍的水混合步骤b)的丰年虾卵，以获得丰年虾卵水混合物；更优选地，是用约6倍的水混合步骤b)的丰年虾卵。在本发明的一个具体的优选实施例中，根据本发明的方法还包含去除步骤c)所得的均质化丰年虾卵的细胞碎片，并获得澄清液。所述去除细胞碎片的手段是本领域技术人员可以完成的，例如使用离心或过滤方式去除。在本发明的一个具体实施例中，步骤c)包含:Cl)用约3至约10倍的水混合步骤(b)的丰年虾卵，以获得丰年虾卵水混合物；c2)均质化步骤Cl)的丰年虾卵水混合物；和c3)去除步骤 c2)所得的均质化丰年虾卵水混合物中的细胞碎片，并获得澄清液；优选地，步骤c3)通过离心去除步骤c2)所得的均质化丰年虾卵水混合物中的细胞碎片。根据本发明的方法，优选还另包含步骤d)，以浓缩所述丰年虾卵提取物，其可以任何熟知的方法浓缩丰年虾卵提取物，例如冷冻干燥或蒸发(J.Pharmacol.Sc1.,99:294-300,2005和J.Chromatography，932 =91-95,2001)以获得经过浓缩的丰年虾卵提取物，并可选择地加入赋形剂，例如与甲基纤维素共同冷冻干燥。在本发明的一个具体的优选实施例中，所述经过处理的丰年虾卵经过过滤以去除处理过程所添加的溶剂，所述过滤的方法是本领域技术人员可以实施的。例如使用一般滤纸过滤，在过滤后用水清洗，再用约3至约10倍量的含蛋白酶抑制剂的水混合后打碎细胞；优选用约6倍量的含蛋白酶抑制剂的水混合后打碎细胞，然后于4°C 4500rpm离心20分钟取其上清液，经过滤、浓缩、冷冻干燥，保存于_20°C冰柜中备用。提取物本发明提供一种丰年虾卵提取物，其根据上述得方法制得。在本发明的具体实施例中，将提取物进行高压液相色谱法，使用的色谱柱为LiChroCART 250-4HPLC-Cartridge NH2,5 μ m,柱温箱温度为 25°C，进样体积为 10 μ L，流速为1.0mL/min，运行时间为30min，流动相为CH3CN: H2O = 4: 1(体积比)，根据本发明的提取物在保留时间为2.43至2.45,3.12至3.15,4.59至4.61,5.05和5.57至5.63分钟处具有吸收峰。在本发明的一个具体的优选实施例中，将丰年虾卵用盐逆境处理，并根据上述制备方法制得提取物，所述提取物经上述条件分析得高压液相色谱图如图1所示，其在保留时间为1.92,2.45,3.12,4.59,5.05和5.57分钟处具有吸收峰。在本发明的另一个具体的优选实施例中，将丰年虾卵用UV逆境处理，并根据上述制备方法制得提取物，所述提取物经上述条件分析的高压液相色谱图如图2所示，其在保留时间为1.92,2.45,3.12,4.59,5.05和5.57分钟处具有吸收峰。在本发明的另一个具体的优选实施例中，将丰年虾卵用热逆境处理，并根据上述制备方法制得提取物，所述提取物经上述条件分析的高压液相色谱图如图3所示，其在保留时间为1.92,2.43,3.15,4.61,5.05和5.60分钟处具有吸收峰。在本发明的另一个具体的优选实施例中，将丰年虾卵用酸逆境处理，并根据上述制备方法制得提取物，所述提取物经上述条件分析的高压液相色谱图如图4所示，其在保留时间为2.45,3.12,3.63,4.61,5.05和5.63分钟处具有吸收峰。组合物本发明提供一种包含治疗有效量的本发明丰年虾卵提取物的组合物。本发明组合物可作为食品组合物、医药组合物或化妆品组合物。本发明组合物可通过任何适当途径施用于个体，例如口服施用。本发明组合物的适当的剂型包括，但不限于锭剂、喉片、硬式或软式胶囊、水性或油性悬浮液、乳剂、可分散粉末或颗粒、糖衆或酏剂。如需要，可将所述组合物灭菌或与任何药学上可接受的载体，例如稳定剂、湿润剂等混合。本发明组合物可通过任何熟知的方法与熟知的药学上可接受的赋形剂混合。因此，用于口服的本发明组合物可包含，例如一或多种着色剂、甜味剂、增味剂和/或防腐剂。