与腹部疾病有关的表位的制作方法

专利名称：与腹部疾病有关的表位的制作方法
技术领域：
本发明涉及在腹部疾病的诊断和治疗中有用的表位，包括诊断剂、治疗剂、试剂盒和使用前述的方法。
背景技术：
腹部疾病由免疫介导的对饮食谷蛋白的超敏反应造成。小麦、黑麦、大麦和有些情况下燕麦中的谷蛋白，在腹部疾病中是毒性的。谷蛋白由小麦中的α/β、Y和ω麦醇溶蛋白和低和高分子量(LMW和HMW)麦谷蛋白，大麦中的大麦醇溶蛋白，黑麦中的黑麦醇溶蛋白，和燕麦中的燕麦蛋白组成。大麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白与小麦中的Y和ω麦醇溶蛋白和低和高分子量麦谷蛋白是同源的。燕麦蛋白在种系发生上比大麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白离小麦谷蛋白更远。研究腹部疾病的目的是，通过定义刺激谷蛋白-特异性的T-细胞的肽来定义谷蛋白的有毒组分。谷蛋白表位的准确定义，允许开发新的诊断、治疗、食物中的谷蛋白污染的测试和保留传统谷蛋白的烹饪/烘烤质量的无毒谷物。许多这样的应用，需要全面理解谷蛋白中的全部而不是最常见的有毒肽。与大约35%—般高加索人口相比，编码HLA-DQ2和/或HLA-DQ8的基因存在于超过99%患有腹部疾病的个体中。谷蛋白-衍生的结合HLA-DQ2或HLA-DQ8的肽(表位)刺激特定的T-细胞。HLA-DQ2和DQ8-限制的表位包括“核心”9氨基酸序列，其直接与HLA-DQ2 或DQ8的肽结合沟和同源的T-细胞受体相互作用。通常，含有抗原中的所有独特的10或 12聚体肽的重叠肽(通常15-20聚体)文库，已经用于绘制HLA II类-限制的T-细胞表位的图谱。已知一系列的谷蛋白肽在腹部疾病中激活谷蛋白特异性的T-细胞。以前的研究已经从选择的谷蛋白或谷蛋白消化物中鉴别出了谷蛋白肽。从肠活组织检查分离的T-细胞克隆和系，已经用于筛选这些谷蛋白组分。酶(存在于肠组织中的组织转谷氨酰胺酶(tTG))对谷蛋白的修饰相当大地增加谷蛋白对谷蛋白特异性的T-细胞的刺激能力。谷蛋白-特异性的T-细胞的大多数已知表位，对应着tTG-脱酰胺的谷蛋白肽。转谷氨酰胺酶介导谷蛋白中的特定谷氨酰胺残基的脱酰胺作用(生成谷氨酸)。对tTG的脱酰胺作用易感的含有谷氨酰胺的序列通常符合基序 QXPX 或 QXX (FYMILVW)，(见 Vader W.等 2002J. Exp. Med. 195 :643-649, PCT WO 03/066079 和 Fleckenstein B. 2002. J Biol Chem277 :34109-16)。结合 HLA-DQ2 且对 tTG 的脱酰胺作用易感的肽的基序，已经用于预测某些谷蛋白表位(Vader等J Exp Med 2002J. Exp. Med. 195 :643-649,PCT WO 03/066079)。
但是，其它组已经使用一系列11种重组α / β (11)和5种Y麦醇溶蛋白(Arentz-Hansen H.2000. J. Exp. Med. 191 :603-612, Arentz-Hansen H.2002. Gastroenterology 123 :803-809, PCT W002/083722)和纯化的谷蛋白蛋白的裂解物(Sjostrom H.等 1998.Scand.J.Immunol. 48,111-115 ；van de Wal, Y.等 1998. J. Immunol. 161(4) :1585-1588 ；van de Wal，Y.等 1999.Eur. J. Immunol. 29 :3133-3139 ； Vader W.等 2002. Gastroenterology 122 1729-1737.)，鉴别出了谷蛋白-特异性的肠 T-细胞克隆和系的表位。我们的工作已利用了下述发现，即谷蛋白体内攻击诱导外周血中表达肠-归巢的整联蛋白(α4β7)的HLA-DQ2限制的⑶4+谷蛋白-特异性的T-细胞。该技术允许对 A-麦醇溶蛋白(57-73QE65)中的优势表位绘制图谱(Anderson, RP等2000. Nat. Med. 6 337-342.，W001/25793)。A-麦醇溶蛋白57-73 QE65对应着使用肠T-细胞克隆鉴别出的 2 种重叠表位(Arentz-Hansen H. φ 2000. J. Exp. Med. 191 :603-612, Arentz-Hansen H.等 2002. Gastroenterology 123 :803-809)。体内谷蛋白攻击诱导谷蛋白特异性的T-细胞的优点是，可以消耗任意的食物，且得到的在血液中诱导的T-细胞(使用简单的过夜干扰素 YELISP0T测定，在外周血中定量的)，会受到内源地存在的表位的体内刺激，而不是由合成的或纯化的抗原体外预处理。新鲜的多克隆的外周血T-细胞的过夜测定，也会避免与 T-细胞克隆的非常长的纯化有关的假象的可能性。有趣地，对几种γ-麦醇溶蛋白表位特异性的T-细胞克隆和系(Arentz-Hansen H. 2002. Gastroenterology 123 :803-809,PCT W002/083722)与最初定义的 A-麦醇溶蛋白表位57-73QE65交叉反应。尽管在α/β麦醇溶蛋白中存在相当大的同源性，但早期的工作(见WO 03/104273)已经表明，在HLA-DQ2-相关的腹部疾病中识别出的优势表位“Α-麦醇溶蛋白 57-73QE65”，是由Genbank中存在的少数α/β麦醇溶蛋白编码的。

