专利名称：一种组织工程化传导束及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于治疗心脏房室传导阻滞疾病的组织工程化传导束及其制备方法与应用。
背景技术：
目前生物起搏治疗房室传导阻滞的思路是利用基因转染或细胞移植的方法在传导阻滞部位以下(如室间隔或左右心室壁)建立一个新的稳定起搏点，提供并提高心室自主节律，从而使患者避免接受电子心脏起搏器的植入，达到生物心脏起搏所倡导的理想治疗状态。然而，外源基因导入治疗面临诸多的困难，如基因在体内缺乏长期稳定的表达并且难以有效的调控；不能得到高效、安全、导向性好的载体系统等。细胞移植的方法，理论上可以克月艮上述基因导入的局限性(Gepstein L. Cardiovascular therapeutic aspects of cell therapy and stem cells, Ann N Y Acad Sci，2006 ; 1080 :415-425)，然而，移植的细胞极易在心脏内迁移、弥散，不能形成稳定统一的心脏节律或传导通路。特别是，导入基因和细胞在心室创建新的起搏点、力图提高心室自主节律治疗房室传导阻滞的思路，和安置电子起搏器一样，毕竟只是对传导阻滞所产生症状的一个缓解治疗，对心脏功能的全面改善和疾患的彻底治愈作用有限。针对上述基因转染和细胞移植治疗房室传导阻滞存在的问题和面临的困难，并综合考虑生物起搏治疗研究的现状，利用传导束细胞和支架材料在体外构建组织工程化的传导束，将之移植到心脏中修复或再建心脏传导通路，应为房室传导阻滞治疗课题的理想解决方案。这一方案包括两种思路其一是利用构建好的组织工程化传导束替代修复传导通路中的阻滞点，从而使窦性节律的扩布在房室间畅通无阻，其二是利用构建好的组织工程化传导束在房室之间新建一条传导通路，从而另辟溪径沟通房室之间的冲动传送。考虑到组织工程化传导组织移植到传导通路上的困难，第二种思路新建房室之间的传导通路具有较好的可行性。房室传导阻滞的位点一般发生在房室间隔内的传导路径上，大体位置约在 Koch三角的区域，包括房室结以及与之相连的房结区和结束区。理论上，将组织工程化传导束埋于房室交界处冠状沟心外膜下的合适位置，则可越过阻滞位点并沟通其两端的传导， 达到对房室阻滞的治疗目的。目前国内外尚无构建组织工程化传导束的研究报道，仅有个例报道关于利用工程化组织构建物新建房室传导通路的研究。Choi等利用骨骼肌细胞和matrigel在体外构建了一个组织体，并将之移植到大鼠心脏冠状沟心外膜下，对再建房室传导通路做了初步的尝试。结果表明该构建物可以和周围宿主心肌建立电机械耦联，并且允许房室之间有电冲动传导，初步证明了利用生物工程化组织再建房室传导通路的可行性(Choi YH, et al. Cardiac conduction through engineered tissue, Am J Pathol,2006 ； 169(1) 72-85)
发明内容
本发明目的在于提供一种组织工程化传导束。本发明的另一目的在于提供该组织工程化传导束的构建方法及其应用。本发明是利用胶原海绵和骨髓间充质干细胞诱导获得的心脏传导细胞构建组织工程化传导束，用于治疗心脏房室传导阻滞的移植体。在构建组织工程化传导束的发明过程中，本发明人曾选用过壳聚糖、水凝胶、脱细胞基质作为支架，但上述支架在生物力学性能和与细胞复合性能方面效果相对较差，因此最终选择胶原海绵作为支架。本发明的关键在于如何利用胶原海绵和骨髓间充质干细胞诱导获得的心脏传导细胞构建组织工程化传导束。胶原海绵是一种可降解的生物支架材料，在体外培养条件下随着培养环境的改变和时间的推移会逐渐的萎缩和降解。且种子细胞在其上的生长是否良好亦受种植的时间、浓度、方式很大的影响。因此，控制种子细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等，是利用胶原海绵和心脏传导细胞构建组织工程传导束的关键。鉴于上述情况，本发明采用骨髓间充质干细胞诱导获得的心脏传导细胞作为种子细胞，胶原海绵作为支架，在体外构建具有心电传导特性的组织工程传导束，为治疗心脏房室传导阻滞疾病提供移植体。本发明提供了一种组织工程化传导束的构建方法，具体方法如下1.与心耳肌细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取心耳部位组织进行原代培养获得心耳肌细胞。