专利名称：一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种超抗原融合蛋白及制备方法及用途，特别是涉及一种癌靶向超抗原及其突变体融合蛋白及制备方法及用途。
背景技术：
超抗原融合蛋白被应用于癌症的药物研究，例如细胞因子与超抗原构建的融合蛋白(中国专利申请号2003101098 . 7，“一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产方法”；中国专利申请号201010118438. 1，“细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用”；中国专利申请号201010585818. 6，“细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用”;PLoSOne 6，el6642，2011)、激素与超抗原构建的融合蛋白(中国专利申请号200510078775. 1 “癌靶向超抗原融合蛋白质及其生产方法”)和抗体与超抗原构建的融合蛋白(Proc Natl Acad Sci USA, 91,8945-8949,1994 ；Proc Natl Acad Sci USA, 92, 9791-9795，1995)，细胞因子-超抗原融合蛋白中的细胞因子和激素_超抗原融合蛋白中的激素是通过与癌细胞上大量表达的细胞因子受体和激素受体的相互作用而将融合蛋白定位到癌细胞上，而融合蛋白的另一部分即超抗原可诱导攻击癌细胞的T细胞反应的细胞毒作用。
上述超抗原是金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal-enterotoxin A, SEA)，它会产生全身性淋巴细胞的反应的副作用，有研究(Proc Natl Acad Sci USA, 94, 2489-2494,1997)对它进行了一个点突变的改造。另外，据报道SEA本身也不稳定(J Biol Chem，275，1665-1672，2000)。要提高超抗原融合蛋白的抗癌效果，可以选择除了 SEA以为的新超抗原。
另外，有活性的有利用价值的物质例如化合物、核酸、多肽等都可以通过改造它们的结构而提高其活性或利用价值，以酶为例，可以通过大规模多点突变、片段置换、氨基酸去除或增加等手段来提高酶的催化活性、耐热、耐低温、耐酸、耐碱、耐有机溶剂等。所以通过对超抗原大规模的点突变改造，期待创造出生物活性更高的超抗原。发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供生物活性更高的一种癌靶向超抗原融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种超抗原融合蛋白的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种超抗原融合蛋白的用途。
本发明的技术方案概述如下
一种癌靶向超抗原融合蛋白，该融合蛋白含有
a)促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相互作用的配体，所述配体是细胞因子、激素或非抗体非细胞因子非激素的多肽；
b)能引起抗癌免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素E (Staphylococcal-enterotoxin Ε, SEE)及其突变体，所述金黄色葡萄球菌肠毒素E用缩写SEE表示；所述金黄色葡萄球菌肠毒素E的突变体用缩写SEE-X表示，所述X = 1-3。
所述细胞因子选自缩写为TGF- α的转化生长因子- α (Transforming growth factor- α，TGF- α)、缩写为 EGF 的表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)、 缩写为VEGF的血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor, VEGF)；所述激素选自缩写为GnRH的促性腺激素释放激素(Gonadotrop in-re leas Ing hormone, GnRH)；所述非抗体非细胞因子非激素的多肽选自缩写为GRP的促胃液素释放肽 (Gastrin-releasing peptide, GRP)。
所述SEE是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；所述SEE-I是SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列；所述SEE-2是SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列；所述SEE-3是SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列。
所述SEE-I是SEE上的20位、21位、24位、27位、34位、39位、40位、1位、42位、 44 位、49 位、74 位、75 位、78 位、79 位、81 位、83 位、84 位、217 位、220 位、222 位、223 位、225位、227位上的一个或多个氨基酸被替换。
所述SEE-2是SEE上的20位、21位、24位、27位、34位、35位、39位、40位、41位、 42 位、44 位、45 位、46 位、49 位、74 位、75 位、78 位、79 位、81 位、83 位、84 位、188 位、190 位、 217位、219位、220位、222位、223位、2 位、225位、227位上的一个或多个氨基酸被替换。
所述SEE-3是SEE上的20位、21位、24位、27位、34位、35位、36位、39位、40位、 41位、42位、44位、45位、46位、49位、62位、74位、75位、77位、78位、79位、81位、83位、 84 位、188 位、190 位、217 位、218 位、219 位、220 位、221 位、222 位、223 位、224 位、225 位、 227位上的一个或多个氨基酸被替换。