发明内容
本研究的目的是开发一种方法，其允许对谷蛋白中的所有T-细胞表位绘制图谱。 使用小麦面包(每天200g，持续3天)或燕麦(每天100g，持续3天)的消耗，诱导外周血中的谷蛋白或燕麦蛋白-特异性的T-细胞(在开始攻击后6天收集)。使用谷蛋白和燕麦蛋白肽文库，包括在小麦谷蛋白和/或燕麦的燕麦蛋白的每个Genbank登记项中包含的所有独特的12聚体序列，在过夜干扰素Y ELISP0T测定中评价外周血单核细胞(PBMC)。通过确立一种算法，以设计跨过Genbank中的谷蛋白的所有潜在表位的肽(四22个20聚体包括所有14964独特的9聚体-潜在的T-细胞表位)，将干扰素-Y ELISP0T测定修改成能用单一个体血液筛选超过1000种肽的高通量测定，并开发用于分析和解释产生的数据的生物信息学工具，可以实现该目的。将小麦谷蛋白肽的一系列的41个“超家族”鉴别为推定的T-细胞表位。超家族共有基序，其中允许有限水平的冗余。许多最有效的家族包括已知的T-细胞表位，其中包括以前描述的优势表位A-麦醇溶蛋白57-73。通过使用谷蛋白攻击后的PBMC，对谷蛋白表位详尽地绘制图谱，发明人已经发现了与HLA-DQ2和HLA-DQ8有关的腹部疾病的一系列新的麦醇溶蛋白、LMW和HMW麦谷蛋白和燕麦蛋白表位。为HLA-DQ2和HLA-DQ8-相关的腹部疾病，鉴别了新表位。在识别的T-细胞表位的范围方面，HLA-DQ2和HLA-DQ8相关的腹部疾病在遗传上和功能上是不同的。另外， 在HLA-DQ2+腹部疾病受试者中进行燕麦攻击后，存在于燕麦的燕麦蛋白中的3种肽也会激活外周血单核细胞(PBMC)，首次定义了燕麦表位。体内燕麦攻击后由T-细胞识别的燕麦蛋白肽的鉴别，提供了观察到的燕麦暴露后腹部疾病的偶然复发的分子基础(Limdin KEA等 2003 Gut 52:1649-52)，并可以提供燕麦的预测性诊断或遗传解毒作用的基础。这里显示的数据会提供详尽的基础，用于定义腹部疾病中常见的“优势的”和偶然的“较弱的”T-细胞表位。该信息是诸如诊断、食品测试、免疫治疗和预防的功能应用的平台，和用于设计在改良的谷物中有用的无毒的谷蛋白的平台。具体地，通过谷蛋白T细胞表位的详尽绘图，发明人已经发现了具有类似的核心序歹Ij (例如，SEQ ID NO :1-199)和类似的延伸序列(例如，SEQ ID NO =200-1554, 1555-1655,1656-1671和1830-1903)的小麦麦醇溶蛋白和麦谷蛋白中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。发明人还已经发现了下述物质中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位具有类似的核心序列(例如，SEQ ID NO =1684-1695)和类似的延伸序歹Ij (例如，SEQ ID NO 1672-1683、1696-1698和1764-1768)的燕麦的燕麦蛋白；黑麦的黑麦醇溶蛋白(SEQ ID NO :1769-1786)；和大麦的大麦醇溶蛋白(SEQ ID NO 1787-1829)。另外，在具有类似的核心序列(例如，SEQ ID NO 1699-1721)和类似的延伸序列(例如，SEQ ID NO :1722-1763和1908-1927)的小麦麦醇溶蛋白中已经鉴别出了在 HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。因而，该详尽的绘图提供了腹部疾病患者中由T细胞识别的优势表位。因而使用这些鉴别出的表位、其类似物和等价物中的任一种， 可以实现本文所述的本发明的方法。也就是说，本发明的试剂包括这些表位。另外，已经表明，表位的组合即“combitope”或包含2个或更多个表位的单个肽诱导与单独的表位等价的反应，从而表明几个表位可以用于本发明的治疗、诊断和其它用途。这样的combitope 可以是例如SEQ ID NO :1906的形式。优选地，本发明的试剂包括一个或多个具有在SEQ ID NO 1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、 1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 中列出的序列的表位，如本文定义的其类似物和等价物。