本发明组合物可 与其它一或多种目前正在使用的药物联用，以治疗与一氧化氮过量生成相关的疾病。根据本发明的化妆品组合物优选保存于水性液态介质中。本质上，水相可包括水；其还可包含水和与水互溶溶剂的混合物(在25°C为大于50重量％的水互溶力)，例如含I至5个碳原子的低碳一元醇，如乙醇或异丙醇，含2至8个碳原子的二元醇，如丙二醇、乙二醇、1，3- 丁二醇、或二丙二醇，C3-C4酮与C2-C4醛，和甘油。所述水性组合物可作为皮肤爽肤剂、湿润剂或保湿剂，以对暴露于环境因素或病理情况中或受损的皮肤发挥促进皮肤屏蔽修补和回复正常皮肤屏蔽的功能。可选择地，本发明的化妆品组合物还可以是乳液或乳霜组合物的形式。其可包含乳化表面活性剂，可选自阴离子和非离子表面活性剂。对于表面活性剂的性质和功能(乳化)，可参考文件“Encyclopedia of Chemical Technology, Kirk-Othmer，，，第 22 卷，第333-432页，第3版，1979，Wiley ;对于阴离子和非离子表面活性剂，特别地，可参考数据的第 347-377 页。优选用于本发明组合物的表面活性剂选自:非离子界面活性剂:脂肪酸，脂肪醇，聚乙氧化或聚乙二醇化脂肪醇，如聚乙氧化硬脂醇或鲸蜡基硬脂醇，蔗糖的脂肪酸酯，烷基葡萄糖酯，特别是C1-C6烷基葡萄糖的聚氧亚乙基化脂肪酸酯，及其混合物；阴离子界面活性剂:经胺、氨水或碱盐中和的C16-C3tl脂肪酸，及其混合物。优选使用可得到水包油或水包蜡乳液的表面活性剂。可选择地，本发明的组合物是水性凝胶或水凝胶组合物的形式。水凝胶组合物包含增稠剂以使液态溶液增稠。增稠剂的实例包括但不限于碳合物、纤维素为主的材料、胶、海藻素、瓜尔胶、果胶、鹿角菜苷、明胶、矿物性或经变性的矿物性增稠剂、聚乙二醇与多醇、聚丙烯酰胺和其它的聚合增稠剂。优选使用对组合物赋与稳定性和最适流动特性的增稠剂。本发明的组合物可进一步包含有效量的生理上可接受的抗氧化剂、天然或变性氨基酸、天然或变性固醇化合物、天然或变性胶蛋白、丝蛋白或大豆蛋白。本发明的组合物优选制备成应用于局部，如皮肤、毛发、睫毛、或指甲的角蛋白材料。其可以是正常用于此类应用的任何表现形式，特别是水性或油性溶液、水包油或油包水乳液、聚硅氧乳液、微乳液或纳米乳液、水性或油性凝胶或液体、浆状或固态水合产物的形式。本发明通常可以是流体且可具有白色或有色乳霜、软膏、乳汁、洗剂、浆液、浆料、慕斯或凝胶的外观。其可选择地以气溶胶、贴片或粉末的形式局部地应用于皮肤上。其也可以是固态形式，例如棒状形式。其可作为皮肤用保养产品和/或化妆产品使用。或者，其可制备成洗发精或护发素。在已知方式中，本发明的组合物也可包含化妆品常用得添加剂和佐剂，如亲水性或亲脂性胶凝剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、颜料、臭味吸收剂和染料。本发明化妆品组合物可包含脂肪物质，例如油，而且特别是矿物油(液态石油胶)、植物来源油(酪梨油、月见草油、红花油、大豆油、小麦胚芽油、杏仁核油)、动物来源油(羊毛脂)、合成油(全氢鲨烯)、聚硅氧油(环甲硅脂)和氟油(全氟多醚)。脂肪醇(如鲸蜡醇)、脂肪酸、蜡和胶，特别是聚硅氧胶，也是代表性的脂肪物质。
本发明化妆品组合物可包含乳化剂和共乳化剂，其包括聚乙二醇的脂肪酸酯，如PEG-100硬脂酸酯、PEG-50硬脂酸酯与PEG-40硬脂酸酯；多元醇之脂肪酸酯，如硬脂酸乙二醇酯、葡萄糖醇三硬脂酸酯与氧亚乙基化葡萄糖醇硬脂酸酯，例如市售的商标名Tween 20或Tween 60 ;及其混合物。本发明化妆品组合物可包含亲水性胶凝剂，特别地，其包括羧基乙烯基聚合物(碳合物)、丙烯酸共聚物(如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物)、聚丙烯酰胺、多糖、天然胶和黏土。特别地，亲脂性胶凝剂的实例包括变性黏土(例如膨润土)、脂肪酸的金属盐和疏水性硅胶。