然后利用细胞培养池将心耳肌细胞与骨髓间充质干细胞共培养2天之后，再施加旁分泌因子内皮素-1和神经调节蛋白-1(浓度范围1X10_8M-1.5X10_8M，培养时间 6-7天)，诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞。通过对缝隙链接蛋白40、HCN2等标记物的检测进行心脏传导细胞鉴定。2.利用胶原海绵和诱导获得的心脏传导细胞构建组织工程化传导束将诱导成功的心脏传导细胞制备成细胞悬液(浓度范围lX106f/ml_1.2X106 个/ml)，采用沉淀法(参见《组织工程学教程》，人民军医出版社，2001版)将细胞悬液滴到支架材料(即胶原海绵支架)上，不使其溢出为准，种植该细胞到胶原海绵支架上(种植密度3 X IO5个/cm3-6 X IO5个/cm3)，定期更换培养液在体外条件下培养10-20天，直到细胞支架复合体形成有功能的传导束，体外电刺激检测传导速率。上述的组织工程化传导束的构建方法中，胶原海绵由无锡贝迪生物有限公司提供。将胶原海绵剪成1.5X1.0X0. 2cm大小，用钴6°照射12小时以上消毒备用。上述的组织工程化传导束的构建方法中，取诱导获得的心脏传导细胞，加0. 25% 胰酶(Gibco公司)1ml，于37°C、5% CO2培养箱中消化1_2分钟，倒置相差显微镜下观察， 细胞胞体回缩呈圆形，加含10% FBS的DMEM/F12培养基(Gibco公司)Iml终止消化，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，1200转低速离心5分钟，弃去上清液，加入含血清的培养液，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1 X IO6个/ml，置4°C冰箱保存备用。上述的组织工程化传导束的构建方法中，于6孔培养板底滴加50 μ 1的细胞悬液， 将胶原海绵置于细胞悬液中，待海绵将细胞悬液吸收后再向海绵表面滴加50μ 1的细胞悬液，置于37°C，含5% CO2的培养箱中孵育1小时，再向培养孔中加入2ml新鲜含10%胎牛血清的培养液，继续置于37°C，含5% CO2的培养箱中培养2周，每2天换一次液。上述的心耳肌细胞、骨髓间充质干细胞可以选自犬、大鼠、兔子、小鼠等。
本发明还提供了经上述方法构建得到的组织工程化传导束。本发明还提供了经上述方法构建得到的组织工程化传导束在制备治疗房室传导阻滞疾病的移植体中的应用。本发明经动物实验证明，本发明构建成功的组织工程化传导束移植治疗房室传导阻滞取得良好效果。通过心脏移植手术，将构建成功的组织工程化传导束移植连接到心脏冠状沟两侧房室心肌中，分别于两周和一个月后给移植动物造房室传导阻滞，心电图监测组织工程化传导束改善房室传导的情况。本发明获取了一种具有心电传导特性、可用于治疗移植的组织工程化传导束，为治疗心脏房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。
图1 正常犬肢体二导联(Lead II )心电2 房室传导阻滞模型(射频消融房室结)犬肢体二导联心电3 移植组织工程化传导束犬消融房室结后心电图
具体实施例方式现结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1 诱导获得的犬心脏传导细胞种植到胶原海绵构建组织工程化传导束1、诱导犬骨髓间充质干细胞制备心脏传导细胞(1)分离、培养犬骨髓间充质干细胞和犬心耳肌细胞A、骨髓间充质干细胞的分离、培养犬全骨髓直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞抽取成年杂交犬(第二军医大学实验动物中心，15千克)髂骨骨髓10ml，900Xg离心lOmin，弃上清与脂肪；加入红细胞裂解液TrisNH4Cl,40C 5min去除红细胞，以IX 106/ml接种于纤粘连蛋白(FN) (Sigma公司) 包被的培养皿中，培养基为60% DMEM-F12 (Gibco公司),10% FCS(Gibco公司)UOng/ml EGF(cytolab 公司)、1000U/ml LIF(Chemicon 公司)。24小时后去除悬浮未贴壁细胞，每3天换液1次，直到需要传代。B、犬心耳肌细胞的分离培养取幼犬心耳肌组织块；剪成Imm大小的碎块，在0. 07%的胰酶(Gibco公司)中 4°C过夜消化。第一次的消化液弃去，再加入新鲜0. 07%的胰酶，37°C消化15分钟，吸出消化液并中止消化，重复2-3次，直至全部组织块消化完全。