专利名称：损伤部位治疗用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及损伤部位治疗用组合物以及使用该组合物的治疗方法。
背景技术：
在现有的医疗中，作为针对难以治疗的疾病的通用替代技术，利用干细胞的再生医疗受到了人们的关注。利用干细胞的再生医疗在对于全部疑难病的新型临床平台中是有希望的手段。已经有以胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)以及成体干细胞为代表的各种干细胞的报告。在成体干细胞中，由骨髓、脂肪组织、皮肤、脐带、胎盘等各种组织中分离出的间充质干细胞(MSC)被特别用于皮肤再生的临床应用方面。但是，骨髓穿刺对于供体来说为一种侵袭性且有痛性的技术。进一步地，骨髓干细胞(BMSC)的数目、增殖以及分化能力随着年龄的增长而降低。可应用再生医疗或期待应用再生医疗的疾病有很多，已经进行了许多面向临床应用的研究。神经疾病、特别是脊髓损伤等难治性神经疾病为期待利用再生医疗进行治疗的疾病之一。人们已经认识到，使用 人胎儿或ES细胞来源的神经干细胞来进行的难治性神经疾病的移植治疗(例如日本特开2002-281962号公报)为具有现实性的研究课题，但其在伦理性、安全性方面大有问题，对于实用性的“干细胞源”迄今仍为摸索状态(例如Keirstead et al·，Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitorcelItransplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury,Journal ofNeuroscience(2005)vol. 25(19)pp. 4694 ；0kano et al. , Neural stem cellsandregeneration of injured spinal cord,Kidney international(2005), Vol. 68, pp.1927—1931 ；Okada et al.，Spatiotemporal recapitulation of central nervous systemdevelopment bymurine embryonic stem cell derived neural stem and progenitorcells, Stem Cells (2008) vol. 26(12)pp. 3086-3098)。作为生物体内干细胞，有骨髓或脂肪来源的干细胞(例如国际公开第02/086108号小册子)，这些干细胞有几个缺点，即(1)随着年龄的增加，可采集的干细胞数目减少；(2)随着年龄的增加而累积的基因变异使得移植干细胞难以确保安全性；(3)细胞增殖能力低；(4)干细胞采集中伴随有剧烈的生物体侵袭(例如Gronthos etal., Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo,ProcNatl Acad SciUSA(2000)vol. 97(25)pp. 13625-13630 ；Miura et al. , SHED:stem cellsfrom humanexfoliated deciduous teeth,Proceedings of the National Academy ofSciences (2003) Vol. 100, 5807-5812);等等。开发出用于解决这些问题的新型难治性神经疾病治疗用干细胞资源是重要的。人脱落乳牙牙髓干细胞(stemcells from exfoliated deciduous teeth ；SHED)及智齿来源的恒牙牙髓干细胞(dental pulp stem cells ；DPSC)是医疗废弃物,经鉴定其是与BMSC具有同样的自我复制能力和多分化能力的新型干细胞群。这些细胞是显示出与神经谱系相近性状的神经嵴来源的细胞群，在分化诱导为神经细胞方面显示出较高的反应性(例如，Miura et al. , SHED: stem cells fromhumanexfoliated deciduous teeth, Proceedings of the National Academy ofSciences(2003)Vol. 100, 5807-5812 ；Arthur et al·，Adult human dental pulp stemcells differentiate towardfunctionalIy active neurons under appropriateenvironmental cues, Stem Cells (2008) vol. 26 (7) pp. 1787-1795)。SHED 与 DPSC 为自身来源的组织干细胞，因而移植中的安全性高，也极少有伦理问题。但是，在现有的SHED与DPSC的研究中，除了神经细胞谱系的片段化分析、或将神经分化诱导后的SHED或DPSC移植到啮齿类中对其生存进行观察之外，并未明确提出更进一步的技术思想(例如Arthur et al. , Adult human dental pulp stemcellsdifferentiate toward functionally active neurons under appropriateenvironmental cues,Stem Cel Is (2008)vol. 26 (7)pp. 1787-1795;Huang etal., Putative dental pulp-derivedstem/stromal cells promote proliferation anddifferentiation of endogenous neural cells inthe hippocampus of mice,StemCells(2008)vol. 26(10)pp. 2654-2663)。