优选的在HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的试剂在序列中具有谷氨酰胺，其指示着对脱酰胺作用的易感性，其与也对脱酰胺作用易感的第二个谷氨酰胺由7个残基隔开(例如，如在QGSFQPSQQ中发现的)，其中在tTG的脱酰胺作用后，脱酰胺的序列是 HLA-DQ8的高亲和力结合剂(HLA-DQ8的结合基序偏好在位置1和9处的谷氨酸)。在一个次优选的实施方案中，试剂具有对脱酰胺作用易感的谷氨酰胺残基，但是与对tTG-介导的脱酰胺作用易感的第二个谷氨酰胺之间没有被7个残基隔开。因而，本发明提供了诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法，其包含下述步骤(a)使来自宿主的样品接触选自下述的试剂(i)表位，其包含选自SEQ ID NO :1-1927,优选选自 SEQ ID NO 1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、 1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、 1895-1903、1906和1908-1927的氨基酸序列，或来自天然产生的谷蛋白的等价序列，(ii) (i)的类似物，其能被识别(i)的T细胞受体识别，在肽类似物的情况下，它的长度不超过50个氨基酸，或(iii)产物，其包含两种或更多种如⑴或(ii)中所定义的试剂；和(b)体外测定样品中的T细胞是否识别该试剂，其中T细胞的识别指示着该个体患有或易感腹部疾病。术语“谷蛋白”包括小麦中的α/β、Y和ω麦醇溶蛋白，和低和高分子量(LMW 和HMW)麦谷蛋白，大麦中的大麦醇溶蛋白，黑麦中的黑麦醇溶蛋白，和燕麦中的燕麦蛋白。 本发明特别地涉及麦醇溶蛋白和燕麦蛋白。本发明也提供了试剂在制备用于诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法中的诊断工具中的用途，所述方法包含，测定个体的T细胞是否识别该试剂，其中T 细胞的识别指示着该个体患有或易感腹部疾病。被转谷氨酰胺酶修饰的表位的发现，也允许基于测定是否存在针对这些表位的其它类型的免疫反应来诊断腹部疾病。因而，本发明也提供了诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法，其包含测定来自个体的样品中能结合表位的抗体的存在，其中抗体的存在指示着该个体患有或易感腹部疾病。本发明提供了测定组合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含测定组合物中是否存在能被转谷氨酰胺酶修饰成如上定义的寡肽序列的蛋白，其中所述蛋白的存在指示着该组合物能造成腹部疾病。本发明也提供了突变的谷蛋白，其野生型序列可被转谷氨酰胺酶修饰成包含表位的序列，所述表位包含如上定义的序列，但是该突变的谷蛋白已经被修饰，该修饰方式使它不含有可以被转谷氨酰胺酶修饰成包含这样的包含所述序列的表位的序列的序列；或这样的突变的谷蛋白的片段，其长度为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或 15个氨基酸长)，且其包含已经以所述方式修饰的序列。本发明也提供了蛋白，其包含能结合T细胞受体的序列，该T细胞受体识别试剂， 且该序列能造成携带这样的T细胞受体的T细胞的拮抗作用。另外，本发明提供了包含如上定义的蛋白的食物。另外，本发明提供了试剂，其任选地与载体相结合，用于通过使识别试剂的T细胞耐受来治疗或预防腹部疾病的方法中。还提供了具有识别(i)的T细胞受体的T细胞的拮抗剂，其任选地与载体相结合，用于通过拮抗这样的T细胞来治疗或预防腹部疾病的方法中。另外，提供了结合抗体(其结合试剂)的试剂或类似物，其用于通过使个体耐受以预防这样的抗体的生成来治疗或预防腹部疾病的方法中。本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用至少一种选自下述的试剂a)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自SEQ ID N0:l-1927，优选地选自 SEQ ID NO :1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、 1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 的序列，和其等价物；和b)a)的类似物，其能被识别a)的肽的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸。在有些实施方案中，试剂是HLA-DQ2-限制的、HLA-DQ8-限制的，或一种试剂是HLA-DQ2-限制的，且第二种试剂是HLA-DQ8-限制的。