将消化液用200目的不锈钢滤网过滤后，IOOOrpm离心8min，加入含20% FBS (Gibco公司)的DMEM-F12培养基(Gibco公司)，37°C 5% (X)2培养4小时，吸出含未贴壁细胞的培养液在6孔板中培养，调整细胞数至 1 X 105/ml细胞，每孔接种2ml。培养48小时后换液。每孔加入2ml含0. lmmol/L BrdU (Sigma 公司)和20% FBS的DMEM-F12培养基继续培养。(2.)骨髓间充质干细胞向心脏传导细胞方向的诱导分化A、骨髓间充质干细胞向心脏传导细胞方向的诱导骨髓间充质干细胞加入Transwell小室(Gibco公司)，密度为每孔1 X IO4个细胞。将种植细胞的Transwell小室插入生长心耳肌细胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培养箱中培养。48小时后，在上述六孔板和Transwell小室，加入旁分泌因子内皮素_1 (Tocris)和神经调节蛋白-1 (RD公司)，使其终浓度为10_8M，连续培养7天后进行检测鉴定诱导细胞。B、骨髓间充质干细胞向心脏传导细胞诱导后的鉴定犬骨髓间充质干细胞诱导后倒置相差显微镜可以观察到单个细胞的搏动，细胞形态大部分为梭形和三角形。免疫细胞化学检测诱导前后细胞缝隙连接蛋白40(CX40)和HCN2(武汉博士德公司)的表达，结果显示CX40和HCN2的阳性表达明显升高(p<0. 05)，表明胚胎源性多能干细胞已经向心脏传导细胞方向转化。全细胞膜片钳技术检测单个细胞的动作电位，显示舒张末期有自动去极化，证明诱导后细胞为传导细胞。2、组织工程化传导束的构建(1)胶原海绵准备胶原海绵由无锡贝迪生物有限公司提供。将胶原海绵剪成1.5X1. 0X0. 2cm大小，用钴6°照射12小时以上消毒备用。(2)犬心脏传导细胞接种胶原海绵取诱导获得的心脏传导细胞，加0.25%胰酶(Gibco公司)lml，于37°C、5% (X)2 培养箱中消化1-2分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞胞体回缩呈圆形，加含10% FBS的 DMEM/F12培养基(Gibco公司)Iml终止消化，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，1200转低速离心5分钟，弃去上清液，加入含血清的培养液，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1 X IO6个/ml，置4°C冰箱保存备用。于6孔培养板底滴加50 μ 1的细胞悬液，将胶原海绵置于细胞悬液中，待海绵将细胞悬液吸收后再向海绵表面滴加50μ 1的细胞悬液， 种植密度总计约为3. 3Χ IO5个/cm3，置于37°C，含5% CO2的培养箱中孵育1小时，再向培养孔中加入2ml新鲜含10%胎牛血清的培养液，继续置于37°C，含5% CO2的培养箱中培养 2周，每2天换一次液。3、组织工程化传导束的检测鉴定(I)HE染色观察心脏传导细胞在胶原海绵上的生长将上述生长2周的心脏传导细胞和胶原海绵复合体制备成石蜡切片进行HE染色， 步骤如下苏木素液染lOmin，自来水冲洗，75%盐酸乙醇溶液分化30s，水洗lh，95%乙醇 1 2min，伊红复染1 2min，95%乙醇1 2min，脱水透明，中性树胶封片。通过HE染色观察细胞胶原海绵复合体中心脏传导细胞生长均勻、接触紧密，心脏传导细胞与胶原海绵复合良好。(2)多导生理仪检测细胞胶原海绵复合体传导速率使用多导生理仪检测细胞胶原海绵复合体传导速率，结果显示电冲动的传导速度为2. 363士0. 256m/s，类似在体传导组织电冲动传导速率，证明所构建细胞胶原海绵复合体 (组织工程化传导束)具有心脏传导束的特性。实施例2 其余同实施例1，在骨髓间充质干细胞向心脏传导细胞方向的诱导中加入旁分泌因子内皮素-1和神经调节蛋白-1浓度选1. 5X 10_8M，诱导培养时间选6天，组织工程化传导束构建中细胞种植密度选4X IO5个/cm3。