所述该融合蛋白为由SEQ ID No. 10所示的TGF- α -SEE ；由SEQ ID No. 18所示的 EGF-SEE ；由 SEQ ID No. 26 所示的 VEGF-SEE ；由 SEQ ID No. 34 所示的 GnRH-SEE ；由 SEQ ID No. 42 所示的 GRP-SEE ；由 SEQ ID No. 12 所示的 TGF-α -SEE-I ；由 SEQ ID No. 20 所示的 EGF-SEE-I ；由 SEQ ID No. 28 所示的 VEGF-SEE-I ；由 SEQ ID No. 36 所示的 GnRH-SEE-I ； 由 SEQ ID No. 44 所示的 GRP-SEE-1 ；由 SEQ ID No. 14 所示的 TGF- α -SEE-2 ；由 SEQ ID No. 22 所示的 EGF-SEE-2 ；由 SEQ ID No. 30 所示的 VEGF-SEE-2 ；由 SEQ ID No. 38 所示的 GnRH-SEE-2 ；由 SEQ ID No. 46 所示的 GRP-SEE-2 ；由 SEQ ID No. 16 所示的 TGF-α -SEE-3 ； 由 SEQ ID No. 24 所示的 EGF-SEE-3 ；由 SEQ ID No. 32 所示的 VEGF-SEE-3 ；由 SEQ ID No. 40 所示的 GnRH-SEE-3 ；或由 SEQ ID No. 48 所示的 GRP-SEE-3。
重组载体，含有编码权利要求7所述融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码SEQ ID No. 10的核苷酸序列SEQ ID No. 9 ；编码SEQ ID No. 12的核苷酸序列SEQ ID No. 11 ；编码SEQ ID No. 14的核苷酸序列SEQ ID No. 13 ；编码SEQ ID No. 16的核苷酸序列 SEQ ID No. 15 ；编码 SEQ ID No. 18 的核苷酸序列 SEQ ID No. 17 ；编码 SEQ ID No. 20 的核苷酸序列 SEQ ID No. 19 ；编码 SEQ ID No. 22 的核苷酸序列 SEQ ID No. 21 ；编码 SEQ ID No. 24 的核苷酸序列SEQ ID No. 23 ；编码SEQ ID No. 26的核苷酸序列SEQ ID No. 25 ；编码SEQ ID No. 28的核苷酸序列SEQ ID No. 27 ；编码SEQ ID No. 30的核苷酸序列SEQ ID No. 29 ； 编码SEQ ID No. 32的核苷酸序列SEQ ID No. 31 ；编码SEQ ID No. 34的核苷酸序列SEQ ID No. 33 ；编码SEQ ID No. 36的核苷酸序列SEQ ID No. 35 ；编码SEQ ID No. 38的核苷酸序列SEQ ID No. 37;编码 SEQ ID No. 40 的核苷酸序列 SEQ ID No. 39;编码 SEQ ID No. 42 的核苷酸序列 SEQ ID No. 41 ；编码 SEQ ID No. 44 的核苷酸序列 SEQ ID No. 43 ；编码 SEQ ID No. 46 的核苷酸序列SEQ ID No. 45 ；或编码SEQ ID No. 48的核苷酸序列SEQ IDNo. 47所示。
一种癌靶向超抗原融合蛋白的制备方法，培养含有上述重组载体的宿主细胞，收集表达一种癌靶向超抗原融合蛋白。
一种癌靶向超抗原融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。
本发明的优点
超抗原SEE 要比 SEA 更稳定(J Biol Chem, 275,1665-1672，2000)，而经过大规模多点突变的改造后的SEE突变体SEE-I、SEE-2和SEE-3降低了与MHC的相互作用，所以由 SEE突变体与TGF- α、EGF、VEGF, GnRH或GRP所组成的融合蛋白表现出很高的抗癌和抗肿瘤的生物活性。
图1是TGF-α与SEE或SEE突变体组成融合蛋白抑制S180肿瘤生长，表示的是肿瘤生长曲线和小鼠解剖后的肿瘤重量。
图2是EGF与SEE或SEE突变体组成融合蛋白抑制S180肿瘤生长，表示的是肿瘤生长曲线和小鼠解剖后的肿瘤重量。
图3是VEGF与SEE或SEE突变体组成融合蛋白抑制S180肿瘤生长，表示的是肿瘤生长曲线和小鼠解剖后的肿瘤重量。
图4利用免疫组化检测到的T细胞，棕色小点是T细胞。(图中4-1为 TGF- α -SEE-3 给药组；4-2 为 EGF-SEE-3 给药组；4-3 为 VEGF-SEE-3 给药组)
图5利用免疫组化检测到的由T细胞分泌的干扰素-Y (IFN-γ)，棕色部分是 IFN- Y。(图中5-1 为 TGF- α -SEE-3 给药组；5-2 为 EGF-SEE-3 给药组；5-3 为 VEGF-SEE-3 给药组)
图6是6nRH与SEE或SEE突变体组成融合蛋白杀伤H印G2肝癌细胞。
图7是GRP与SEE或SEE突变体组成融合蛋白杀伤A549肺癌细胞。
图8显示的是被T细胞攻击的癌细胞，大细胞是癌细胞，小细胞是T细胞。(图中 8-1 为 GnRH-SEE-3 组；8-2 为 GRP-SEE-3 组)具体实施方式
本发明的战略思想如下
通过一个点突变虽然可以提高SEA的性能，但是寻找一个比SEA更好的超抗原并进行蛋白的多点突变的结构构造则能够大幅度提高超抗原的生物活性，取得更好的癌症治疗效果。
金黄色葡萄球菌由来的超抗原有SEA、SEB、SEC、SED, SEF, SEG, SEH、SEI, SEJ 等，它们在结构上有一定的相似性(Infect Immun，66，3337-3348，1998)，所以它们的空间结构也可以相互参考，例如 SEA (EMBO J, 14,3292-3301,1995 J Biol Chem, 271, 32212-32216，1996 J Mol Biol,269,270-280，1997 ；Structure,10，1619-1626，2002)、SEB 和 SEC(Nature, 368, 711-718,1994 ；Nature,384,188-192,1996 ;J Mol Biol，277，61-79，1998 ；Structure, 11,1151-1161, 2003), SHE(EMB0 J，20，3306-3312，2001 ；J Mol Biol, 302，527-537，2000)，以及其它有关文献(Nature, 346,471-473,1990 ；Infect Immun,59, 2126-2134,1991 ;J Exp Med，175，415-424，1992 ；Proc Natl Acad Sci USA，89，7727-7731， 1992 J Exp Med,177,175-184,1993 ；Infect Immun，61，2059-2068，1993 ;J Biol Chem, 275，1665-1672,2000 ；Trends Microbiol，8，369-375，2000 ；Immunity,14，331-344，2001 ； Clin Exp Immunol，133，299-306，2003 ;J Mol Biol，333，893-905，2003 ;J Biol Chem,278, 50412-50421,2003 ；Scand J Immunol,59,345-355, 2004 ；Semin Immunol，19，262-271， 2007)，超抗原包括SEE和SEA中的20-27氨基酸片段被认为是与T细胞上的TCR相互作用， 从而激活T细胞；34-49、74-84、187-190和217-227等氨基酸片段被认为是与组织相容性抗原MHC相互作用。通过这些信息可以寻找一个比SEA更有效的超抗原并通过大范围的多点突变来提高它的生物活性。
