专利名称：用于治疗关节疾病和损伤的关节内补充方法
技术领域：
本发明涉及生产包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的混合物的球状水凝胶小珠的方法。本发明还涉及用于治疗关节病症、特别是骨关节炎的新型补充方法(supplementation me thod)和组合物。
背景技术：
骨关节炎(osteoarthritis, 0A)是一种伴有疼痛的进行性退行性病症,其特征在于关节中软骨的断裂、关节内存在的滑液的变质和所导致的骨硬化。骨关节炎随年龄增加，在60岁以上的人中具有高于60%的可能性。目前，为了缓解伴随OA的机械性疼痛，目前的疗法通常是通过施用镇痛剂或抗炎药剂的治疗或通过部分或整个关节置换的外科手术疗法。备选方法是粘性补充疗法(viscosupplementation),其是向关节内注射减少摩擦和疼痛的生物相容性粘性(例如，透明质酸)润滑剂。粘性补充疗法用于补充润滑并且保护关节的滑液。事实上，在OA患者中，滑液的变化是透明质素(或透明质酸HA的盐)的浓度和分子量(Mw)的减少。包含高分子量HA制剂的关节内注射剂目前是可获得的并且被用于治疗膝盖，髋部，拇指或踝的腕掌关节。这些制剂需要一次(Durolane TM,Q-Med AB，Uppsala，瑞典)、三
次(Synvisc ，高分子量交联的 HA，Ortliovise ')至五次(.Hyalgan'81，Supartz :)关节内(IA)注射(根据关节，每次注射I至3ml，包含5至20mg/ml的HA)。表I :透明质酸(HA)制剂
商标名公司平均Mw (kD)
Synvisc (Hylan G-20) Biornatrix(IllltAj)6.000-7.000
Healon Pliarrnacia/ Upjohn ( 典)丨.900-3900
Ortliovisc Anika (美 I )1.700-2.900
Artlirum LCA (法 N)2.000
Adant Meiji Seika (I I 木)900-1.200
S叩Artz ，Artz ，Seikagaku (丨 I 木)600-1 ..200
_Artzal ___
Ostenil Cliemedica (法丨丨;:丨)丨 _200
Hyalgan _Fidia (意大利)__500-730_
DurolaneIMQ-Med AB (瑞典)2 9000HA制剂有多种特征变化，包括，例如，HA的来源(动物来源的或细菌的)，HA的浓度和Mw以及所用的化学交联的类型和程度(如果存在的话)。通常，大部分注射型HA制剂在注射后具有数小时至数天的停留半衰期。一些研究已经比较了上述产品的功效并且差异性地推论出患有膝盖OA的患者有显著的疼痛减轻及功能改善。一些研究的结论是与安慰剂注射相比较充其量存在些微作用。其他研究观察到每周注射3-5次上述产品中的一种，显著改善OA患者的疼痛和功能状态，并且，尽管改善滞后3-4周发生，但是作用在治疗终止后可以持续至少六个月以上。其他研究观察到对OA症状(不仅对膝盖OA而且对踝部或拇指的腕掌关节0A)的有益效果，但是也有不利效果。 此外，临床效果可以在第I周迅速出现并且可以持续6个月以上，但是在所有情形中，主要由于大部分HA制剂的短的停留半衰期，对于骨关节疼痛的持久(六个月至一年)作用必需进行多次注射。最后，W02007/135114描述了使用不产生不溶性团聚体的藻酸盐和脱乙酰壳多糖的混合物的多糖组合物的粘性补充疗法。团聚体是由于脱乙酰壳多糖的聚阳离子性质导致，该性质使其难以与其他多糖如透明质酸(一种聚阴离子)或藻酸盐相容。根据W02007/135114，多糖如脱乙酰壳多糖和藻酸盐的沉淀/团聚阻止其任何制剂用作可注射的组合物。因此，在W02007/135114中，具有至少40%的高衍生度的脱乙酰壳多糖和藻酸盐的水性混合物的组合物被描述为是高度粘性的但不产生不溶性团聚体。