进一步地，据报告，DPSC具有可用于神经系统疾病、心脏病等全身性疾病用的基于细胞的治疗中的可能性，并且DPSC可减轻缺血性疾病(Arthur et al.，Adult humandentalpulp stem cells differentiate toward functionalIy active neurons underappropriateenvironmental cues,Stem Cells (2008)vol. 26(7) pp. 1787-1795 ；GandiaC，Arminan A, Garcia-Verdugo JMj et al., Human dental pulp stem cells improve leftventricular function,induce angiogenesis，and reduce infarct size in rats withacute myocardial infarction, StemCells 2008 ；26:638-645. ；Iohara K，Zheng Lj WakeH，et al. , A novel st em cell source forvasculogenesis in schemia:subfraction ofside population cells from dental pulp, StemCells 2008 ；26:2408-2418.)0另外，近年来的研究显示出MSC可有助于皮肤修复。进一步针对通过各种生长因子的外用来治愈创伤进行了广泛的研究。但是，在临床上尚未确认到通过以生长因子单次给药、多次给药来进行使用的结果、或者为了期待协同效应而将2个以上因子合用的结果。进一步地，过度暴露于太阳光的老龄人群的处理对药用化妆品和皮肤科医生来说是一大重点，为了对褶皱等光老化后的皮肤的部分症状进行处理，使用各种非侵袭性的处理和局部药用化妆品(Chung JHj Youn SHj Kwon OS，Cho KHj Youn JIj Eun HC.，Regulationsof collagen synthesis by ascorbic acid,transforming growth factor—betaandinterferongamma in human dermal fibroblasts cultured in three-dimensionalcollagen gelare photoaging—and aging-1ndependent,J Dermatol Sci 1997 ；15:188-200. ；FitzPatrick RE，Rostan EF. , Reversal of photodamage with topicalgrowth factors:a pilot study,J CosmetLaser Ther 2003;5:25-34)。在短波长紫外线(UVB)中的暴露为老化的原因之一，已知该暴露会在真皮中剌激基于人皮肤成纤维细胞(HDF)的胶原酶产生、上调胶原酶基因的表达。可认为其诱导了胶原蛋白的分解以及表现为皮肤的褶皱和黄变的变性弹性组织的沉积。
以前的研究显示出MSC可产生血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(TOGF)、转化生长因子-β (TGF-β)等各种细胞因子。近年来，据报告，细胞因子的产生和分泌为MSC的重要功能，特别是在皮肤生物学中已经验证了 MSC的多样药理学作用(JettanacheawchankitS，Sasithanasate S，Sangvanich P，Banlunara W，Thunyakitpisal P. , Acemannanstimulatesgingival fibroblast proliferation ;expressions of keratinocytegrowth factor-1,vascularendothelial growth factor,and type I collagen ；andwound healing，J Pharmacol Sc1.2009Apr ；109(4) :525-531 ；Miura et al.，SHED:stemcells from human exfoliated deciduousteeth，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences (2003) Vol. 100，5807-5812 ;SafaviSM，Kazemi B，EsmaeiliM，Fallah A，Modarresi A，Mir M. , Effects of low-level He-Nelaser irradiationon the gene expression of IL-1betajTNF—alpha，IFN—gamma，TGF—beta，bFGF，and PDGF in rat’s gingival,Lasers Med Sc1. 2008Jul ；23 (3) :331-335 ;SaygunI,Karacay S，Serdar M，Ural AU，Sencimen M，Kurtis B，Effects of laser irradiationon therelease of basic fibroblast growth factor(bFGF)，insulin like growthfactor-1 (IGF-1)，andreceptor of IGF-1 (IGFBP3)from gingival fibroblasts, LasersMed Sc1.2008Apr ；23(2) :211-215) 0例如，据报告，MSC通过多样生长因子的产生而具有皮肤治愈效果(参照 Minoru Uedaj The Use of fibroblasts, The Biochemical Society,11-15，2007)。这些生长因子使HDF活化，增加HDF的增殖/移行，介导HDF中的胶原蛋白分泌。MSC的分泌因子显示出了保护HDF免受氧化应激的作用，从而也验证了 MSC的抗氧化效果。局部生长因子的使用会剌激面部光老化的修复，通过新的胶原蛋白合成、减少上皮肥厚以及减少人眼可见的褶皱而具有光滑的皮肤临床外观(He H，Yu JjLiu Y，et al., Effectsof FGF2 and TGFbeta Ion the differentiation of human dental pulp stem cellsinvitro, Cell Biol Int 2008 ;32:827-834 ;Robey PG.，Stem cells near the centurymark, J ClinInvest 2000 ； 105:1489-1491.)0