首先本发明选择SEE，它与SEA相比有着很大的相似性但比SEA更稳定(J Biol Chem，275，1665-1672，2000)，在SEE的氨基酸序列中可以引入大规模多点突变，点突变的依据是
1.加强TCR的结合能力，强化超抗原与TCR的作用就可以提高超抗原诱导T细胞的能力，在这里可以考虑采用在SEA相同位置上的氨基酸。
2.降低与组织相容性抗原MHC的结合能力，超抗原SEE与组织相容性抗原MHC的相互作用如同抗体与多肽抗原相互作用类似，是互补的相互作用。其作用的方式为
1)极性氨基酸的相互作用，即超抗原中的酸性氨基酸与组织相容性抗原中的碱性氨基酸的相互作用，或者超抗原中的碱性氨基酸与组织相容性抗原中的酸性氨基酸的相互作用；
2)非极性亲水氨基酸的相互作用，即超抗原和组织相容性抗原中的非极性亲水氨基酸之间的相互作用；
3)非极性疏水性氨基酸的相互作用，即超抗原和组织相容性抗原中的非极性疏水性氨基酸之间的相互作用；
4)上面1-3的氨基酸的相互作用需要合适的空间，即氨基酸的侧链长度适当，人为改变上面相互作用的氨基酸的长度也可以降低这些氨基酸的相互作用。
所以，通过改变超抗原与组织相容性抗原相互作用区域的氨基酸的性质，例如改变超抗原中的与组织相容性抗原相互作用的氨基酸的极性和长度等可以降低或减弱超抗原与组织相容性抗原之间的相互作用。
虽然本发明在下面的实施例1中披露了点突变的位置，实际上还可以在这些位置或其旁边的位置上引入其它类似的理化性质的氨基酸，也可以获得相似的结果。
作为改进型超抗原融合蛋白的另一部分选自与癌细胞表面上大量表达的受体 (Receptor)相互作用的配体(Ligand)，例如细胞因子、激素或非抗体非细胞因子非激素的多肽，在本发明中，细胞因子为TGF- α、EGF或VEGF，激素&iRH，非抗体非细胞因子非激素的多肽为GRP。
超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素E的超抗原SEE，为SEQ ID No. 2所示；
超抗原为经过多点突变改造的SEE突变体，其中突变体SEE-I为SEQ ID No. 4所示，突变体SEE-2为SEQ ID No. 6所示，突变体SEE-3为SEQ ID No. 8所示；
所述的多点突变发生在20位、21位、M位、27位、34位、35位、36位、39位、40位、 41位、42位、44位、45位、46位、49位、62位、74位、75位、77位、78位、79位、81位、83位、 84 位、188 位、190 位、217 位、218 位、219 位、220 位、221 位、222 位、223 位、224 位、225 位、 227 位；
所述的多点突变的氨基酸是，在20位上，Arg — Gly ；在21位上，Asn — Thr ；在 24 位上，Ser — Gly ；在 27 位上，Arg — Lys ；在 34 位上，Glu — Ser 或 Glu — Ala ；在 35 位上，Lys — Ser ；在 36 位上，Ala — Gly ；在 39 位上，Glu — Ser ；在 40 位上，Asn — Ser 或 Asn — Ala ；在 41 位上，Lys — Glu ；在 42 位上，Glu — Lys ；在 44 位上，Asp — Ala 或 Asp — Ser ；在 45 位上，Asp — Ala ；在 46 位上，Gln — Ser ；在 49 位上，Glu — Thr 或 Glu^Ser ；在62位上，Pro — kr ；在74位上，Lys — Thr 或Lys — kr ；在75位上，Asp —Ala 或 Asp — Thr ；在 77 位上，Thr — Ser ；在 78 位上，Asn — Ser ；在 79 位上，Lys — Glu ；在 81 位上，Lys — Glu ；在 83 位上，Lys — Ser ；在 84 位上，Lys — Ser 或 Lys — Thr ；在 188 位上，Ser — Thr ；在 190 位上，Glu — Thr ；在 217 位上，Lys — Thr 或 Lys — Ser ；在 218 位上，Thr — Ser ；在 219 位上，Ile — Leu ；在 220 位上，Asn — Ser ；在 221 位上，Ser — Thr ； 在 222 位上，Glu — Thr 或 Glu — Ser ；在 223 位上，Asn — Ser ；在 2 位上，Leu — Ile ；在 225 位上，His — Ser ；在 227 位上，Asp — Ser0
本发明利用与癌细胞受体相互作用的配体-改进型超抗原融合蛋白质，其中与癌细胞受体相互作用的配体例如细胞因子、激素或非抗体非细胞因子非激素的多肽可以将融合蛋白质定位到肿瘤细胞上，而改进型超抗原则在肿瘤细胞周围引起更加强大的抗癌免疫反应，即超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(Superantigen-d印endent-cellular-cytot oxicity, SDCC)。利用此方法就可以将这种类型的融合蛋白质特异地定位到肿瘤细胞上并在肿瘤细胞周围弓I起抗癌的细胞毒免疫反应。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实验用癌细胞株作为本发明实施例中所使用的癌细胞株是用于建立小鼠荷瘤模型的小鼠肉瘤肿瘤Sarcoma(S180)肿瘤细胞、人肝癌细胞H印G2和人肺癌细胞A549，这些癌细胞株购自ATCC。