对于开发保护软骨免受机械张力、为OA患者提供有效缓解而无须多次注射并且避免不利作用的新型关节内补充产品存在持续的需求。现在我们已经发现制备包含藻酸盐和脱乙酰壳多糖的均质水凝胶基质的新方法，其中脱乙酰壳多糖具有低的分子量和团聚体。可通过该新方法得到的所产生的藻酸盐/脱乙酰壳多糖小珠当用于关节内补充时保持令人惊讶的均质性和稳定性。现在我们已经发现用于脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠的单次关节内补充的新方法和组合物，所述脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠在关节内长期停留(至少两周)，而不增加滑液的粘度。前述概述和下述描述不是对所要求的发明的限制。发明概述本发明的一个方面涉及制备水凝胶基质的方法，所述方法包括下述步骤-提供藻酸盐溶液，-提供具有低于60kD的Mw的脱乙酰壳多糖的溶液，-将藻酸盐溶液与脱乙酰壳多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含0.5-0. 7% (w/v)的脱乙酰壳多糖和1-1.4% (w/v)的藻酸盐，-将所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+阳离子的溶液中，和-从所述具有阳离子的溶液分离凝胶化(gellified)的小珠。在本发明方法的特定实施方案中，将混合溶液的液滴引入到Sr2+离子溶液中。在该方法的具体实施方案中，所述混合溶液包含0. 6%的脱乙酰壳多糖和或包含I. 2%的藻酸盐。在本发明方法的具体实施方案中，所述混合溶液中藻酸盐与脱乙酰壳多糖之间的比例是I. 4-2. 8，或I. 75-2. 25或约为2。在本发明方法的具体实施方案中，所述脱乙酰壳多糖具有35_45kD的Mw和/或是动物来源的，或优选是植物来源的。
在本发明方法的另一些具体实施方案中，所述方法进一步包括将所述小珠混合在热敏性水凝胶中的步骤。此处，小珠和水凝胶之间的比例如为5/1至1/1，或4/1至2/1。在本发明方法的另一些具体实施方案中，小珠的形成通过使液滴穿过针头来进行，从而得到直径为0. 01-5mm的小珠。本发明的另一个方面涉及包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的均质混合物的球形水凝胶小珠，其中所述小珠可以通过上述方法得到。本发明的另一个方面涉及包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的均质混合物、直径为
0.01-5mm的球形水凝胶小珠，其特征在于所述小珠包含1_1. 4%的藻酸盐和0. 5-0. 7%的 脱乙酰壳多糖，例如，所述小珠包含I. 2%的藻酸盐，或例如，所述小珠包含0. 6%的脱乙酰
壳多糖。在本发明小珠的具体实施方案中，藻酸盐/脱乙酰壳多糖的比为I.4-2.8，优选
1.75-2. 25，最优选 I. 8-2. 2。在本发明小珠的另一些具体实施方案中，所述脱乙酰壳多糖具有35_45kD的Mw和/或是动物来源的或植物来源的。本发明还涉及关节内补充物，所述关节内补充物包含直径为0.01_5mm、包含藻酸盐和分子量低于60kD的脱乙酰壳多糖的均质混合物的球形水凝胶小珠，其特征在于所述小珠包含1-1. 4%的藻酸盐和0. 5-0. 7%的脱乙酰壳多糖。所述关节内补充物可以进一步包含粘性热凝胶，例如，多糖水凝胶，特别是脱乙酰壳多糖水凝胶。提及多糖，人们意指生物聚合物，如透明质酸(已知其具有由葡萄糖醛酸和N-乙酰-葡糖胺组成的重复二糖单位)，藻酸盐和脱乙酰壳多糖。脱乙酰壳多糖是一种自然中可广泛获得的多糖，其通过壳多糖的化学脱乙酰作用获得，并且是甲壳类动物外骨骼的主要组成成分，而且还来自蘑菇壁。其由D-葡糖胺单位和N-乙酸-D-葡糖胺单位组成。关节内补充物还可以包含选自由下列各项组成的组的成分非留体抗炎药、麻醉齐U、阿片类镇痛剂、皮质类固醇、抗肿瘤药、单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、维生素、矿物质、