根据本发明的化妆品组合物特别适合局部应用于角质素基质/材料，如皮肤、角质素纤维(头发与睫毛)和指甲。用途本发明提供一种根据本发明的丰年虾卵提取物在预防和/或治疗与发炎相关的皮肤异常中的用途。在本发明优选的具体实施例中，与发炎相关的皮肤异常包括:如老化、皮肤粗糙、皮肤或毛发色素沉淀症、皮肤干燥、高皮脂溢、高皮脂溢相关缺陷、敏感性皮肤、头皮屑、自然掉发、秃头、异常痤疮、黑头粉刺或多态、老年粉刺、日光和医药或专业粉刺、玫瑰斑、大规模和/或严重形式的牛皮癣、鱼鳞病与类鱼鳞病状态、毛囊角化病、手掌角化病、白化病与类白化病状态、扁平苔癣、所有良性或恶性皮肤增生、大规模或严重类风湿性牛皮癣、瘙痒；红斑、特异性皮炎、接触性皮炎、接触性湿疹、扁平苔癣、痒疹、荨麻疹、痒疹毒性皮炎和角化过度。
本文所用的术语“老化”是指皱纹与细纹、失去皮肤的紧实和/或弹性、皮肤萎缩、存在扩大毛细孔的较不规则皮肤粒、失去皮肤光彩和/或色素沉淀痕迹。本文所用的术语“敏感性皮肤”的症状通常包括皮肤区域经历的疼痛感，如螫痛、刺痛、痒或癣痒、烧痛、发红、热痛、不适、紧绷等。本发明提供一种丰年虾卵提取物在预防和/或治疗与一氧化氮过量生成相关的疾病中的用途。在本发明优选的具体实施例中，与一氧化氮过量生成相关的疾病包括:如发炎、败血性休克、出血性休克、创伤性休克、过敏性休克、毒性休克症候群、低血容量性休克、缺血、脑缺血、细胞素给药、细胞素过度表现、溃疡、炎症性肠疾病(如溃疡性结肠炎或克隆氏症(Crohn; s disease))、糖尿病、代谢症候群、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病和糖尿病性溃疡、关节炎、类风湿性关节炎、气喘、阿尔茨海默症、帕金森氏疾病、多发性硬化、硬变、异体移植排斥作用、脑脊髓炎、脑膜炎、胰炎、腹膜炎、脉管炎、淋巴球性脉络丛脑膜炎、丝球体性肾炎、葡萄膜炎、回肠炎、发炎(如肝发炎、肾发炎等)、灼伤、感染(包含细菌、病毒、真菌和寄生性感染)、流感、上呼吸道感染有关的呼吸道发炎、血液透析、慢性疲劳症候群、中风、癌症(如乳癌、黑色素细胞瘤、实体瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等)、心肺旁通、缺血性再灌注损伤、血栓性或出血性中风、蛛网膜下出血、脑血管痉挛、心肌梗塞、休克、胃炎、溃疡性结肠炎、成人呼吸痛苦症候群、恶病质、心肌炎、自身免疫失调、湿疹、牛皮癣、心脏衰竭、心脏疾病、动脉硬化、心肌梗塞、急性冠状动脉症候群、血管手术后再狭窄、高血压和血管炎、皮肤炎、异位性皮炎、痤疮、荨麻疹、全身性红斑性狼疮、AIDS、AIDS痴呆、慢性神经退化性疾病、慢性疼痛、异常勃起、囊肿纤维变性、肌萎缩性侧索硬化、ALS和肌肉萎缩症、肌张力障碍、重症肌无力(M.G.)、精神分裂症、抑郁、行经前症候群、焦虑、成瘾(如药物、酒精和尼古丁依赖)、吗啡引起的耐受性和戒断症状、双极性病症、创伤后压力症、神经性厌食、ADHD和泛自闭症障碍、偏头痛、 炎症性疼痛和神经痛、亨廷顿氏病、癫痫、神经退化失调、胃肠能动性失调、肥胖症、摄食过度、实心肿瘤(如神经母细胞瘤)、疟疾、血癌、脊髓纤维变性、肺损伤、移植对宿主疾病、头损伤、CNS创伤、肝炎、肾衰竭、胰腺炎、肝疾病(如慢性肝炎C)、药物诱发的肺损伤(如Paraquat)、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、青光眼、视网膜炎、听力丧失、耳鸣、哮喘、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫症候群、囊肿性纤维化、骨质疏松症、骨关节炎、硬骨和软骨的其它退化性病状、急性或慢性移植失败或排斥反应和移植抗宿主疾病、与癌症疗法(包括放射疗法或化学疗法)有关的黏膜炎、重度烧伤、血小板凝集不足、体内平衡过程失调、组织损伤等。