已有报道小鼠的S180癌细胞上的EGF受体EGFR和VEGF受体VEGFR可与人来源的 EGF 和 VEGF 相互作用(PLoS One 6，el6642，2011 ；中国专利申请号 201010118438. 1，“细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用”)，而TGF- α的受体与EGF相同，都是EGFRJjfW S180癌细胞可用于TGF、EGF或VEGF与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的实验。
肝癌细胞表达GnRH 的受体 GnRH-R (Endocrinology，136，75-84，1995 ；Cancer Res，60，3701-3705，2000)，所以H印G2癌细胞可用于GnRH与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的实验。
肺癌细胞表达GRP 的受体 GRP-R(Oncogene，20，1563-1569，2001 ；Ann Oncol, 18, 1457-1466,2007)，所以A549癌细胞可用于GRP与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的实验。
实施例1设计SEE的突变体
由于SEA与SEE在序列上有着很大的相似性Qnfect Immun, 66, 3337-3348, 1998)，所以SEA以及其它超抗原的空间结构的研究等可以作为SEE的参考(ΕΜΒ0 J，14，,1995 J Biol Chem,271,32212-32216,1996 J Mol Biol，269，270-280，1997 ； Structure,10，1619-1626，2002 ；Nature,368,711-718,1994 ；Nature,384,188-192，1996 ； J Mol Biol,277,61-79,1998 ；Structure,11,1151-1161,2003 ；EMBO J，20，3306-3312， 2001 J Mol Biol，302，527-537，2000)，另外也参考有关文献(Nature，;346，471-473，1990 ； Infect Immun，59，2126-2134，1991 ;J Exp Med,175,415-424,1992 ；Proc Natl Acad Sci USA,89,7727-7731,1992 ;J Exp Med,177,175-184,1993 ；Infect Immun,61,2059-2068, 1993 J Biol Chem,275,1665-1672, 2000 ；Trends Microbiol,8,369-375, 2000 ；Immunity, 14，331-344，2001 ;Clin Exp Immunol,133，299-306，2003 ;J Mol Biol，333，893-905， 2003 ；J Biol Chem,278,50412-50421,2003 ；Scand J Immunol，59，345-355，2004 ; Semin Immunol，19，262-271，2007)，通过这些信息以及 SEE 基因信息(J Bacteriol，170， 2954-2960,1988 ；GenBank, M21319)来确定SEE点突变的位置，可考虑的点突变的位置在 SEE中的20-27、；34-49、74-84、187-190和217-227的氨基酸片段中，设计如下
1.采用SEA中的与TCR结合的氨基酸片断，因为SEA有着很强大的诱导T细胞的能力(Proc Natl Acad Sci USA,91,8945-8949,1994 ；Proc Natl Acad Sci USA,92, 9791-9795，1995)，这里设计了 SEE序列中的20-27位置的4个氨基酸的点突变在20位上，Arg — Gly ；在 21 位上，Asn — Thr ；在 M 位上，Ser — Gly ；在 27 位上，Arg — Lys0 所有SEE的突变体(SEE-1、SEE-2和SEE-3)在这个区域上的点突变都相同。
2.减少与组织相容性抗原MHC的结合，将酸性或碱性氨基酸变成极性中性氨基酸 (Ser或Thr)或非极性疏水性氨基酸(Ala)或者改变其极性的性质(碱性氨基酸变成酸性氨基酸或者酸性氨基酸变成碱性氨基酸)或者改变氨基酸的侧链长度。
2. 1. SEE-I突变体的设计
在；34位上，Glu — Ser ；在 39 位上，Glu — Ser ；在 40 位上，Asn — Ser ；在 41 位上， Lys - Glu ；在 42 位上，Glu —Lys ；在 44 位上，Asp — Ala ；在 49 位上，Glu — Thr ；在 74 位上，Lys —Thr ；在 75 位上，Asp — Ala ；在 78 位上，Asn — kr ；在 79 位上，Lys — Glu ；在 81 位上，Lys — Glu ；在 83 位上，Lys — Ser ；在 84 位上，Lys — Ser ；在 217 位上，Lys — Thr ； 在 220 位上，Asn — kr ；在 222 位上，Glu — Thr ；在 223 位上，Asn — kr ；在 225 位上， His — Ser ；在227位上，Asp — Ser。最后得到SEE-I的氨基酸序列(SEQ ID N0. 4)。
2. 2. SEE-2突变体的设计
在；34位上，Glu — Ser ；在；35 位上，Lys — Ser ；在 39 位上，Glu — Ser ；在 40 位上， Asn — Ser ；在 41 位上，Lys — Glu ；在 42 位上，Glu — Lys ；在 44 位上，Asp — Ser ；在 45 位上，Asp — Ala ；在 46 位上，Gln — Ser ；在 49 位上，Glu — Thr ；在 74 位上，Lys — Thr ；在 75 位上，Asp — Ala ；在 78 位上，Asn — kr ；在 79 位上，Lys — Glu ；在 81 位上，Lys — Glu ；在 83 位上，Lys —kr ；在 84 位上，Lys — kr ；在 188 位上，Ser — Ilir ；在 190 位上，Glu — Ilir ； 在 217 位上，Lys — Ser ；在 219 位上，Ile — Leu ；在 220 位上，Asn — Ser ；在 222 位上， Glu — Thr ；在 223 位上，Asn — Ser ；在 2 位上，Leu — Ile ；在 225 位上，His — Ser ；在 227位上，Asp — Ser。最后得到SEE-2的氨基酸序列(SEQ ID N0. 6)。