在有些实施方案中，试剂包含小麦表位、燕麦表位、黑麦表位、大麦表位或其任意组合，或者是作为单一试剂或者是作为复合试剂。本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用药物组合物，所述组合物包含如上定义的试剂和药学上可接受的载体或稀释剂。本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用药物组合物，所述组合物包含具有如上定义的T细胞受体的T细胞的拮抗剂，和药学上可接受的载体或稀释剂。本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用组合物，以用于使个体耐受谷蛋白，以抑制生成对如上定义的试剂的T细胞或抗体反应，该组合物包含如上定义的试剂。本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，这通过下述来实现1)诊断个体的腹部疾病，这通过下述来实现a)使来自宿主的样品接触至少一种选自下述的试剂 i)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自SEQ ID NO: 1-1927，优选地选自SEQ ID NO 1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、 1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 的序列，和其等价物；和ii)i)的类似物，其能被识别i)的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸；和体外测定样品中的T细胞是否识别该试剂；T细胞的识别指示着个体患有或易感腹部疾病；或b)施用如上定义的试剂，和体内测定个体中的T细胞是否识别该试剂，其中试剂的识别指示着个体患有或易感腹部疾病；和2、给诊断为患有或易感腹部疾病的个体，施用用于预防或治疗腹部疾病的治疗剂。本发明也提供了如上定义的试剂，其任选地与载体相结合，以用于通过使识别试剂的T细胞耐受来治疗或预防腹部疾病的方法中。本发明也提供了具有如上定义的T细胞受体的T细胞的拮抗剂，其任选地与载体相结合，以用于通过拮抗这样的T细胞来治疗或预防腹部疾病的方法中。本发明也提供了蛋白，其包含能结合T细胞受体的序列，该T细胞受体识别如上定义的试剂，且该序列能造成携带这样的T细胞受体的T细胞的拮抗作用。本发明也提供了药物组合物，其包含如上定义的试剂或拮抗剂，和药学上可接受的载体或稀释剂。本发明也提供了组合物，其用于使个体耐受谷蛋白，以抑制生成对如上定义的试剂的T细胞或抗体反应，该组合物包含如上定义的试剂。本发明也提供了组合物，其用于拮抗对如上定义的试剂的T细胞反应，该组合物包含如上定义的拮抗剂。本发明也提供了突变的谷蛋白，其野生型序列可以被转谷氨酰胺酶修饰成作为如上定义的试剂的序列，该突变的谷蛋白包含一个突变，所述突变可以预防它被转谷氨酰胺酶修饰成作为如上定义的试剂的序列；或这样的突变的谷蛋白的片段，其长度为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长)，且其包含该突变。本发明也提供了多核苷酸，其包含编码如上定义的蛋白或片段的编码序列。本发明也提供了细胞，其包含如上定义的多核苷酸，或其已经被这样的多核苷酸转化。本发明也提供了哺乳动物，其表达如上定义的T细胞受体。本发明也提供了诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法，其包含 a)使来自宿主的样品接触至少一种选自下述的试剂i)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自 SEQ ID NO 1-1927，优选地选自 SEQ ID NO SEQ ID NO 1578-1579、1582-1583、 1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、 1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 的序列，和其等价物；和 ii)i)的类似物，其能被识别i)的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸；和b)体外测定样品中的T细胞是否识别该试剂；T细胞的识别指示着该个体患有或易感腹部疾病。本发明也提供了测定该组合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含测定组合物中是否存在能被转谷氨酰胺酶修饰成寡肽序列的蛋白，其中蛋白的存在指示着该组合物能造成腹部疾病。本发明也提供了鉴别T细胞的拮抗剂的方法，该T细胞识别如上定义的试剂，所述方法包含使候选物质接触T细胞，和检测该物质是否造成T细胞经历抗原特异性的反应的能力的降低，其中所述能力的任何这样的降低的检测，指示着所述物质是拮抗剂。