在本发明优选的具体实施例中，用丰年虾卵提取物处理巨噬细胞，可明显减少因脂多糖诱发的一氧化氮产生且呈剂量依赖效应。优选地，根据本发明的与一氧化氮过量生成相关的疾病是发炎；更优选地，其是皮肤发炎。发炎与许多细胞激素相关，其中白介素-6(InterleUkin-6，IL-6)主要由巨噬细胞和T细胞所分泌，可刺激T细胞和B细胞的增生分化和急性蛋白质的增加，为感染时早期炎症反应(acute phase reaction)的重要细胞激素。在本发明更优选的一个具体实施例中，用丰年虾卵提取物处理巨噬细胞，IL-6的产生量也被丰年虾卵提取物所抑制，特别是可抑制IL-6的生成达38%。并且所述丰年虾卵提取物对促炎症细胞激素的影响并非由细胞毒性所致。因此根据本发明的丰年虾卵提取物可有效增加吞噬活力，并降低炎症激素的释出，可增强免疫并能抑制发炎。根据本发明的丰年虾卵提取物是可行的治疗药剂，其对正常细胞并不造成毒性，在本发明优选的一个具体实施例中，用丰年虾卵提取物和未添加提取物组处理正常皮肤纤维母细胞，丰年虾卵提取物处理组相较于未添加提取物组有较高的细胞贴附和存活比例，可知丰年虾卵提取物具有保护正常细胞生长的作用。本领域技术人员可以无困难地选择适当的施用途径和剂量以进行治疗。根据本发明，优选的途径是口服施用。剂量则根据疾病的本质及其状况、个体的年龄和健康状况、施用途径和前处理等情形而定。本领域技术人员应该了解剂量会随着个体的年龄、体重、健康状况和其它相关因素而变化。以下的非限制性实施例有助于本领域技术人员实施本发明。所述实施例不应视为过度地限制本发明。本领域技术人员可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改和变化，而仍属于本发明的范围。
图1显示了实施例1中第2组提取物进行的室温高压液相色谱图。图2显示了实施例1中第3组提取物进行的室温高压液相色谱图。图3显示了实施例1中第4组提取物进行的室温高压液相色谱图。图4显示了实施例1中第5组提取物进行的室温高压液相色谱图。
图5a显示了用未添加提取物处理的正常皮肤纤维母细胞在显微镜下观察的结果图。图5b显示了用实施例1中第2组提取物(lmg/mL)处理的正常皮肤纤维母细胞在显微镜下观察的结果图。图5c显示了用未添加提取物处理的正常皮肤纤维母细胞在显微镜下观察的结果图。图5d显示了用实施例1中第2组提取物(2mg/mL)处理的正常皮肤纤维母细胞在显微镜下观察的结果图。图6显示了用实施例1中各组提取物、海藻糖或未添加提取物处理巨噬细胞后，经脂多糖诱发的一氧化氮生成量分析结果图。图7显示了用实施例1中第2组提取物或未添加提取物处理巨噬细胞后，经脂多糖诱发的IL-6生成量分析结果图。图8显示了用实施例1中第2组提取物或未添加提取物处理巨噬细胞后，经脂多糖诱发的MTT细胞增殖分析结果图。
具体实施例方式实施例1、丰年虾卵提取物的制备本实施例分别提供五组提取物:第I组:未经过处理的丰年虾卵第2组:将丰年虾卵置于3%盐水中6小时
第3组:将丰年虾卵在UV下照射18小时第4组:将丰年虾卵于100°C煮沸10分钟第5组:将丰年虾卵在2N H2SO4中静置30分钟每组秤取5g，分别 处理后过滤并以纯水清洗，分别用6倍量的含1: 1000蛋白酶抑制剂的水混合，并用细胞破碎仪(Planetary micro mill machine)于500rpm处理5分钟，打碎，并于4°C 4500rpm离心20分钟，提取液经过滤、浓缩、冷冻干燥，保存于-20°C冰柜中备用。实施例2、丰年虾卵提取物对正常皮肤纤维母细胞的存活率分析本实施例所使用的小鼠巨噬细胞株RAW264.7和NIH 3T3正常皮肤纤维母细胞购自新竹食品工业发展研究所，细胞生长在内含10%胎牛血清和ImM丙酮酸钠的DMEM(Dulbecco' s modified Eagles medium)的细胞培养液中。