营养制品。关节内补充物还可以包含另外的活性或非活性成分，包括，例如，非甾体抗炎药(NSAIDS)，例如，双氯芬酸 TM(diclofenacTM)，布洛芬 TM(ibuprofenTM)，批罗昔康TM(piroxicamTM)；镇痛剂，例如，利多卡因TM(LidocaineTM)和布比卡因TM(BupivacaineTM);阿片类镇痛剂，例如可待因(codeine)和吗啡(morphine);皮质类固醇类，例如，地塞米松(dexamethasone)和泼尼松(prednisone);抗肿瘤剂，如甲氨蝶呤TM (MethotrexateTM);抗病毒药剂，例如阿昔洛韦TM (AcyclovirTM)和阿糖腺苷TM(VidarabineTM);单克隆抗体,例如HumiraTM和嵌合单克隆抗体，例如英利昔单抗TM (inf IiximabTM)。关节内注射型补充物还可以包含下述成分,如细胞，蛋白质、DNA、矿物质(例如硒、锶)、维生素(例如生育酚)、营养制品(例如姜黄素(curcumin))或其他需要的生物活性物质。本发明还涉及用于治疗受试者的关节病症和用于减轻与关节损伤或关节病(包括骨关节炎和创伤性软骨损伤(traumatic cartilage lesions))相关的疼痛和不适的补充方法。所述关节病的实例包括骨关节炎(原发性(自发性的)或继发性的)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、关节损伤(joint injury)(例如创伤性或反复性运动损伤(traumatic or repetitive motion injury))、软骨病变(cartilage pathology)(例如软骨隹丐沉着症(chondrocalconsis)、软骨软化症(chondromalacia))、脓毒性关节炎(septicarthritis)。本发明还提供减轻与所述疾病相关的疼痛，修复骨骼和软骨损伤和减缓疾病进展的方法。治疗关节病症的补充方法包括施用按照本发明制备的关节内补充物。补充方法可以包括单次或多次关节内注射或植入足以提供治疗效果的量的补充物。
关节内注射或植入在人或非人哺乳动物的骨骼和/或软骨缺陷中例如通过关节镜检查或使用注射装置如注射器直接进行。施用位点的实例包括,膝部、肩部、踝部、颞下颌(temporo-madibular)和腕掌关节、肘部、髋部、腕部、椎间盘。本发明还提供一种补充设备，其包括具有单次剂量的补充物的预填充、单次用注射器。附图
简要说明图I显示按照本发明的方法得到的小珠。图2显示藻酸盐小珠(A)和脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠⑶的截面[脱乙酰壳多糖深灰色小梁(trabeculae);藻酸盐浅灰色背景]。图3以低的放大率显示包埋在脱乙酰壳多糖水凝胶中的脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠。图4显示包含0. 6%脱乙酰壳多糖/I. 2%藻酸盐小珠的热敏性脱乙酰壳多糖水凝胶(双孢蘑燕(A. bisporus)脱乙酰壳多糖(40kD))的植入。图5显示植入15天后植入物的组织学评估。A :软骨下骨；B :细胞群集的(cell-colonized)的水凝胶；C :细胞群集的脱乙酰壳多糖/藻酸盐小珠；D :包埋在脱乙酰壳多糖空隙(lacunae)中的细胞。发明详述本发明的一个方面涉及生产水凝胶基质的方法。