发明内容
发明所要解决的 课题但是，使用SHED或DPSC这样的牙髓干细胞可进行怎样的医学应用这一点尚未明确，具体的对象疾病也全然未知。本发明的课题在于提供利用牙髓干细胞的新型治疗手段。解决课题的手段本发明包含以下方式。[I] 一种损伤部位治疗用组合物，其用于修复靶组织的损伤部位，该组合物含有通过培养干细胞而得到的干细胞培养上清。[2]如[I]中所述的损伤部位治疗用组合物，其中，该组合物不含有上述干细胞。[3]如[I]或[2]中所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞的培养上清含有至少2种细胞因子。[4]如[I] [3]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞的培[5]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞来源的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞为牙的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，该组合物不含有
养上清含有选自由血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(TOGF)、转化生长因子-β (TGF-β)组成的组中的至少2种细胞因子。[5]如[I] [4]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述干细胞为成体干细胞。[6]如[I]
于间充质干细胞。[7]如[I]
髓干细胞。[8]如[I]血清。[9]如[ I] [8]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述损伤部位治疗为皮肤、牙周组织或者骨的损伤的治疗；脑硬塞治疗；或中枢神经疾病治疗。[10]如[I] [9]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，上述损伤部位治疗为中枢神经疾病的治疗，上述中枢神经疾病为选自由脊髓损伤、神经退行性疾病、神经细胞的退行或脱落以及伴有神经细胞障碍的视网膜疾病组成的组中的疾病或病症。[11]如[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物的制造方法，其包括以下步骤⑴ ⑶(I)从牙髓细胞中挑选出粘附细胞的步骤；(2)对上述粘附细胞进行培养的步骤；和(3)回收培养上清的步骤。[12]如[11]中所述的制造方法，其进一步包括以下的步骤⑷(4)对于回收后的培养上清进行处理的步骤，所述处理选自由离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐和保存组成的组中的至少I种。[13]如[11]或[12]中所述的制造方法，其进一步包括下述步骤(a)和(b)的任意一个步骤(a)针对所回收的培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；和(b)针对所回收的培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。[14] 一种损伤部位治疗方法，其为用于修复靶组织的损伤部位的损伤部位治疗方法，其中，该方法包括将[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物以用于修复上述靶组织的损伤部位的有效量对具有上述损伤部位治疗用组合物的靶组织的患者进行给药的步骤。[15]如[14]中所述的损伤部位治疗方法，其中，对于上述给药，上述损伤部位的修复是基于内源性干细胞的能力来进行的。[16]如[14]或[15]中所述的损伤部位治疗方法,其中,通过选自由静脉给药、动脉给药、门静脉给药、皮内给药、皮下给药、肌肉给药、腹腔给药和鼻腔给药组成的组中的给药方法进行上述损伤部位治疗用组合物的给药。[17] 一种脑梗塞的治疗方法，该方法包括将[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物以用于修复脑损伤部位的治疗有效量对脑梗塞患者进行给药的步骤。 [18]如[17]中所述的脑梗塞的治疗方法，其中，上述损伤部位治疗用组合物通过鼻腔给药进行给药。[19] 一种中枢神经疾病的治疗方法，该方法包括将[I] [10]的任一项所述的损伤部位治疗用组合物作为中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。[20]如[19]中所述的治疗方法，其中，在与上述中枢神经疾病治疗用组合物给药的同时或在该中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以牙髓干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[21]如[20]中所述的治疗方法，其中，上述牙髓干细胞为采集后未进行分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞、或者为采集后后分化诱导为神经系统细胞的分化诱导型牙髓干细胞。