实施例3 其余同实施例1，骨髓间充质干细胞和心耳肌细胞选大鼠。实施例4 组织工程化传导束移植体内观察传导效果通过开胸手术将上述实施例1构建成功的组织工程化传导束移植到犬(第二军医大学实验动物中心，15千克)房室交界处的心外膜下，即将组织工程化传导束连接到心脏冠状沟两侧房室心肌中；移植前3天开始应用环孢素A (北京双鹭药业股份有限公司，剂量为0. 25mg/天)和泼尼松龙(上海通用药业股份有限公司，剂量为0. Img/天)抑制免疫排斥反应。结果显示移植组织可以在宿主心肌中存活，移植组织中的细胞和宿主心肌细胞形成了电机械藕联；移植一个月后消融动物房室结，心电图(奥尔科特生物有限公司)监测显示组织工程化传导束可改善房室间传导，证实所构建的组织工程化传导束具有再建心脏房室传导通路的潜能，如图1、2、3所示。
权利要求
1.一种组织工程化传导束的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤A、与心耳肌细胞共培养诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞抽取骨髓接种培养获得骨髓间充质干细胞，取心耳部位组织进行原代培养获得心耳肌细胞，然后利用细胞培养池将心耳肌细胞与骨髓间充质干细胞共培养2天之后，再施加旁分泌因子内皮素-1和神经调节蛋白-1，浓度均为1 X 10_8M-1. 5 X ，培养时间为6-7天， 诱导骨髓间充质干细胞成为心脏传导细胞；B、利用胶原海绵和诱导获得的心脏传导细胞构建组织工程化传导束将诱导成功的心脏传导细胞制备成细胞悬液，浓度为1 X IO6个/ml-1. 2X IO6个/ml， 采用沉淀法将细胞悬液滴到胶原海绵支架上，不使其溢出为准，种植该细胞到胶原海绵支架上，种植密度为3 X IO5个/cm3-6X IO5个/cm3 ；培养10-20天，直到细胞支架复合体形成有功能的传导束。
2.根据权利要求1所述的一种组织工程化传导束的构建方法，其特征在于其中的胶原海绵剪成1.5X1.0X0. 2cm大小，用钴6(1照射12小时以上消毒备用。
3.根据权利要求1所述的一种组织工程化传导束的构建方法，其特征在于其中的步骤 B具体为取诱导获得的心脏传导细胞，加0. 25%胰酶1ml，于37°C、5% CO2培养箱中消化1_2分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞胞体回缩呈圆形，加含10% FBS的DMEM/F12培养基Iml终止消化，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，1200转低速离心5分钟，弃去上清液，加入含血清的培养液，用玻璃滴管吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1 X IO6个/ml，置4°C冰箱保存于6孔培养板底滴加50 μ 1的细胞悬液，将胶原海绵置于细胞悬液中，待海绵将细胞悬液吸收后再向海绵表面滴加50μ 1的细胞悬液，置于37°C，含5% CO2的培养箱中孵育1小时，再向培养孔中加入2ml新鲜含10%胎牛血清的培养液，继续置于37°C，含5% CO2的培养箱中培养2周，每2天换一次液。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种组织工程化传导束的构建方法，其特征在于其中的心耳肌细胞、骨髓间充质干细胞可以选自犬、大鼠、兔子或小鼠。
5.一种如权利要求1至4任一所述的组织工程化传导束的构建方法得到的组织工程化传导束。
6.一种如权利要求5所述的组织工程化传导束在制备治疗房室传导阻滞疾病的移植体中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医学工程技术领域，目前基因转染和细胞移植治疗房室传导阻滞存在很多问题和困难，综合考虑生物起搏治疗研究的现状，利用传导束细胞和支架材料在体外构建组织工程化的传导束，将之移植到心脏中修复或再建心脏传导通路，应为房室传导阻滞治疗课题的理想解决方案。但目前国内外尚无构建组织工程化传导束的研究报道。本发明目的在于提供一种组织工程化传导束和构建方法，是利用胶原海绵和骨髓间充质干细胞诱导获得的心脏传导细胞构建组织工程化传导束。本发明的组织工程化传导束具有心电传导特性、可用于治疗移植，为治疗心脏房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。
文档编号A61L27/24GK102488922SQ20111040581
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者吴爱群, 张传森, 张喜, 李玉泉, 杨向群, 蔺海燕 申请人:中国人民解放军第二军医大学