该方法包括下述步骤-提供藻酸盐溶液，-提供具有低于60kD的Mw的脱乙酰壳多糖的溶液，-将藻酸盐溶液与脱乙酰壳多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含0.5-0. 7% (w/v)的脱乙酰壳多糖和1-1. 4%的藻酸盐，-将所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+离子的溶液中-从具有阳离子的溶液分离凝胶化的小珠。通过该方法得到的水凝胶产生藻酸钙和脱乙酰壳多糖的均质基质。如在本发明中得到的基质与现有技术的基质不同，现有技术的基质具有一种成分的核，其被另一种成分的层包被。与首先被冻干以获得某种程度的孔隙度的基质相比，如在本发明中得到的基质具有优点，即，该基质的孔隙度可以更准确地确定。如在本发明中得到的基质具有优点，即，由低分子量的(尤其是15_50kDA的)脱乙酰壳多糖组成，其在藻酸盐基质中自发形成均质网络。如在实施例部分所示，用于制备水凝胶的藻酸盐和脱乙酰壳多糖溶解在具有杀菌作用的强的碱性或酸性缓冲液中。这是本发明另外的优点。在根据本发明的方法中，可以混合藻酸盐和脱乙酰壳多糖溶液以得到具有不同浓度的小珠。本发明的具体实施方案涉及这样的小珠，其中，在通过钙离子或锶离子凝胶化之前，组合物包含 0. 4,0. 45,0. 5,0. 55,0. 60,0. 65,0. 70,0. 75 或 0. 80 % (w/v)的脱乙酰 壳多糖，并且独立于其地包含 0. 9,0. 95,0. 1,0. 105,0. 11,0. 115,0. 12,0. 125,0. 13,0. 135、0. 14、0. 145或I. 5% (w/v)的藻酸盐。在具体实施方案中，脱乙酰壳多糖的浓度范围在
0.5-0.7%，或0.55-0. 65%。在其他具体实施方案中，藻酸盐的浓度范围在I.至I. 4%或
1.25至I. 35%。水凝胶的一个具体实施方案包含约0. 6%的脱乙酰壳多糖和约I. 2%的藻酸盐。本发明的方法和组合物的其他实施方案涉及水凝胶组合物和其所得到的小珠，其中在混合溶液中藻酸盐与脱乙酰壳多糖的比为I. 4-2. 8，更特别为I. 5-2. 7，更特别为
I.6-2. 6，或 I. 75-2. 25。该比率的具体值为约 I. 9，I. 95，2. 0，2. 05 和 I。在本发明的方法中，小珠的平均尺寸可以调整并且通过调节用于形成被引入到钙或锶溶液中的液滴的针头的直径而凭经验确定。本文考虑直径为0.01-5_的小珠。这些尺寸在操作容易性与营养物扩散到小珠中之间提供折衷。来自本发明的脱乙酰壳多糖可以分离自不同的动物来源，如甲壳类动物(crustaceans)(对奸壳)或乌贼类动物。备选地，脱乙酰壳多糖可以是植物来源的，更特别是真菌来源的，如毛霉目(Mucoralean)菌株，总状毛霉(Mucor racemosus)和雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans),卵形抱球托霉(Gongronella butleri),黑曲霉(Aspergillus niger)，稻根霉菌(Rhizopus oryzae)，香 (Lentinus edodes)，凤尾燕(Pleurotus sajo-caju),鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii),白色念珠菌(Candida albicans)或双抱蘑 (Agaricus bisporus)。脱乙酰壳多糖还以多种类型的分子量存在。此处，脱乙酰壳多糖的链长可以对水凝胶的三维结构起作用。用于本发明的典型的脱乙酰壳多糖可以具有15-50kD、更具体是35-45kD的平均分子量。上述制备小珠的方法导致形成包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的均质混合物的球形水凝胶小珠。