专利名称：含引导肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白和核酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域。具体为一种新的融合蛋白及其在药物中的应用。本发明公开了一种通过引入肽段(优选蛋白质转导域(PTD))，提高了免疫毒素(人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A衍生物(GnRH-PE39KDEL))细胞杀伤活性，该肽段定位于人促黄体激素释放激素(GnRH)的C端和绿脓杆菌外毒素A衍生物(PE39KDEL)的N端并和GnRH、 PE39KDEL组成一种新的融合蛋白，以及编码该融合蛋白编码的核苷酸序列，含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞以及作为免疫毒素在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
目前癌症的治疗仍然是一个世界难题，人们应用的主要的治疗手段仍然是手术， 放疗和化疗，传统的治疗法在带来疗效的同时，副作用也往往很大，并且对于复发的肿瘤治疗效果更加有限。最早在20世纪初，Ehrilich等就提出免疫毒素(Immunotoxins, ITs)的概念。是一种专门设计用于选择性破坏具有某一特异性标记细胞的一类融合蛋白，通常由具有高度特异的单克隆抗体与具有强大杀伤作用的毒素分子通过化学交联构建而成。免疫毒素是由具有催化作用的毒素和有适当导向作用的细胞因子、短肽激素或者抗体构建的具有药理活性的生物制剂，主要应用于肿瘤的导向治疗。免疫毒素克服了传统治疗肿瘤的化疗和放疗方法的缺陷。它既具有特异性的识别功能，又具有毒素的杀伤功能。研究表明，免疫毒素在细胞培养水平有很好的选择性结合与杀伤肿瘤细胞作用，主要应用于肿瘤的导向治疗，是一种有望代替化疗的新的治疗手段。免疫毒素是达到导向治疗的一个重要的发展方向，通过特异性抗体或细胞因子、激素等与毒素连接，前者作为导向部分，即配体，可以引导分子到达肿瘤部位并与肿瘤细胞表面的过量表达的该种受体结合，后者作为毒素部分，即杀灭肿瘤细胞的部分。部分免疫毒素，如0VB3 — PE、IgG — HD37 — dgA、 IgG — RFB4 — dgA、B3—PE40、LHRH — PE40 等已进入临床观察，DAB389— IL一2 (商品名为 0NTAC)已通过FDA批准上市，显示良好的疗效。目前以GnRH或其衍生物为导向部分，以PE 毒素的截短形式及其衍生物为毒素部分的靶向治疗剂已经有报道(中国专利应用嵌合毒素诊断癌症的方法，99806580. 3 ;中国专利一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白；03137587. I ;高效低毒的系列功能蛋白，200410033621. 6 ;高细胞毒性靶向融合蛋白 200710301316 GnRH与PE衍生物组成的融合蛋白GnRH_PE39KDEL，其与目前的同类靶向药物相比，具有更高的靶向细胞毒性活性，从而在肿瘤的治疗方面有潜在的应用价值。)，这些融合蛋白的靶向型已得到广泛验证，能特异性地识别目的细胞并将其杀死，但目前在应用中还存在一个很大的问题，那就是由于实体瘤的结构问题，如对靶组织的特异性杀伤作用较弱，尤其对大型实体瘤的浸润性较差，在体内的免疫反应严重，所以如何增强靶向毒性蛋白中PE部分的细胞毒性，研制出只杀死相关病理有关的免疫毒素就成为关键。而通过增强免疫毒素对肿瘤细胞的穿透性势必能增强其毒性。蛋白质转导域(proteintransductiondomain,PTD)或 Trojanhorsepeptides,可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受体介导、无耗能的方式，导入多种哺乳动物细胞，
3且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。细胞穿膜肽有天然存在和人工合成两大类，细胞穿膜肽的研究始于1988年，Green和Frankel分别证实HIV-I的反式激活蛋白Tat能跨膜转移入细胞质和细胞核内。1997年，Vives等发现HIV-TAT中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片断与蛋白转导功能密切相关天然存在的CPPs。目前已经发现的有三种，分别来自果蝇同源异型域ANTP、单纯疱疹病毒I型(HSV-I) VP22转录因子以及 HIV-I和SIV (2，3)的Tat。这些细胞穿膜肽均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基。利用这一特性，人工合成的多聚精氨酸、赖氨酸，也具有穿膜活性，且9个精氨酸和9个赖氨酸残基构成的基序比TatPTD的蛋白转导活性还要强。
发明内容