[22]如[19] [21]的任一项所述的治疗方法，其中，在上述中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[23] 一种方法，其是判断所制备的牙髓干细胞的培养上清作为在上述[19] 的任意I项所述的中枢疾病治疗方法中使用的中枢疾病治疗用组合物的有效成分是否有效的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)中的至少一个步骤(a)针对上述培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；以及(b)针对上述培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。发明的效果根据本发明，可以提供利用牙髓干细胞的新型治疗手段，S卩，可以提供损伤部位治疗用组合物、及其制造方法、以及使用损伤部位治疗用组合物的损伤部位治疗方法。
图1为用于说明使用无毛小鼠的实验设计的图。褶皱经UVB照射诱导。图2为表示各种细胞类型中的形态、免疫分析和增殖率的图。(A-C)中，(A)表示BMSC, (B)表示DPSC，并且(C)表示SHED (X 40)。(D-F)表示作为干细胞标记物的STR0-1的免疫荧光染色像。(D)BMSC, (E)DPSC,以及(F) SHED为STR0-1阳性(绿色)。DAPI用于使核可视化(蓝色)。(G) SHED,DPSCs,以及BMSC的增殖率使用BrdU进行评价。条线(bar)标准偏差。显著差异*P〈0. 05.图3为表示SH-CM注入后利用复制(> Vj力)分析进行褶皱评价的图。㈧处理组、(B) 100%, SH-CM处理组图4为表示SH-CM和SHED注入组的通常水平下的褶皱改善的图。图5为表示苏木素-伊红染色像的图。㈧表示SH-CM处理组、⑶表示SHED注入组。图6为对真皮的厚度进行比较的曲线图。图7为表示SH-CM在HDF增殖中的影响的图。
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8为表示SH-CM对I型胶原蛋白和MMPl的影响的Western印迹分析图。9为概念性说明使用本发明组合物的骨再生机理的图。
10为概要说明本发明实施例3中的实验方法的图。
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为说明本发明实施例为表示本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例为说明本发明实施例
3中所用BIC值的计算的图。
3的结果的染色像。
3的结果的图。
3的结果的照片。
3的临床例的结果的X射线照片像。
4的实验模型的图。
4中所用的处理样式的照片。
4中所用的处理样式的照片。
4中所用的处理样式的图。
为用于说明作为本发明实施例4的结果而得到的牙骨质的再生状态的染色像。上图表示使用GF的情况下的图、下图表示使用PRP的情况下的照片。图21为表示本发明实施例4的结果的曲线图(N2-NC)。图22为表示本发明实施例4的结果的曲线图(N1-JE)。图23为用于说明本发明实施例4的临床例中的前处理的照片。图24为用于说明本发明实施例4的临床例中的处理方法的照片。图25为表示本发明实施例4中的临床例的结果的照片。图26为用于说明本发明实施例5的脑梗塞制作的图。图27为表示本发明实施例5中的第I组、第II组和第III组的鼻腔给药开始后的障碍评分变化的曲线图。图28为用于说明本发明实施例5中的第I组、第II组和第III组的鼻腔给药开始后第16天的梗塞容积的曲线图。图29为用于说明培养上清的制备法的示意图。hSHED :人乳牙牙髓干细胞、hDPSC 恒牙牙髓干细胞、hBMSC :人骨髓间充质干细胞、hFibroblast :人成纤维细胞。图30为表示神经突起生长实验的结果的照片(相位差显微镜像)。图31为神经突起生长实验的结果。其为表示确认到神经突起的细胞的比例(左)与神经突起的长度(右)的曲线图。图32为表示神经突起生长实验的结果的照片(相位差显微镜像)。图33为神经突起生长实验的结果。其为表示确认到神经突起的细胞的比例(左)与神经突起的长度(右)的曲线图。图34为表示凋亡抑制实验(TUNEL法)的结果的照片。图35为凋亡抑制实验(TUNEL法)的结果，其为对牙髓干细胞的培养上清所致的凋亡抑制效果进行统计处理的曲线图。左为对CSPG存在下的凋亡抑制效果进行确认的曲线图，右为对MAG存在下的凋亡抑制效果进行确认的曲线图。图36为表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果的曲线图。SHED-CM :牙髓干细胞培养上清给药组；BMSC-CM :骨髓间充质干细胞培养上清给药组；对照PBS给药组。图37表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果。表示对照组与SHED-CM组的脊髓状态的比较(上)和脊髓重量的比较(下)。图38表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果。SHED-CM :牙髓干细胞培养上清给药组；对照=PBS给药组。图39表示使用脊髓挤压伤模型动物的实验结果。SHED-CM :牙髓干细胞培养上清给药组；对照=PBS给药组。