本发明也提供了用于实施上述的任一种方法的试剂盒，其包含如上定义的试剂和用于检测T细胞对肽的识别的工具。本发明也提供了鉴别作为腹部疾病的治疗剂的产物的方法，其包含给如上定义的患有或易感腹部疾病的哺乳动物施用候选物质，并测定该物质是否预防或治疗哺乳动物中的腹部疾病，其中腹部疾病的预防或治疗指示着该物质是治疗产物。本发明也提供了生产由如上定义的编码序列编码的蛋白的方法，该方法包含a) 在允许表达蛋白的条件下，培养上述的细胞；和任选地b)回收表达的蛋白。本发明也提供了得到转基因的植物细胞的方法，其包含用如上所述的载体转化植物细胞，以生产转基因的植物细胞。本发明也提供了得到第一代转基因植物的方法，其包含再生用如上所述的载体转化的转基因的植物细胞，以生产转基因植物。本发明也提供了得到转基因植物种子的方法，其包含从可如上得到的转基因植物得到转基因种子。本发明也提供了得到转基因后代植物的方法，其包含从可由如上所述的方法得到的第一代转基因植物，得到第二代转基因后代植物，并任选地从由此得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的转基因植物。本发明也提供了可由任一种上述的方法得到的转基因的植物细胞、植物、植物种子或后代植物。本发明也提供了转基因植物或植物种子，其包含如上所述的植物细胞。本发明也提供了转基因的植物细胞愈伤组织，其包含如上所述的可从如上定义的转基因的植物细胞、第一代植物、植物种子或后代得到的植物细胞。本发明也提供了得到作物产物的方法，其包含从根据任一种上述的方法的植物收获作物产物，和任选地进一步加工收获的产物。本发明也提供了食物，其包含如上定义的蛋白。


图1显示了从一组蛋白产生所有可能的肽表位的方法。图2显示了在2003年6月16日的Genbank数据库中存在的谷蛋白基因产物的Genbank登记号。图3A显示了分析来自ELISpot的数据的期望最大化(EM)算法。图;3B显示了对腹部疾病患者的数据集的测试。图4显示了发现反应性表位的最小集的迭代过程。图5显示了麦醇溶蛋白和麦谷蛋白序列(SEQ ID NO :1-1554)。在“一致”列中， 小写字母使用标准的单字母氨基酸代码，但是大写字母具有不同的含义E = [e或q]，F = [f或y或w]，I = [i或1或v]，S= [s或t]，R= [r或k或h]。“序列”列使用标准的单字母氨基酸代码。图6显示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻击后6天收集的PBMC中，刺激Y干扰素的谷蛋白肽(SEQ ID NO :1555-1655)。标示的9聚体是200组生物活性的“结构上”有关的20聚体肽共有的。根据受试者反应的生物活性X比例，排列谷蛋白序列。图7显示了小麦攻击实验的结果(SEQ ID NO :1656-1671)。在小麦攻击后，这些肽在10位受试者(A-J)中产生高质量反应(标示‘Y’ )。图8显示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻击后6天收集的PBMC中，刺激干扰素-Y的燕麦蛋白肽(+/_tTG的脱酰胺作用)(SEQ ID NO :1672-1698)。标有*的那些是燕麦攻击后诱导IFN- γ的最佳的独特的20聚体。图9显示了在2位根据共有的核心序列分组的HLA-DQ8 (不是HLA-DQ^受试者中最有效的40种20聚体(SEQ ID NO :1699-1763)。组6的核心序列(QGSFQPSQQ)对应着 van de Wal 等(J. Immunol. 1998，161 G) :1585-1588)所述的 α-麦醇溶蛋白表位。受试者A中的最大反应是27ISFC (单独的介质，没有肽反应4SFC)，且在B中，是^SFC (单独的介质，没有肽反应1 SFC)。图10显示了基于氨基酸测序的A-麦醇溶蛋白(SEQ ID NO :1928)的氨基酸序列。
具体实施例方式术语“腹部疾病”包括通过改变谷蛋白敏感度的程度造成的多种状况，其包括特征在于扁平小肠粘膜(增生性绒毛萎缩)的严重形式和特征在于轻症状的其它形式。上面(在诊断或治疗的上下文中)提及的个体是人。他们可能患有或被怀疑患有腹部疾病(有症状的或无症状的)。他们可能采用无谷蛋白的饮食。他们可能是在急性期反应中(例如，他们可能患有腹部疾病，但是在最近的M小时，仅仅摄入谷蛋白，然后他们采用无谷蛋白的饮食14- 天)。个体可能易感腹部疾病，例如遗传易感性(例如通过有患有腹部疾病的亲戚或具有会造成对腹部疾病的素因的基因的个体来确定)。试剂试剂一般地是肽，例如长为7-50个氨基酸，例如长为10-40、12-35或15_30个氨基酸。试剂可以是由SEQ ID NO :1-1927中的任一个代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ ID NO :1-1927中的任一个，其是分离的源自谷蛋白蛋白的寡肽；或来自天然产生的谷蛋白蛋白的这些序列的等价物。在本发明的另一组实施方案中，试剂是燕麦谷蛋白的任意肽表位(例如，燕麦蛋白的任意T细胞表位)。