为了提供一种新的应用于肿瘤的导向治疗药物的融合蛋白，本发明选用一种胞质转导肽，可以有效地介导外源物质进入细胞的胞质当中，与其他蛋白的融合表达产物能够高效地进入体外培养的细胞，并且表现出生物学活性。具有更强的介导外源物质进入细胞的能力，胞质转导肽融合蛋白的作用具有速度快、温度适应性广、浓度依赖性、能够掺入所有细胞等特点。胞质转导肽融合分子穿越细胞膜而不损伤细胞，被胞质转导肽带入细胞的分子仍保留其原有的性质。无活性的分子进入细胞后也能重新折叠，自我复性，是基因工程药物经济、高效利用的有利途径。用胞质转导肽融合蛋白进行介导方法简单，转导的效率高，反应条件也不严格，而且它转导的蛋白质在细胞内部仍具有活性。融合蛋白的转导使药物的用量显著下降，副作用明显减少，是其它方法所无法比拟的。本发明所述的融合蛋白为含人促黄体激素释放激素(GnRH)和绿脓杆菌外毒素A 衍生物(PE39KDEL)以及肽载体(蛋白质转导域(PTD)的融合蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明用大肠杆菌表达系统高效表达含蛋白转导域(PTD)和免疫毒素GnRH -PE39KDEL融合蛋白，蛋白转导域(PTD)定位于融合蛋白GnRH的C端和PE39KDEL的N端之间并在此融合蛋白的N端引入了 6个His标签和Factor Xa蛋白酶切位点，表达后的产物是含有6个His标签和GnRH-PTD-PE39KDEL的前体融合蛋白，Factor Xa蛋白酶可以将融合蛋白专一性的切割产生具有天然N端得目的蛋白，Factor Xa蛋白酶酶切后直接得到GnRH-PTD-PE39KDEL,从而使生产、纯化工艺简化。最终我们得到的高活性的靶向融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL,作用原理是首先重组蛋白的GnRH部分与肿瘤细胞的GnRH受体结合，结合后由PTD介导将融合蛋白转送至细胞的内质网，由融合蛋白的毒素部分作用于延长因子2使之核糖基化，阻断蛋白合成杀死细胞。由于增加了 PTD蛋白转导域可以增强跨越细胞膜的能力，所以可以大大增强融合蛋白在实体瘤中浸润性，在肿瘤治疗方面有将有很高的应用价值。本发明提供了高效表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽融合蛋白的表达质粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL,其包N端有6个His标签，序列中有Factor Xa蛋白酶切位点，有利于表达纯化。本发明提供的宿主细胞是万.BL21(DE3) plysS，具有氯霉素抗性。
本发明提供表达融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL的工程菌株为大肠埃希氏菌{Escherichia co7i ) GnRH-PTD-PE39KDEL/pET-His,是由表达质粒 pET-His~GnRH-PTD_PE39KDEL 转化 E. coli BL21(DE3) plysS细胞获得的最高表达量的菌株。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为OGMCC No. 5357，保藏时间为2011年10月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明提供了使用Factor Xa蛋白酶切割法制备GnRH-PTD_PE39KDEL的方法，并在此基础上提供了完整的表达、分离纯化GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白的方法。本发明所获得的GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白可用于制备治疗和预防肿瘤的药物，特别是用于制备防治在肿瘤细胞表面过量表达促黄体激素释放激素(GnRH)肿瘤的药物。
图I 重组质粒 pET-Hi S -GnRH-PTD-PE39KDEL 酶切电泳图。M DL2000 DNA Marker (2000，1000，750，500，250，100) bp I 质粒 pET-His 酶切(脑H I BcoR I)。2 重组质粒 pET-His -GnRH-PTD_PE39KDEL 酶切 UasH I 和&oR I)。图 2 SDS-PAGE 电泳分析 GnRH-PTD_PE39KDEL 表达。M 高分子量蛋白标准(116，66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD
I表达质粒pET-His在疋co7iBL21 (DE3)plysS细胞中的表达(空白对照)。2 表达质粒 pET-His -GnRH-PTD-PE39KDEL 在万· co7iBL21(DE3)plysS 细胞中的表达。图 3 SDS-PAGE 电泳检测 GnRH-PTD_PE39KDEL。M 高分子量蛋白标准(I 16，66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD
I 表达质粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL在万.co7iBL21 (DE3) plysS 细胞中的表达后使用Ni柱纯化的表达蛋白穿通液。2 表达质粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL在万· co7iBL21 (DE3) plysS 细胞中的表达后使用Ni柱纯化的表达蛋白清洗液。3 表达质粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 在万.co7iBL21 (DE3) plysS 细胞中的表达后使用Ni柱纯化后的洗脱液经Factor Xa蛋白酶切割后分离纯化得到的 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白。
具体实施例方式实施例I GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白基因序列的获得
依据已知GnRH -PE39KDEL的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成GnRH -PE39KDEL基因序列(生工生物工程(上海)有限公司完成)，同时在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位点。应用PCR的方法对全基因合成PE39KDEL的基因序列进行操作，设计3条引物 MiddleCTDFl
5，TACAACGCTGGTCGTCGTGCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCACTTCCCGGAAGGTGGMiddleCTDF2
5’ GGGATCCGTGGAAGGTCGCGAACACTGGTCTTACGGTCTGCGTCCGGGTTACAACGCTGGTCGTCG GnRHR 5’ GAATTCTCACAGTTCGTCTTTCGG
在 GnRH -PE39KDEL 的 GnRH 的 C 端引入 PTD 序列，并在 GnRH_PTD_PE39KDEL 的 N 末端引入Factor Xa蛋白酶切割位点，得到编码SEQ ID NO:2的融合蛋白的核酸序列SEQ ID NO: I。 实施例2
2. I GnRH-PTD-PE39KDEL基因重组质粒的构建
提取质粒pET-His，用及I和I双酶切，回收2. 8 kb的线性质粒；
将所述步骤I中获得的GnRH-PTD-PE39KDEL基因片段用汉·Η I和&oR I双酶切，加入等体积的酚氯仿异戊醇(体积比25:24:1)抽提，3倍体积无水乙醇沉淀回收酶切片段； 将上述回收酶切产物片段，用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应体系为25μ I :
权利要求
1.一种含引导肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白，其特征是含人促黄体激素释放激素 GnRH和绿脓杆菌外毒素A衍生物PE39KDEL以及肽载体-蛋白质转导域PTD的融合蛋白。
2.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征是蛋白质转导域PTD定位于人促黄体激素释放激素GnRH的C端和绿脓杆菌外毒素A衍生物PE39KDEL的N端并直接相连和GnRH、 PE39KDEL组成的融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
3.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征是所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
4.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征是在所述融合蛋白的N端引入6个组氨酸的标签和Factor Xa蛋白酶切位点。
5.—种表达权利要求I所述的融合蛋白的工程菌株，为大肠埃希氏菌coli ) GnRH-PTD-PE39KDEL/pET-Hi s，是由表达质粒 pET_Hi s-GnRH-PTD_PE39KDEL 转化 E. coli BL21 (DE3) plysS细胞获得的最高表达量的菌株；该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 5357，保藏时间为2011年11月02 曰。
6.如权利要求I所述的融合蛋白的应用，其特征是用于制备治疗和预防肿瘤的药物。
全文摘要
本发明公开了一种通过引入肽段(优选蛋白质转导域(PTD))，提高了免疫毒素人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A衍生物(GnRH-PE39KDEL)细胞杀伤活性，该肽段定位于人促黄体激素释放激素(GnRH)的C端和绿脓杆菌外毒素A衍生物(PE39KDEL)的N端并和GnRH、PE39KDEL组成一种新的融合蛋白，编码该融合蛋白编码的核苷酸序列，以及含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞以及作为免疫毒素在抗肿瘤药物中的应用。
文档编号A61K47/48GK102603897SQ20111040586
公开日2012年7月25日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者扈进冬, 李纪顺, 杨合同, 郭凯, 魏艳丽 申请人:山东省科学院生物研究所