具体实施例方式〈损伤部位治疗用组合物〉本发明的损伤部位治疗用组合物为用于修复靶组织的损伤部位的损伤部位治疗用组合物，其含有通过对干细胞进行培养而得到的干细胞培养上清。另外，本发明的损伤部位治疗方法为用于修复或恢复靶组织的损伤部位的损伤部位治疗方法，该损伤部位治疗方法包括将上述损伤部位治疗用组合物以用于修复上述靶组织的损伤部位的有效量对具有上述损伤部位治疗用组合物的靶组织的患者进行给药的步骤。当SHED在创伤治愈中的应用仍为推论时，本发明的发明人率先对于人乳牙牙髓干细胞(SHED)来源的生长因子与人皮肤成纤维细胞(HDF)的关系进行了研究。SHED通过提高胶原蛋白合成以及通过活化HDF的增殖和移行活性而对HDF产生影响。这暗示了 SHED或SHED来源细胞上清(SH-CM)可用于光老化的治疗中。结果暗示出，SHED和SH-CM应该会结构性地适用于光老化治疗中。SHED主要与所分泌的生长因子或细胞外基质蛋白一起在增强HDF的创伤治愈能力方面发挥作用。使用针对各生长因子的中和抗体所进一步进行的机理研究明确了创伤治愈过程中SHED的可溶性因子的作用。另外，乳牙是在儿童期自然脱落的，通常就那样被废弃。因而，利用乳牙牙髓干细胞具有如下的重大优点不消说其没有与采集相伴的侵袭性的问题， 在利用时也没有伦理问题。根据本发明，将培养干细胞所得到的干细胞培养上清作为损伤部位治疗用组合物的有效成分。该干细胞培养上清含有细胞因子混合物，因而在应用于损伤部位时，可使损伤部位的细胞增殖，其结果，能够对具有损伤部位的组织进行修复。在本发明的一个方式中，可以推断，本发明所使用的干细胞培养上清中的细胞因子的混合物通过作为针对靶组织的内源性干细胞的诱导信号发挥作用，从而可使上述内源性干细胞发生分化、增殖。其结果，可进行靶组织的损伤部位处的细胞的增殖和细胞外基质的生成等。基于这些原因可以认为，具有损伤部位的组织可基于靶组织内源性干细胞的这样的再生能力而进行修复。例如，通过使与皮肤再生相关的2种以上的生长因子从MSC中分泌出，可以使SHED和SHED来源生长因子对于UVB诱导性光损伤进行恢复。于是，通过8周的UVB照射疗法来诱导无毛小鼠产生褶皱，对SHED及其细胞上清的皮下注射所致的抗褶皱效果进行了研究。进一步地，通过进一步使用培养HDF中的SH-CM，对于用于改善旁分泌通路所介导的褶皱形成的机理进行了研究。本发明中的“损伤部位”意味着组织中产生物理性或生理性缺陷、无法发挥出原本的功能的组织上的部位，其作为不仅包括外伤、也包括由于组织的物理性或生理性缺陷所引起的伤害部、障碍部或疾病部的概念来使用。本发明中的“修复”意味着靶组织中由于损伤而丧失的全部或部分功能相比于损伤时损伤部位的功能得到维持或恢复，其不仅包括组织功能的恢复，也广义地包括再生为功能性组织的情况。功能得到维持或恢复的评价根据发生损伤的组织的不同而不同，但只要基于通常用于评价外观、对象功能的程度的分析等来进行即可。作为本发明中所用的成体干细胞的示例，包括来源于真皮系、消化系统、骨髓系、神经系统等的干细胞，但并不限于这些。作为真皮系成体干细胞的示例，包括上皮干细胞、毛囊干细胞等。作为消化系统成体干细胞的示例，包括胰腺(全部)干细胞、肝干细胞等。作为骨髓系成体干细胞的示例，包括造血干细胞、间充质干细胞等。作为神经系统成体干细胞的示例，包括神经干细胞、视网膜干细胞等。本发明中所用的成体干细胞可以为天然的，也可以为基因修饰的，只要能够实现目的处理即可。干细胞的起源分类为外胚叶、内胚叶、或者中胚叶。外胚叶起源的干细胞主要存在于脑中，包括神经干细胞。内胚叶起源的干细胞主要存在于骨髓中，包括血管干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等。中胚叶起源的干细胞主要存在于脏器中，包括肝干细胞、胰腺干细胞等。本发明中优选使用可来源于任意间充质的成体干细胞，更优选使用来源于牙髓的成体干细胞、最优选使用来源于人的脱落乳牙的成体干细胞。间充质来源的成体干细胞可产生血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子O3DGF)、转化生长因子-β - (TGF- β )-1和转化生长因子-β -3,TGF- a、KGF、HBEGF, SPARC等各种细胞 因子。本发明中，干细胞培养上清优选含有至少2种细胞因子，更优选含有选自由血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(TOGF)和转化生长因子-β (TGF-β)组成的组中的2种以上的组合。本发明中所用的细胞因子的混合物可以以干细胞培养上清的一部分的形式或以从干细胞培养上清中分离出的细胞因子的混合物的形式来使用。从干细胞培养上清中分离出的细胞因子的混合物中，细胞因子的一部分可以置换为I或2种以上公知的相应的细胞因子。本发明中所用的干细胞培养上清中，为了避免排斥，优选从来源于具有靶组织的相同个体的成体干细胞的培养中来获得。靶组织可以与为了得到干细胞培养上清而使用的成体干细胞所来源的组织相同，也可以不同。本发明中所用的干细胞培养上清并不限定于由成体干细胞的培养而得到的干细胞培养上清，其可以包括由胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎癌性细胞(EC细胞)等的培养而得到的干细胞培养上清。成体干细胞的培养上清为对成体干细胞进行培养而得到的培养液，不包括细胞本身。因而，例如可以通过在培养后分离去除细胞成分来得到可用于本发明的培养上清。也可以使用适当施有各种处理(例如离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等)的培养上清。用于得到干细胞培养上清的干细胞可通过常规方法进行选择，可基于细胞的大小或形态进行选择，或者以粘附细胞的形式进行选择。在为牙髓干细胞的情况下，如后所述，可以由脱落的乳牙或恒牙采集牙髓细胞，由所采集的牙髓细胞中以粘附细胞或其传代细胞的形式进行选择。后述的中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法也可优选地适用作上述损伤部位治疗用组合物的制造方法。在牙髓干细胞培养上清中，可以使用对选定的干细胞进行培养而得到的培养上清。在使用其它干细胞的情况下，可以从可含有目的干细胞的组织中同样地得到干细胞，由此得到干细胞培养上清。