优选地，试剂是由SEQ ID NO 1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、 1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、 1895-1903、1906和1908-1927中的任一个代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ ID NO 1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、 1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 中的任一个， 其是分离的源自谷蛋白的寡肽；或来自天然产生的谷蛋白的这些序列的等价物。因而，表位可以是天然产生的谷蛋白的衍生物，尤其是来自小麦或燕麦谷蛋白。这样的衍生物一般地是谷蛋白的片段，或整个蛋白或片段的突变的衍生物。因此，本发明的表位不包括天然产生的整个谷蛋白，且不包括其它的整个的天然产生的谷蛋白。一般地，这样的片段长为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或 15个氨基酸长)。一般地，在本文所述的使用来自腹部疾病患者的样品的任意测定中，T细胞会以至少与识别片段所来源的试剂相同的程度识别这样的片段。试剂可以是由SEQ ID NO 1-1927中的任一个代表的肽，优选地由SEQ ID NO 1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、 1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 中的任一个代表的肽，或蛋白，所述蛋白包含与SEQ ID NO :1-1927中的任一个相对应的序列，优选地包含与 SEQ ID NO :1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、 1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 中的任一个相对应的序列(例如包含SEQ ID NO :1-1927中的任一个，优选地包含SEQ ID NO1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、 1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906 和 1908-1927 中的任一个的谷蛋白片段，例如，在已经用转谷氨酰胺酶处理谷蛋白后)。这样的序列的生物活性的片段，也是本发明的试剂。一般地，这样的片段长为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、 11、12、13、14或15个氨基酸长)。与SEQ ID NO :1-1927中的任一个等价的序列或这些序列的类似物，也是本发明的试剂。在表位包含与来自另一种谷蛋白(例如，任一种本文提及的谷蛋白或任一种会造成腹部疾病的谷蛋白)的上述表位(包括片段)等价的序列的情况下，这样的等价序列对应着一般地用转谷氨酰胺酶(部分地或完全地)处理的谷蛋白的片段。通过比对其它谷蛋白和原始表位所来源的谷蛋白的序列(例如，使用任一种本文提及的程序)，可以确定这样的等价肽。转谷氨酰胺酶是可商业上得到的(例如，Sigma T-5398)。作为类似物的试剂能被识别⑴的TCR识别。因此，通常当在存在⑴的情况下， 且一般地，也在抗原呈递细胞(APC)(例如本文提及的APC中的任一种)存在的情况下，将类似物添加给T细胞时，类似物抑制⑴的识别，即类似物能在这样的系统中与⑴竞争。类似物可以是能结合识别⑴的TCR的一种类似物。通过标准的技术，可以检测这样的结合。从已经表明能识别(i)的T细胞，可以分离这样的TCR(例如，使用本发明的方法)。然后，通过测定TCR是否抑制类似物与结合类似物的物质(例如，类似物的抗体) 的结合，可以证实类似物与TCR的结合，一般地，在这样的结合测定的抑制中，类似物结合于II类MHC分子(例如HLA-DQ2)。
1