2. 3. SEE-3突变体的设计
在；34位上，Glu — Ala ；在；35 位上，Lys — Ser ；在 36 位上，Ala — Gly ；在 39 位上， Glu — Ser ；在 40 位上，Asn — Ala ；在 41 位上，Lys — Glu ；在 42 位上，Glu — Lys ；在 44 位上，Asp — Ser ；在 45 位上，Asp — Ala ；在 46 位上，Gln — kr ；在 49 位上，Glu — kr ；在 62 位上，Pro — Ser ；在 74 位上，Lys — Ser ；在 75 位上，Asp — Thr ；在 77 位上，Thr — Ser ；在 78 位上，Asn — Ser ；在 79 位上，Lys — Glu ；在 81 位上，Lys — Glu ；在 83 位上，Lys — Ser ； 在 84 位上，Lys — Thr ；在 188 位上，Ser — Thr ；在 190 位上，Glu — Thr ；在 217 位上， Lys ^ Ser ；在 218 位上，Thr — kr ；在 219 位上，Ile — Leu ；在 220 位上，Asn — kr ；在 221 位上，Ser — Thr ；在 222 位上，Glu — kr ；在 223 位上，Asn — kr ；在 224 位上，Leu — Ile ； 在225位上，His — Ser ；在227位上，Asp — Ser0最后得到SEE-3的氨基酸序列(SEQ ID NO. 8)。
实施例2超抗原及其突变体表达载体的构建
编码SEE的DNA核酸序列来源于其基因信息(J Bacteriol，170,2954-2960,1988 ； GenBank数据库，M21319)，而突变体是根据实施例1的设计，委托TAKARA公司合成DNA片段，它包括SEE基因或它的突变体的序列片段以及一个连接肽(由SEQ ID NO. 50所示)和在整个片断的前面HindIII及后面B10I限制酶切点的几个碱基，将合成好的核酸片段分别插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用HindIII和B10I处理后，把片段分别插入pET22b质粒上，获得了表达SEE基因的载体pET22b-SEE以及SEE的突变体的载体pET22b-SEE-l、pET22b-SEE-2和pET22b_SEE_3。由这些载体表达的相应的蛋白序列， SEE 为 SEQ ID NO. 2 所示，SEE-1 为 SEQ ID NO. 4 所示，SEE-2 为 SEQ ID N0. 6 所示，SEE-3 为 SEQ ID N0. 8 所示。
编码SEE的核酸序列为SEQ ID NO. 1所示，编码SEE-1的核酸序列为SEQ ID N0. 3 所示，编码SEE-2的核酸序列为SEQ ID N0. 5所示，编码SEE-3的核酸序列为SEQ ID N0. 7 所示。
编码连接肽的核酸序列为SEQ ID N0. 49所示。
实施例3TGF- α与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据GenBank数据库的人来源的TGF-α基因的信息(ΝΜ_003236)，委托TAKARA 公司合成一个核酸序列片段包括TGF-α基因及在TGF-α前面再增加限制内切酶位点 BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 MlI和HindIII的限制内切酶位点。 将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用 BamHI和HindIII处理后，把这个片段分别插入实施例2中的pET22b_SEE、pET22b_SEE_l、 pET22b-SEE-2 和 pET22b_SEE_3 的载体，这样就产生了表达载体 pET22b_TGF_ α -SEE、 pET22b-TGF-a-SEE-1、pET22b-TGF-a-SEE-2 禾口 pET22b-TGF-a-SEE-3，可表达 TGF- a -SEE(SEQ ID NO. 10),TGF- a-SEE-1(SEQ ID NO. 12),TGF- a-SEE-2(SEQ ID NO. 14) 和 TGF-a-SEE-3 (SEQ ID NO. 16)融合蛋白。
实施例4EGF与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据GenBank数据库的人来源的EGF基因的信息(NM_001963和NM_001178130)， 委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括EGF基因及在EGF前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Mil和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用 BamHI和HindIII处理后，把这个片段分别插入实施例2中的pET22b_SEE、pET22b_SEE_l、 pET22b-SEE-2 和 pET22b_SEE_3 的载体，这样就产生了表达载体 pET22b_EGF_SEE、pET22b-EGF-SEE-l、pET22b-EGF_SEE_2 和 pET22b-EGF_SEE_3，可表达 EGF_SEE(SEQ ID NO. 18)、EGF-SEE-I (SEQ ID NO. 20)、EGF-SEE-2 (SEQ ID NO. 22)禾口 EGF-SEE-3 (SEQ ID NO. 24)融合蛋白。
实施例5VEGF与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据GenBank数据库的人来源的VEGF基因的信息(NM_003376)以及参考论文 (J. Biol. Chem. ,266,11947-11954，1991)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括 VEGF基因(121个氨基酸)及在VEGF前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Mil和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段分别插入实施例 2 中的 pET22b-SEE、pET22b-SEE-l、pET22b-SEE-2 和 pET22b_SEE_3 的载体，这样就产生了表达载体 pET2^-VEGF-SEE、pET22b-VEGF-SEE-U pET22b-VEGF_SEE_2 和 pET22b-VEGF-SEE-3，可表达 VEGF-SEE (SEQ ID NO. 26), VEGF-SEE-I (SEQ ID NO. 28), VEGF-SEE-2 (SEQ ID NO. 30)和 VEGF-SEE-3 (SEQ ID NO. 32)融合蛋白。