另外，“干细胞培养上清”被定义为对干细胞进行培养而得到的不含有细胞本身的培养液。本发明的组合物含有“干细胞培养上清”作为有效成分，在其一个方式中，作为组合物整体也不含有细胞(不论细胞的种类如何)。该方式的组合物由于该特征，因而与干细胞本身有明显区别，这自不必说，因此与含有干细胞的各种组合物有明显区别。该方式的典型例为不包括干细胞、仅由干细胞培养上清构成的组合物。干细胞的培养液中可以使用基础培养基、或在基础培养基中添加有血清等而成的培养液等。其中，为了制备不含血清的“牙髓干细胞培养上清”，可在整个过程中、或在最后或最后几次的传代培养中使用无血清培养基。另外，作为基础培养基，可以使用DMEM，还可以使用伊思考夫改良杜尔贝可培养基(MDM) (GIBC0社等)、Ham’ sF12培养基(HamF12)(SIGMA社、GIBCO社等)、RPMI1640培养基等。可以将两种以上的基础培养基合用。作为混合培养基的一例，可以举出将MDM与HamF12等量混合而成的培养基(例如作为商品名MDM/HamF12(GIBC0社)市售)。另外，作为可添加到培养基中的成分的示例，可以举出血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)、血清替代物(Knockout serum replacement (KSR)等)、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、各种维生素、各种矿物质。干细胞的培养中，可以直接应用通常所用的条件。在干细胞培养上清的制造方法中，除了根据干细胞的种类适当调整干细胞的分离和选择工序以外，可以与后述的中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法相同。根据干细胞的种类进行的干细胞的分离和选择可以由本领域技术人员来适当进行。对本发明中的靶组织没有特别限定，其示例包括皮肤、骨、牙周组织、脑等。本发明的组合物在这样的靶组织的修复中是有效的。作为示例，图9中表示使用本发明组合物的骨再生机理的示意图。本发明的组合物对于与组织损伤相关的疾病的治疗也是有效的。作为这样的疾病的示例，可以举出脑梗塞、牙周病、脊髓损伤、皮肤溃疡、骨质疏松症等。换言之，本发明的组合物为脑梗塞、牙周病、脊髓损伤、皮肤溃疡、骨质疏松症等的治疗用组合物，其包括通过对成体干细胞进行培养而得到的干细胞培养上清。例如，本发明的损伤部位治疗用组合物可以用作用于皮肤、牙周组织或者骨损伤的治疗、脑梗塞的治疗、或者中枢神经疾病的治疗等损伤部位治疗的组合物。作为上述损伤部位治疗用组合物的给药量，只要为治疗有效量即可。上述损伤部位治疗用组合物以干细胞培养上清为有效成分，因而在治疗中进行使用时，只要适当调整上述损伤部位治疗用组合物的给药量即可，也可如后所述对有效成分进行浓缩来使用。
在可根据所应用的被检体的状态来维持所期待的治疗效果的条件下，在本发明的组合物中追加其它成分来进行使用也是无妨的。可在本发明中追加使用的成分的一例如下。(i)生物体吸收性材料可以使用作为有机系生物体吸收性材料的透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白原(例如B0LHEAL (注册商标))等。
(ii)凝胶化材料凝胶化材料优选使用生物体亲和性高的材料，可以使用透明质酸、胶原蛋白或纤维蛋白糊等。作为透明质酸、胶原蛋白，可以选择各种物质进行使用，优选采用适于本发明组合物的应用目的(应用组织)的物质。所使用的胶原蛋白优选为可溶性的(酸可溶性胶原蛋白、碱可溶性胶原蛋白、酶可溶性胶原蛋白等)。(iii)其他也可以含有制剂上容许的其它成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟基甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为无痛化剂，可以使用苯甲醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。也可以含有抗生素、pH调节剂、生长因子(例如上皮细胞生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF))等。对本发明组合物的最终形态没有特别限定。形态例为液体状(液态、凝胶状等)和固体状(粉状、细粒、颗粒状等)。本发明的其它方式还包括对靶组织的损伤部位进行修复的方法、以及对损伤的组织进行治疗的方法。这些方法包括将上述干细胞培养上清分别对靶组织的损伤部位或损伤组织进行给药。由此，可有效修复具有损伤部分的靶组织。特别是在靶组织为脑的情况下，也可优选适用作脑梗塞的治疗方法。作为上述损伤部位治疗用组合物的给药方法和给药途径并无 特别限制。例如，优选进行上述损伤部位治疗用组合物的非口服给药，作为非口服给药，可以为全身性给药，也可以为局部给药。作为局部给药的示例，可以举出向目的组织中的注入、涂布或喷雾等。作为上述损伤部位治疗用组合物的给药方法的示例，可以举出静脉给药、动脉给药、门静脉给药、皮内给药、皮下给药、肌肉给药、腹腔给药以及鼻腔给药等。其中，鼻腔给药等是低侵袭性的，为优选。作为给药方案，例如可以采用一日一次 数次、两日一次、或三日一次等。在给药方案的制作中，可以考虑对象(接受者)的性別、年龄、体重、病症等。给药方法的选择可由本领域技术人员基于靶组织的种类、治疗对象疾病的种类等来进行。例如，在靶组织位于头部的疾病的治疗或损伤组织的修复等中，出于无需考虑血脑屏障的透过、低侵袭性的原因，特别优选适用鼻腔给药等。例如，在靶组织为脑的情况下，可优选适用鼻腔给药。另外，对于脑梗塞的治疗，可优选适用鼻腔给药。上述损伤部位治疗用组合物进行给药的对象代表性地为靶组织具有损伤的人患者，认为其也可应用于人以外的哺乳动物(包括宠物动物、家畜、实验动物。具体地说，例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、牛、猪、山羊、绵羊、犬、猫等)中。另外，本发明的脑梗塞的治疗方法包括以上述干细胞培养上清进行鼻腔给药，对脑的损伤部位进行修复的步骤。根据本治疗方法，能够以低侵袭性且有效地使由于脑梗塞而受到损伤的区域得到恢复。