一般地，类似物抑制(i)与TCR的结合。在该情况下，在有类似物存在下，可以结合TCR的⑴的量会减少。这是因为，类似物能结合TCR，并因此与⑴竞争结合TCR。从腹部疾病患者中，可以分离出在上面的结合实验中使用的T细胞，例如，在本发明的方法的辅助下。类似物的其它结合特征也可以与(i)相同，并且因而一般地，类似物结合与肽结合的相同的MHC II类分子(HLA-DQ2或-DQ8)。一般地，类似物结合对(i)特异性的抗体，并从而抑制(i)与这样的抗体的结合。一般地，类似物是肽。它可以与⑴具有同源性，一般地，与(i)具有至少70%同源性，优选地至少80、90%、95%、97%或99%同源性，例如，在至少7、8、9、10、11、12、13、14、 15或更多个邻接氨基酸的区域内(例如类似物和/或(i)的整个长度，或跨过接触TCR或结合MHC分子的区域)。测量蛋白同源性的方法是本领域众所周知的，且本领域的技术人员能理解，在上下文中，在氨基酸同一性(有时称作“硬同源性(hard homology)”)的基础上，计算同源性。例如，UWGCG包提供了 BESTFIT程序，其可以用于计算同源性(例如，在它的缺省设置下使用)(Devereux 等(1984) Nucleic Acids Research 12，p387_3%)。PILEUP 和 BLAST 算法可以用于计算同源性或比对序列(一般地，在它的缺省设置下)，例如，如Altschul S.F. (1993)J Mol Evol 36 :290-300 ；Altschul, S，F 等(1990)J Mol Biol215 :403-10 所述。在环球网上，通过因特网在例如“www. ncbi. nlm. nih. gov/”，可以从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开地得到进行 BLAST 分析的软件。该算法包含，首先通过鉴别查询序列中长为W的短字，其在与数据库序列中相同长度的字比对时，会匹配或满足一些正值阈分数T，来鉴别高分序列对(HSP)。T被称作相邻字分数阈(Altschul等，同上)。这些初步的相邻字命中值(hit)作为开始搜索的种子， 以发现含有它们的HSP。字命中值沿着每个序列向两方尽可能远地延伸，只要可以增加累积比对分数。在下述情况下，终止字命中值在每个方向的延伸累积比对分数从它达到的最大值下降量X ；由于一个或多个负分数残基比对的积累，累积分数达到0或以下；或达到任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定着比对的敏感度和速度。BLAST程序使用下述缺省值字长度(W)为11，BL0SUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff (199 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919)比对(B)为 50，期望(E)为 10，M = 5，N = 4，且对比两条链。BLAST算法进行两个序列之间的相似性的统计学分析；见例如，Karlin和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。BLAST 算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，其指示着两个核苷酸或氨基酸序列偶然发生匹配的概率。 例如，如果在将第一个序列与另一个序列相比较时，最小总和概率小于约1，优选地小于约 0. 1，更优选地小于约0. 01，且最优选地小于约0. 001，则认为序列与另一个序列类似。一般地，同源的肽类似物与(i)的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8或更多个突变(其可以是取代、缺失或插入)。关于计算同源性，可以跨过上述区域中的任一个，测量这些突变。取代优选地是“保守的”。根据下表，定义它们。在第二列的相同单元中的氨基酸，且优选地在第三列的相同行中的氨基酸，可以彼此取代。
权利要求
1.试剂在制备用于治疗或预防腹部疾病的药物中的用途，其中所述试剂包含(a)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自转谷氨酰胺酶脱酰胺的SEQID NO 1787的序列，和其等价物；和(b)(a)的类似物，其能被识别(a)的肽的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸。
2.权利要求1的用途，其中所述肽包含选自SEQID NOS 1787、1793、1794、1796和1797的表位。
3.权利要求1的用途，其中所述试剂是HLA-DQ2-限制的。
4.权利要求1的用途，其中所述试剂是HLA-DQ8-限制的。
5.权利要求1的用途，其中一种试剂是HLA-DQ2-限制的，且第二种试剂是HLA-DQ8-限制的。
6.权利要求1的用途，其中所述试剂包含小麦表位。
7.权利要求1的用途，其中所述试剂包含燕麦表位。
8.权利要求1的用途，其中一种试剂包含小麦表位，且一种试剂包含燕麦表位。
9.权利要求1的用途，其中所述试剂存在于药物组合物中，所述组合物包含药学上可接受的载体或稀释剂。
10.如权利要求1所定义的试剂的用途，用于通过抑制对所述试剂的抗体或T细胞反应使个体耐受谷蛋白。