实施例6GnRH与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据GenBank数据库的人来源的GnRH基因的信息(NM_021081和NM_000825等)， 委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括&iRH基因及在&iRH前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Mil和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用 BamHI和HindIII处理后，把这个片段分别插入实施例2中的pET22b_SEE、pET22b_SEE_l、 pET22b-SEE-2 和 pET22b_SEE_3 的载体，这样就产生了表达载体 pET22b_GnRH_SEE、 pET22b-GnRH-SEE-l、pET22b-GnRH-SEE-2 和 pET22b-GnRH-SEE_3，可表达 GnRH-SEE (SEQ ID NO. 34)、GnRH-SEE-I (SEQ ID NO. 36)、GnRH-SEE-2 (SEQ ID NO. 38)和 GnRH-SEE-3 (SEQ ID NO. 40)融合蛋白。
实施例7GRP与SEE或SEE突变体组成融合蛋白的表达载体的构建
根据GenBank数据库的人来源的GRP基因的信息(NM_002091、NM_001012512 和NM_001012513等)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括GnRH基因及在GnRH 前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 MlI和 HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段分别插入实施例2中的 pET22b-SEE、pET22b_SEE_l、pET22b_SEE_2 和 pET22b_SEE_3 的载体，这样就产生了表达载体 pET22b-GRP-SEE、pET22b_GRP_SEE-l、pET22b-GRP_SEE_2 和 pET22b-GRP_SEE_3，可表达 GRP-SEE (SEQ ID NO. 42)、GRP-SEE-1 (SEQ ID NO. 44)、GRP-SEE-2 (SEQ ID NO. 46)和 GRP-SEE-3 (SEQ ID NO. 48)融合蛋白。
实施例8各种融合蛋白的表达、变性和复性以及纯化
将各种表达质粒pET22b-TGF_a-SEE、pET22b-TGF_a-SEE-1、 pET22b-TGF-a -SEE-2、pET22b_TGF_a -SEE-3、pET22b_EGF_SEE、pET22b_EGF_SEE_l、 pET22b-EGF-SEE-2、pET22b_EGF_SEE_3、pET22b_VEGF_SEE、pET22b_VEGF_SEE_l、 pET22b-VEGF-SEE-2、pET22b_VEGF_SEE_3、pET22b_GnRH_SEE、pET22b-GnRH-SEE_l、 pET22b-GnRH-SEE-2、pET22b-GnRH-SEE_3、pET22b_GRP_SEE、pET22b_GRP_SEE_l、pET22b-GRP-SEE-2和pET2^-GRP-SEE_3分别用电穿孔法转入大肠杆菌BL21 (DE3)，利用抗生素Amp(Ampicillin)筛选阳性菌。接下来各种蛋白的表达、变性和复性以及纯化的过程大致相同，操作如下
含有表达质粒的大肠杆菌BL21(DE!3)先进行大规模37°C培养，然后加入IPTG(I sopropylthio-β -D-galactoside)使之浓度达到ImM并过夜30°C培养，从而诱导表达蛋白。第2天离心培养液和收集菌体，用超声波法破细胞壁，离心收集包含体沉淀，这里的蛋白是以包含体形式存在。包含体蛋白用6M尿素变性溶解，然后进行多阶段透析，透析溶液是逐步稀释的尿素例如3M、2M和1M，接下来是0. 5M尿素，0. 4M L-精氨酸，375 μ M氧化型谷胱甘肽GSSG，1. 875mM还原型谷胱甘肽GSH，透析后进行离心，所得上清液就是蛋白的复性溶液。用His · Bind Purification Kit试剂盒(Novagen公司)对于蛋白进行纯化，先用Binding Buffer冲洗凝胶柱，同时也在蛋白溶液里加入Binding Buffer，将蛋白样品上柱，用Wash Buffer漂洗，然后用Elute Buffer洗脱，用蛋白质电泳进行鉴定，将纯度为一条带的蛋白用于以后的实验。这样得到各种高纯度融合蛋白TGF-α -SEE、TGF-α-SEE-U TGF-α -SEE-2, TGF-α -SEE-3, EGF-SEE, EGF-SEE-1, EGF-SEE-2, EGF-SEE-3, VEGF-SEE, VEGF-SEE-I、VEGF-SEE-2、VEGF-SEE-3、GnRH-SEE、GnRH-SEE-I、GnRH-SEE-2、GnRH-SEE-3、 GRP-SEE、GRP-SEE-I、GRP-SEE-2 和 GRP-SEE-3。
实施例9小鼠肿瘤形成实验
首先选择雄性ICR小鼠450只，4_5周，18_22g，小鼠肉瘤细胞S180是从ATCC购买， 先进行体外培养，再注射到ICR小鼠腹腔，进行体内大规模培养，最后，取出腹腔内的S180 细胞，将2xl06小鼠肉瘤细胞S180接种于ICR小鼠的右侧腋下。
实施例10TGF- α -SEE,TGF- α -SEE-UTGF- α -SEE-2 和 TGF- α -SEE-3 融合蛋白抑制小鼠肿瘤实验
取实施例9中的150只荷瘤小鼠，分成5组，每组30只，在接种肿瘤细胞后的第 2、4、6、8 天分别注射 TGF- α -SEE、TGF- α -SEE-U TGF- α -SEE-2 和 TGF- α -SEE-3 融合蛋白，剂量是IOOpmol，对照组只注射生理盐水，第9天杀死小鼠。结果显示TGF-α -SEE、 TGF- α -SEE-I、TGF- α -SEE-2和TGF- α -SEE-3对肿瘤的生长都有抑制作用，其中， TGF- α -SEE-2和TGF- α -SEE-3显示了更好的效果，肿瘤出现比其它组晚1_2天， TGF- α -SEE-3用药组第7天才出现很小的肿瘤(图1)。