<中枢神经疾病治疗用组合物>本发明的其它方式特别包括中枢神经疾病治疗用组合物和中枢神经疾病治疗方法。本发明人在上述背景下进行了研究。从而明确了牙髓干细胞为共表达神经干细胞标记物、分化神经细胞标记物、星形细胞标记物以及少突神经胶质细胞标记物等全部的神经谱系标记物的稀有细胞群，明确了牙髓干细胞高表达脑源性神经营养因子(BDNF ；Brain-derived neurotrophic factor),同时通过动物实验验证了牙髓干细胞促进神经的再生(参照日本特愿2010-92585号)。如上所述，以往期待牙髓干细胞(SHED、DPSC)的潜在能力，从各种角度对作为细胞的有用性进行了研究。 在研究的进一步进展中，本发明人对以往的视点进行了极大的改变，着眼于牙髓干细胞培养上清施行了各种实验。此处，作为已知的事实，末梢神经在损伤后易于再生，中枢神经(大脑、脊髓)几乎不再生。不会发生中枢神经的再生的最大理由在于“损伤后的中枢神经系统中存在各种会抑制再生轴突生长的因子”。到目前为止已经鉴定出了活化星形细胞来源的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)之类的神经再生抑制因子。这些抑制物质通过细胞内蛋白Rho、R0CK的活化来抑制神经轴突的生长、诱发凋亡。尚未发现即使在神经再生抑制因子的存在下也会抑制凋亡、发挥出轴突生长效果的药剂。本发明人的分析结果揭示出了牙髓干细胞培养上清即使在损伤的中枢神经系统环境(即在存在有会抑制神经突起的生长、诱发凋亡的物质的环境)下也可抑制神经再生抑制物质的作用(解除抑制)、促进神经突起的生长、抑制凋亡这样的令人吃惊的事实。另外还使用脊髓损伤模型动物验证了牙髓干细胞培养上清的效果，结果牙髓干细胞培养上清的给药使下肢运动功能有显著改善。并且，根据组织学评价的结果，牙髓干细胞培养上清的给药抑制了脊髓的形态变化和神经损伤的扩大。由此，通过动物实验也确认到了牙髓干细胞培养上清的优异的再生-治疗效果。如上所述，本发明人进行了深入研究，结果带来了牙髓干细胞培养上清对于中枢神经系统的再生-治愈极为有效这样的技术思想。以下示出的本发明主要以该技术思想为基础。需要说明的是，牙髓干细胞培养上清在事先准备和保存的方面要比使用牙髓干细胞本身的情况更为有利 ，特别适于中枢神经系统疾病的急性期或亚急性期的治疗。并且，在不含有细胞成分、可克服免疫排斥问题这一点上，牙髓干细胞培养上清的有用性也是极高的。本发明的本方式包括下述内容。[I] 一种中 枢神经疾病治疗用组合物，其中，其含有牙髓干细胞培养上清。[2]如[I]中所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其在神经再生抑制物质存在下显示出神经突起生长作用。[3]如[2]中所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，上述神经再生抑制物质为硫酸软骨素蛋白多糖或髓磷脂相关糖蛋白。[4]如[I] [3]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其对神经细胞显示出凋亡抑制作用。[5]如[I] [4]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其不含有牙髓干细胞。[6]如[I] [4]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其是与牙髓干细胞组合形成的。[7]如[6]中所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其特征在于，上述牙髓干细胞为在采集后未经分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞。 [8]如[I] [7]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其不含有血清。[9]如[I] [9]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，上述培养上清为对牙髓细胞中的粘附细胞或其传代细胞进行培养而得到的培养上清。[10]如[I] [9]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物，其中，上述中枢神经疾病为选自由脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症等神经退行性疾病；脑缺血、脑内出血或脑梗塞所致的神经细胞的退行-脱落、以及伴有神经细胞障碍的视网膜疾病组成的组中的疾病或病症。[11]中枢神经疾病治疗用组合物的制造法，其包括下述步骤(I) (3)(I)从牙髓细胞中挑选出粘附细胞的步骤；(2)对上述粘附细胞进行培养的步骤；和(3)回收培养上清的步骤。[12]如[11]中所述的制造法，其中，使用不含有血清的培养基进行步骤(2)。[13]如[11]或[12]中所述的制造法，其中，在步骤(3)中，回收传代培养后的培