将上述细胞置于37°C培养箱内培养。将6X104的NIH 3T3正常皮肤纤维母细胞接种于六孔盘中，并培养过夜，再用I至2mg/ml的如实施例1中第2组，或未添加提取物处理5天，于显微镜下照相(IOX)，其结果如图5a至图5d所示。在缺乏CO2的状态之下，丰年虾卵提取物处理组细胞型态和未添加提取物组有些微的变化，第2组的树突状的细胞形成较少，且呈现圆型状的细胞居多；但用丰年虾卵提取物处理后有较高的细胞贴附、平铺的比例，并且有较多的树状突触产生。纤维母细胞的附着与伸展对于细胞增生是必要的，在稳定状态下的纤维母细胞会长出丝状伪足、细胞质呈网状、平铺的型态以及成长的数目明显地增加。因此加入丰年虾卵提取物的细胞持续且稳定地生长，在严苛环境之下添加丰年虾卵提取物具有保护正常细胞的作用。将6X104的NIH 3T3正常皮肤纤维母细胞接种于六孔盘中，并培养过夜，再用I至2mg/ml的如实施例1中第2组，或未添加提取物处理5天。去除澄清液的培养盘中每孔加入300 μ L的2%结晶紫，并于室温染色15分钟，接着用流动的自来水清洗以去除死细胞，并干燥3小时。再用ImL的30%醋酸溶解，并于OD 580nm下用ELISA仪读取，并计算细胞存活率。其结果如表I所示。表1:
权利要求
1.种制备丰年虾卵提取物的方法，其包含下列步骤: a)提供丰年虾卵； b)逆境处理所述丰年虾卵；和 c)均质化步骤b)的丰年奸卵。
2.据权利要求1所述的制备丰年虾卵提取物的方法，其中步骤b)的逆境选自由盐逆境、UV逆境、热逆境和酸逆境组成的群。
3.据权利要求1所述的制备丰年虾卵提取物的方法，其还包含去除步骤c)所得的均质化丰年虾卵的细胞碎片，并获得澄清液。
4.据权利要求1所述的制备丰年虾卵提取物的方法，其中步骤c)包含: Cl)用约3至约10倍的水混合步骤b)的丰年虾卵，以获得丰年虾卵水混合物； c2)均质化步骤cl)的丰年奸卵水混合物；和 c3)去除步骤c2)所得的均质化丰年虾卵水混合物中的细胞碎片，并获得澄清液。
5.据权利要求4所述的制备丰年虾卵提取物的方法，其中步骤c3)通过离心去除步骤c2)所得的均质化丰年虾卵水混合物中的细胞碎片。
6.种丰年虾卵提取物，其根据权利要求1所述的方法制得。
7.据权利要求6所述的丰年虾卵提取物，其进行高压液相色谱法，使用的色谱柱为LiChroCART 250-4HPLC-Cartridge NH2,5 μ m,柱温箱温度为 25°C，进样体积为 10 μ L，流速为1.0mL/min，运行时间为30min，流动相为CH3CN: H2O = 4:1体积比，保留时间为2.43 至 2.45,3.12 至 3.15,4.59 至 4.61,5.05 和 5.57 至 5.63 分钟处具有吸收峰。
8.种组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求6或7所述的丰年虾卵提取物和可选择的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.据权利要求8所述的组合物，其是食品组合物、医药组合物或化妆品组合物。
10.种根据权利要求6或7所述的丰年虾卵提取物的用途，其用于制备预防和/或治疗与发炎相关的皮肤异常的药物。
11.种根据权利要求6或7所述的丰年虾卵提取物的用途，其用于制备预防和/或治疗与一氧化氮过量生成相关的疾病的药物。
全文摘要
本发明涉及丰年虾卵提取物、其制备方法及其用途。本发明还涉及本发明中所述丰年虾卵提取物在治疗和/或预防与发炎相关的皮肤异常和与一氧化氮过量生成相关的疾病中的用途。
文档编号A61P17/00GK103083361SQ20111033279
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者苏倩雯, 陈世辉, 萧述文, 周德清 申请人:台盐实业股份有限公司