实施例11EGF-SEE、EGF-SEE-1、EGF-SEE_2和EGF-SEE-3融合蛋白抑制小鼠肿瘤实验
取实施例9中的150只荷瘤小鼠，分成5组，每组30只，在接种肿瘤细胞后的第 2、4、6、8 天分别注射 EGF-SEE、EGF-SEE-1、EGF-SEE-2 和 EGF-SEE-3 融合蛋白，剂量是lOOpmol，对照组只注射生理盐水，第9天杀死小鼠。结果显示EGF-SEE、EGF-SEE-U EGF-SEE-2和EGF-SEE-3对肿瘤的生长都有抑制作用，其中，EGF-SEE-2和EGF-SEE-3显示了更好的效果，肿瘤出现比其它组晚1-2天，EGF-SEE-3用药组第7天才出现很小的肿瘤 (图 2)。
实施例12VEGF-SEE、VEGF-SEE-1、VEGF-SEE-2 和 VEGF-SEE-3 融合蛋白抑制小鼠肿瘤实验
取实施例9中的150只荷瘤小鼠，分成5组，每组30只，在接种肿瘤细胞后的第2、4、6、8 天分别注射 VEGF-SEE、VEGF-SEE-U VEGF-SEE-2 和 VEGF-SEE-3 融合蛋白，剂量是IOOpmol，对照组只注射生理盐水，第9天杀死小鼠。结果显示VEGF-SEE、VEGF-SEE-I、 VEGF-SEE-2和VEGF-SEE-3对肿瘤的生长都有抑制作用，其中，VEGF-SEE-2和VEGF-SEE-3 显示了更好的效果，肿瘤出现比其它组晚1-2天，VEGF-SEE-3用药组第7天才出现很小的肿瘤(图3)。
实施例13肿瘤组织内T淋巴细胞的检测
将实施例10-12中的经过各种融合蛋白给药小鼠的S180肿瘤组织以及对照组生理盐水的小鼠S180肿瘤组织切成小块，用石蜡包埋制成石蜡切片，然后进行免疫组织化学实验。为了检测肿瘤组织内的T细胞，使用Santa Cruz Biotechnolog公司的抗 CD3 抗体，然后用二抗以及 avidin-biotin-perxidase complex(Zymed 公司)，最后用 Diaminobenzidine(DAB)显色。图 4(图中4_1 为 TGF-α-SEE-3 给药组；4-2 为 EGF-SEE-3 给药组；4-3为VEGF-SEE-3给药组)只是由SEE-3组成的融合蛋白的实验结果，利用免疫组化方法检测到的T细胞，棕色小点是T细胞。
经实验TGF_α -SEE、TGF- α -SEE-U TGF- α -SEE-2、EGF-SEE, EGF-SEE-1、 EGF-SEE-2、VEGF-SEE, VEGF-SEE-I和VEGF-SEE-2融合蛋白的给药组的小鼠肿瘤组织内也都发现了 T细胞的存在。
实施例14肿瘤组织内干扰素-Y (IFN- y )的检测
采用与实施例13类似的免疫组织化学方法检测实施例10-12中的肿瘤组织内由 T细胞分泌的细胞因子IFN- γ，抗体是Santa Cruz Biotechnolog公司的抗IFN- γ抗体。 图 5 (图中5-1 为 TGF- α -SEE-3 给药组；5-2 为 EGF-SEE-3 给药组；5-3 为 VEGF-SEE-3 给药组)利用免疫组化检测到的由T细胞分泌的干扰素-γ (IFN-γ)，棕色部分是IFN-γ。
经实验TGF_α -SEE、TGF- α -SEE-U TGF- α -SEE-2、EGF-SEE, EGF-SEE-1、 EGF-SEE-2、VEGF-SEE, VEGF-SEE-I和VEGF-SEE-2融合蛋白的给药组的小鼠肿瘤组织内也都发现了由T细胞诱导的IFN- γ的存在。
实施例15小牛血清和融合蛋白的孵育实验
在癌细胞培养实验中所使用的高浓度的GnRH-SEE、GnRH-SEE-I、GnRH-SEE_2、 GnRH-SEE-3、GRP-SEE, GRP-SEE-U GRP-SEE-2 和 GRP-SEE-3 融合蛋白都用癌细胞培养的小牛血清稀释，然后在37°C下孵育5小时，以后所有癌细胞的实验中所使用的这些融合蛋白都经过小牛血清的孵育处理。这里的孵育实验是为了检验在小牛血清中的抵抗蛋白酶降解和热稳定等以及血清中的抗超抗原的基础性抗体(IgM和IgG等)的存在的情况下，融合蛋白的生物活性是不是发生变化。
实施例16GnRH-SEE、GnRH-SEE-I、GnRH-SEE-2、GnRH-SEE-3、GRP-SEE、GRP-SEE-1、 GRP-SEE-2和GRP-SEE-3融合蛋白的诱导T淋巴细胞活性
人外周血细胞购自天津血液中心，用Ficoll密度离心和尼龙毛柱方法取得T淋巴细胞(J Clin Invest，91，1490-1498，1993)，这些T细胞在6孔板上用DMEM培养基培养，并加入10%的小牛血清。每个孔有切105个T细胞，然后加入5pmol量的GnRH-SEE、 GnRH-SEE-I、GnRH-SEE-2, GnRH-SEE-3, GRP-SEE, GRP-SEE-U GRP-SEE-2 禾口 GRP-SEE-3 融合蛋白，这些蛋白都经过小牛血清的孵育，然后用enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)的IFN-γ试剂盒(R&D Systems公司)来检测培养基中的IFN-γ的含量。
表1 为分析 GnRH-SEE、GnRH-SEE-l、GnRH-SEE-2 和 GnRH-SEE-3 融合蛋白刺激 T 细胞的能力，检测的是细胞因子IFN-γ。
表1检测的是细胞因子IFN- y (pg/ml)
权利要求
1.一种癌靶向超抗原融合蛋白，其特征在于该融合蛋白含有a)促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相互作用的配体，所述配体是细胞因子、 激素或非抗体非细胞因子非激素的多肽；b)能引起抗癌免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素E及其突变体，所述金黄色葡萄球菌肠毒素E用缩写SEE表示；所述金黄色葡萄球菌肠毒素E的突变体用缩写SEE-X表示，所述X = 1-3。
2.根据权利要求1所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白，其特征是所述细胞因子选自缩写为TGF-α的转化生长因子- α、缩写为EGF的表皮生长因子、缩写为VEGF的血管内皮细胞生长因子；所述激素选自缩写为&1RH的促性腺激素释放激素；所述非抗体非细胞因子非激素的多肽选自缩写为GRP的促胃液素释放肽。