在具体的实施方案中，补充物被配制成由小珠和粘性凝胶形成的两相补充材料。该补充物包括聚合基质(“凝胶”)和包含脱乙酰壳多糖和藻酸盐的球形三维小珠。这允许配制可植入的或可注射的凝胶，其在植入时确保在宿主组织或器官中的最佳空间分布。此处典型地与通过本发明方法制备的小珠一起用于补充物中的凝胶是热敏性凝胶。这些凝胶在环境温度保持液态(在用于引入到患者中的装置中)，但是当引入机体时在约37°C变成固体。这种原位凝胶化保持小珠的空间分布。体外测试已经证明当加热至37°C时，小珠在这样的水凝胶中均匀分布。热敏性水凝胶的实例包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)。其一种具体的类型是脱乙酰壳多糖。
不受理论限制，据信在微珠内的脱乙酰壳多糖网络赋予小珠特定的机械特性，以使它们与仅由藻酸盐制成的小珠相比更不可压缩且更抗压。本发明的基质提供在藻酸盐凝胶内的相互连接的脱乙酰壳多糖小梁(trabeculae),其通过提供中性pH的水性介质而产生有利于细胞培养的环境。这样的小梁由不溶性脱乙酰壳多糖得到，所述不溶性脱乙酰壳多糖在与藻酸盐混合时形成团聚体，所述团聚体产生篮状结构网络或小梁。小梁的厚度和长度可变，并且为小珠提供特定的生物学特性和机械特性，如表型稳定性、可变形性、弹性和压缩模量。
实施例实施例I.制备藻酸盐/脱乙酰壳多糖小珠由脱乙酰壳多糖(最终为0. 6% )和藻酸盐(最终为I. 2% )的均质混合物制备小珠。在混合之前，分别制备这两种溶液。藻酸盐和脱乙酰壳多糖溶液以下述方式制备制备在0. 16M NaOH中的2. 4% (W/v)的藻酸盐溶液和在I. 666M HAc中的I. 333% (w/v)的脱乙酰壳多糖溶液。向10体积的藻酸盐溶液中，加入I体积的IM Hepes (4-(2-羟乙基)-1_哌嗪乙烷磺酸)溶液。均质化后，逐渐加入9体积的脱乙酰壳多糖溶液，同时规律且剧烈搅拌。将脱乙酰壳多糖/藻酸盐溶液缓慢通过25号针(25 gauges needle),以逐滴形式进A 102mM CaCl2溶液(Sigma-Aldrich (西格玛-奥德里奇)，Bornem,比利时)中。在瞬时凝胶化后，允许小珠在该CaCl2溶液中再凝胶化10分钟。在微观尺度下，脱乙酰壳多糖(被曙红染成红色)形成由不同厚度和长度的小梁或纤维组成的篮状结构(见图2和3)。此处的间隙由藻酸盐(苏木精染色成紫色)填充。实施例2.将小珠配制在热敏性水凝胶中将小珠与植物(双孢蘑燕)脱乙酰壳多糖水凝胶(Kitozyme,Alleur,比利时)混合。该步骤在低于27°C进行以避免水凝胶胶凝。使用3/l(v/v)的小珠/水凝胶的比。实施例3.在动物模型中植入将如实施例2所述的凝胶植入到具有软骨下骨和软骨缺陷关节的兔中。(图4)。植入15天后，评价所述植入物(图5)。损伤仍然被植入物填充。小珠和粘性水凝胶在注射后至少两周在损伤的关节内保持不变，同时保持安全性特征。此外，还观察到植入物群集有来源于下面的骨髓的细胞。细胞汇集(encountered)在固定的热敏性脱乙酰壳多糖水凝胶⑶以及在脱乙酰壳多糖藻酸盐小珠(C)中(脱乙酰壳多糖小梁显示为D)。该测试证实两相植入物能够容易地操作和植入。植入物的生物可降解性质确保植入后的逐渐吸收。实施例4.脱乙酰壳多糖分子量对小珠形成的影响在根据本发明的方法中已经使用了不同分子量的天然脱乙酰壳多糖。测量混合溶液(与软骨细胞一起)的不同物理参数如PH和粘度。按照本领域公知的技术测量所得到的水凝胶的渗透性。表I
权利要求