11.如权利要求1所定义的试剂，其任选地与载体相结合，以用于通过使识别试剂的T 细胞耐受来治疗或预防腹部疾病的方法中。
12.具有如权利要求1所定义的T细胞受体的T细胞的拮抗剂，其任选地与载体相结合，以用于通过拮抗这样的T细胞来治疗或预防腹部疾病的方法中。
13.如权利要求1所定义的试剂，其用于通过使个体耐受以预防结合所述试剂的抗体的生产，来治疗或预防个体的腹部疾病的方法中。
14.如权利要求1所定义的试剂。
15.如权利要求9所定义的拮抗剂。
16.药物组合物，其包含如权利要求1所定义的试剂或如权利要求9所定义的拮抗剂和药学上可接受的载体或稀释剂。
17.组合物，其用于使个体耐受谷蛋白，以抑制生成对如权利要求1所定义的试剂的T 细胞或抗体反应，所述组合物包含如权利要求1所定义的试剂。
18.组合物，其用于拮抗对如权利要求1所定义的试剂的T细胞反应，所述组合物包含如权利要求9所定义的拮抗剂。
19.试剂在制备用于诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法中的诊断工具中的用途，所述试剂选自i)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自转谷氨酰胺酶脱酰胺的SEQID NO 1787的序列，和其等价物；和ii)(i)的类似物，其能被识别(i)的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸； 且所述方法包含，测定(a)个体的T细胞是否识别该试剂，其中T细胞的识别指示着该个体患有或易感腹部疾病；或(b)来自个体的样品中结合表位的抗体的存在，其中所述抗体的存在指示着该个体患有或易感腹部疾病。
20.根据权利要求19的用途，其中所述试剂是类似物(iii)，其包含结合到(a)HLA分子或(b)能结合⑴或(ii)的HLA分子的片段上的⑴或(ii)。
21.根据权利要求20的用途，其中所述HLA分子或片段是在复合物中，所述复合物包含 4个HLA分子或HLA分子的片段。
22.根据权利要求19-21中的任一项的用途，其中所述方法包含，给个体的皮肤施用试剂，和检测炎症在施用部位的存在，其中炎症的检测指示着个体的T细胞识别该试剂。
23.根据权利要求19-21中的任一项的用途，其中所述方法包含使所述试剂与来自宿主的样品接触。
24.根据权利要求23的用途，其中所述样品是血液样品。
25.根据权利要求20、21、23或对的用途，其中在所述测定之前，未以抗原特异性的方式体外地再次刺激T细胞。
26.根据权利要求25的用途，其中通过检测T细胞对细胞因子的分泌，来确定T细胞对试剂的识别。
27.根据权利要求沈的用途，其中所述细胞因子是IFN-Y。
28.根据权利要求沈或权利要求27的用途，其中通过允许细胞因子结合固定化的对该细胞因子特异性的抗体，且然后检测抗体/细胞因子复合物的存在，来检测细胞因子。
29.根据权利要求25的用途，其中所述测定是通过测量试剂是否结合T细胞受体来完成的。
30.鉴别如权利要求19、20或21中所定义的类似物的体外方法，其包含测定候选物质是否能被τ细胞受体识别，所述T细胞受体识别包含如权利要求19所定义的序列的表位， 其中该物质的识别指示着该物质是类似物。
31.测定组合物是否能造成腹部疾病的体外方法，其包含测定组合物中是否存在能被转谷氨酰胺酶修饰成如权利要求19所定义的寡肽序列的蛋白，其中该蛋白的存在指示着该组合物能造成腹部疾病。
32.根据权利要求31的体外方法，其中如下完成所述测定使组合物接触对能被修饰成寡肽序列的序列特异性的抗体，其中抗体与组合物中蛋白的结合，指示着该组合物能造成腹部疾病。
33.鉴别T细胞的拮抗剂的体外方法，所述T细胞识别如权利要求1所定义的试剂，所述方法包含使候选物质接触T细胞，和检测该物质是否造成T细胞经历抗原特异性的反应的能力的降低，其中所述能力的任何这样的降低的检测，指示着物质是拮抗剂。
34.试剂盒，其用于实现根据权利要求19-29中的任一项的用途，其包含如权利要求 19,20或21所定义的试剂和用于检测下述中任一个的工具(a)T细胞对肽的识别；或(b)识别所述试剂的抗体。
35.根据权利要求34的试剂盒，其中用于检测T细胞对肽的识别的工具包含IFN-Y的抗体。
36.根据权利要求35的试剂盒，其中所述抗体固定化在固体支持物上，且任选地该试剂盒也包含用于检测抗体/IFN-γ复合物的工具。
37.如权利要求1所定义的试剂在生产对试剂特异性的抗体中的用途。
38.对如权利要求1所定义的试剂特异性的抗体。
全文摘要
此处公开的本发明涉及在诊断、治疗和预防腹部疾病的方法中使用的表位。提供了包含至少一种表位的治疗组合物。
文档编号A61K38/00GK102430111SQ20111037877
公开日2012年5月2日 申请日期2005年4月28日 优先权日2004年4月28日
发明者J·T·丁, R·安德森, T·贝斯巴思 申请人:英国技术集团国际有限公司