3.根据权利要求1所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白，其特征是所述SEE是SEQID No. 2所示的氨基酸序列；所述SEE-I是SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列；所述SEE-2是SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列；所述SEE-3是SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白，其特征是所述SEE-I是SEE上的20位、21位、24位、27位、34位、39位、40位、1位、42位、44位、49位、74位、75位、78位、 79位、81位、83位、84位、217位、220位、222位、223位、225位、227位上的一个或多个氨基酸被替换。
5.根据权利要求3所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白，其特征是所述SEE-2是SEE上的20位、21位、M位、27位、34位、35位、39位、40位、41位、42位、44位、45位、46位、49 位、74 位、75 位、78 位、79 位、81 位、83 位、84 位、188 位、190 位、217 位、219 位、220 位、222 位、223位、2 位、225位、227位上的一个或多个氨基酸被替换。
6.根据权利要求3所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白，其特征是所述SEE-3是SEE上的20位、21位、24位、27位、34位、35位、36位、39位、40位、41位、42位、44位、45位、46 位、49 位、62 位、74 位、75 位、77 位、78 位、79 位、81 位、83 位、84 位、188 位、190 位、217 位、 218位、219位、220位、221位、222位、223位、224位、225位、227位上的一个或多个氨基酸被替换。
7.根据权利要求1所述的一种癌靶向超抗原融合蛋白，其特征是所述该融合蛋白为 由 SEQ ID No. 10 所示的 TGF- α -SEE ；由 SEQ ID No. 18 所示的 EGF-SEE ； 由 SEQ ID No. 26 所示的 VEGF-SEE ； 由 SEQ ID No. 34 所示的 GnRH-SEE ； 由 SEQ ID No. 42 所示的 GRP-SEE ； 由 SEQ ID No. 12 所示的 TGF-α -SEE-1 ； 由 SEQ ID No. 20 所示的 EGF-SEE-I ； 由 SEQ ID No. 28 所示的 VEGF-SEE-I ； 由 SEQ ID No. 36 所示的 GnRH-SEE-I ； 由 SEQ ID No. 44 所示的 GRP-SEE-1 ； 由 SEQ ID No. 14 所示的 TGF- a -SEE-2 ； 由 SEQ ID No. 22 所示的 EGF-SEE-2 ；由 SEQ ID No. 30 所示的 VEGF-SEE-2 ； 由 SEQ ID No. 38 所示的 GnRH_SEE_2 ； 由 SEQ ID No. 46 所示的 GRP-SEE-2 ； 由 SEQ ID No. 16 所示的 TGF-α -SEE-3 ； 由 SEQ ID No. 24 所示的 EGF-SEE-3 ； 由 SEQ ID No. 32 所示的 VEGF-SEE-3 ； 由 SEQ ID No. 40 所示的 GnRH_SEE_3 ； 或由 SEQ ID No. 48 所示的 GRP-SEE-3。
8.重组载体，其特征在于含有编码权利要求7所述融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列为编码SEQ ID No. 10的核苷酸序列SEQ ID No. 9 ；编码SEQIDNo.12的核苷酉堯序列SEQIDNo.11编码SEQIDNo.14的核苷酉堯序列SEQIDNo.13编码SEQIDNo.16的核苷酉堯序列SEQIDNo.15编码SEQIDNo.18的核苷酉堯序列SEQIDNo.17编码SEQIDNo.20的核苷酉堯序列SEQIDNo.19编码SEQIDNo.22的核苷酉堯序列SEQIDNo.21编码SEQIDNo.24的核苷酉堯序列SEQIDNo.23编码SEQIDNo.26的核苷酉堯序列SEQIDNo.25编码SEQIDNo.28的核苷酉堯序列SEQIDNo.27编码SEQIDNo.30的核苷酉堯序列SEQIDNo.29编码SEQIDNo.32的核苷酉堯序列SEQIDNo.31编码SEQIDNo.34的核苷酉堯序列SEQIDNo.33编码SEQIDNo.36的核苷酉堯序列SEQIDNo.35编码SEQIDNo.38的核苷酉堯序列SEQIDNo.37编码SEQIDNo.40的核苷酉堯序列SEQIDNo.39编码SEQIDNo.42的核苷酉堯序列SEQIDNo.41编码SEQIDNo.44的核苷酉堯序列SEQIDNo.43编码SEQIDNo.46的核苷酉堯序列SEQIDNo.45或编码SEQ ID No. 48的核苷酸序列SEQ ID No. 47所示。
9.权利要求1所述一种癌靶向超抗原融合蛋白的制备方法，其特征在于培养含有权利要求8所述重组载体的宿主细胞，收集表达权利要求1所述的融合蛋白。
10.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途，该融合蛋白含有a)促进癌细胞生长并与癌细胞过度表达受体相互作用的配体；b)能引起抗癌免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素E及其突变体，所述金黄色葡萄球菌肠毒素E用缩写SEE表示；所述金黄色葡萄球菌肠毒素E的突变体用缩写SEE-X表示，所述X＝1-3。本发明的超抗原SEE要比SEA更稳定，而经过大规模多点突变的改造后的SEE突变体SEE-1、SEE-2和SEE-3降低了与MHC的相互作用，所以由SEE突变体与TGF-α、EGF、VEGF、GnRH或GRP所组成的融合蛋白表现出很高的抗癌和抗肿瘤的生物活性。
文档编号A61K39/085GK102516392SQ201110378799
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者孙嘉琳 申请人:孙嘉琳