1.一种生产用于关节内补充物的水凝胶的方法，所述方法包括下述步骤 -提供藻酸盐溶液， -提供具有低于60kD的Mw的脱乙酰壳多糖的溶液， -将所述藻酸盐溶液与所述脱乙酰壳多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含O. 5-0. 7% (w/v)的脱乙酰壳多糖和1-1.4% (w/v)的藻酸盐， -将所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+阳离子的溶液中，和 -从所述具有阳离子的溶液分离凝胶化的小珠。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述混合溶液包含O.6%的脱乙酰壳多糖。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述混合溶液包含I.2%的藻酸盐。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其中在所述混合溶液中，藻酸盐和脱乙酰壳多糖以I. 75-2. 25的比率存在。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其中所述脱乙酰壳多糖具有35-45kD的Mw0
6.根据权利要求I至5中任一项所述的方法，其中所述液滴通过针，以得到直径为O. OI-5mm的小珠。
7.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其中脱乙酰壳多糖是动物来源的或植物来源的。
8.一种包含藻酸盐和Mw低于60kD的脱乙酰壳多糖的均质混合物、直径为O. 01-5mm的球形水凝胶小珠，其特征在于所述小珠包含1-1. 4%的藻酸盐和O. 5-0. 7%的脱乙酰壳多糖。
9.根据权利要求8所述的小珠，其中所述小珠包含I.2%的藻酸盐。
10.根据权利要求8或9所述的小珠，其中所述小珠包含O.6%的脱乙酰壳多糖。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的小珠，其中所述脱乙酰壳多糖具有35-45kD的Mw。
12.权利要求8至11中任一项所述的小珠用于关节内补充的应用。
13.一种包含直径为O. 01-5mm的球形水凝胶小珠的关节内补充物，所述球形水凝胶小珠包含藻酸盐和Mw低于60kD的脱乙酰壳多糖的均质混合物，其特征在于所述小珠包含1-1. 4%的藻酸盐和O. 5-0. 7%的脱乙酰壳多糖。
14.根据权利要求13所述的关节内补充物，其还包含粘性热凝胶，优选脱乙酰壳多糖水凝胶。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的关节内补充物，其中脱乙酰壳多糖是动物来源的或优选植物来源的。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的关节内补充物，其还包含选自由下列各项组成的组的成分非留体抗炎药、麻醉剂、阿片类镇痛剂、皮质类固醇、抗肿瘤药、单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、维生素、矿物质、营养制品。
17.一种用于治疗人受试者或动物的关节的补充方法，所述方法包括权利要求8至11中任一项所述的水凝胶小珠的单次或多次关节内施用。
18.一种补充装置，其包含权利要求8至11中任一项所述的水凝胶小珠。
全文摘要
一种生产用于关节内补充物的水凝胶的方法，所述方法包括下述步骤提供藻酸盐溶液，提供具有低于60kD的Mw的脱乙酰壳多糖的溶液，将藻酸盐溶液与脱乙酰壳多糖溶液混合，其中所述混合溶液包含0.5-0.7％(w/v)的脱乙酰壳多糖和1-1.4％(w/v)的藻酸盐，将所述混合溶液的液滴引入到具有Ca2+或Sr2+阳离子的溶液中，和从所述具有阳离子的溶液分离聚合的小珠。
文档编号A61L27/52GK102762233SQ201180008577
公开日2012年10月31日 申请日期2011年2月11日 优先权日2010年2月25日
发明者伊夫·昂罗丹, 克里斯泰勒·桑谢, 弗雷德里克·奥普雷涅茨克, 皮埃尔·德里翁 申请人:列日大学, 基多塞米股份公司