养上清。[14]如[11] [13]的任一项所述的制造法,其进一步包括下述步骤⑷(4)对于回收后的培养上清进行处理的步骤，所述处理选自由离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐和保存组成的组中一种以上。[15]如[11] [14]的任一项所述的制造法，其进一步包括下述步骤(a)和/或(b)(a)针对所回收的培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；(b)针对所回收的培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。[16]如[11] [15]的任一项所述的制造法，其中，上述中枢神经疾病为选自由脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症等神经退行性疾病；脑缺血、脑内出血、或者脑梗塞所致的神经细胞的退行-脱落、以及伴有神经细胞障碍的视网膜疾病组成的组中的疾病或病症。[17] 一种中枢神经疾病的治疗方法，其包括将[I] [10]的任一项所述的中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。[18]如[17]中所述的治疗方法，其中，在与上述中枢神经疾病治疗用组合物给药的同时或在该中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以牙髓干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[19]如[18]中所述的治疗方法，其中，上述牙髓干细胞为在采集后未进行分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞、或者为采集后分化诱导为神经系统细胞的分化诱导型牙髓干细胞。
[20]如[17]中所述的治疗方法，其中，在上述中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞对上述中枢神经疾病患者进行给药。[21] 一种方法，其是判断所制备的牙髓干细胞培养上清作为中枢神经系统疾病治疗用的有效成分是否有效的方法，该方法包括下述步骤(a)和/或(b)(a)针对上述培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；和(b)针对上述培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。本发明的中枢神经疾病治疗用组合物的特征在于，其含有牙髓干细胞培养上清。牙髓干细胞大致存在有两种。即为乳牙牙髓干细胞与恒牙牙髓干细胞。在本说明书中，按照惯例，将乳牙牙髓干细胞简称为SHED、将恒牙牙髓干细胞简称为DPSC。SHED培养上清和DPSC培养上清的任意一种均可用作构成本中枢神经疾病治疗用组合物的培养上清。上述中枢神经疾病治疗用组合物可通过下述特性、即“在神经再生抑制物质的存在下显示出神经突起生长作用”而具有特征。与末梢神经系统不同，中枢神经系统中存在有神经再生抑制物质(神经突起生长抑制因子)。这一点在谋求中枢神经疾病的治疗(主要为神经再生)上是重要的，需要进行考虑。利用具备上述特性的上述中枢神经疾病治疗用组合物，可抑制神经再生抑制物质的作用，促进神经的再生。神经再生抑制物质的示例为硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)和髓磷脂相关糖蛋白(MAG)。上述中枢神经疾病治疗用组合物是否具备该特性例如可通过使用神经细胞和神经再生抑制物质(CSPG或MAG)的体外实验(详细内容参照后述的实施例)来进行确认(在被测组合物与CSPG或MAG的共存下进行神经细胞的培养的情况下，只要观察到神经突起的生长，就可判断被测组合物具备该特性)。上述中枢神经疾病治疗用组合物还可通过下述特性、即“对神经细胞显示出凋亡抑制作用”而具有特征。上述中枢神经疾病治疗用组合物是否具备该特性例如可通过使用神经细胞的体外实验(详细内容参照后述实施例)来进行确认(在被测组合物的存在下进行神经细胞的培养的情况下，只要观察到抑制了基于凋亡的细胞死亡，即可判断被测组合物具备该特性)。需要说明的是，在优选方式中，上述中枢神经疾病治疗用组合物同时具备该特性与上述特性(在神经再生抑制物质的存在下显示出神经突起生长作用)。在本方式中，术语“牙髓干细胞培养上清”为对牙髓干细胞进行培养而得到的培养液，其不含有细胞成分(即牙髓细胞或牙髓干细胞)。因而，例如通过培养后分离除去细胞成分，能够得到可用于本发明的培养上清。可以使用适当施有各种处理(例如离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等)的培养上清。培养上清处理方法的详细内容如后述 。牙髓干细胞可以以牙髓细胞中的粘附细胞的形式来挑选。因而，可以将对采集自脱落的乳牙或恒牙的牙髓细胞中的粘附细胞或其传代细胞进行培养而得到的培养上清作为“牙髓干细胞培养上清”进行使用。另外，关于“牙髓干细胞培养上清”制备方法的详细内容如后述。如上所述，“牙髓干细胞培养上清”被定义为对牙髓干细胞进行培养而得到的、不含有细胞成分的培养液。上述中枢神经疾病治疗用组合物含有“牙髓干细胞培养上清”作为有效成分，在其一个方式中，作为组合物整体也不含有细胞(不论细胞的种类如何)。该方式的组合物由于该特征，因而与牙髓干细胞本身有明显区别，这自不必说，因此与含有牙髓干细胞的各种组合物有明显区别。另外，该方式的典型例为仅由牙髓干细胞培养上清构成的组合物。另一方面，本方式的一个实施方式的特征在于组合应用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”。优选使用乳牙牙髓干细胞(SHED)。这是由于，与恒牙牙髓干细胞(DPSC)相比，其细胞增殖能力高。并且还由于据考虑其分化能力也更高。进一步地，SHED的BDNF表达水平高(参照日本特愿2010-92585号)，可发挥出更高的治疗效果，这一点也是使用SHED的优点。此外，SHED还具有采集简单的优点。近年来，有多个研究组进行了面向使用细胞来实现再生医疗的研究。在利用细胞的情况下，对由生物体采集的细胞施以培养、选择、处理等，其后进行回收，作为移植物的成分。通常，在一系列的操作过程中，培养上清被废弃或被置换为生理缓冲液等。因而，不会积极地在最终的移植物中含有培养上清。鉴于该情况，在以牙髓干细胞培养上清为必须有效成分这一点上，即使是组合使用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”的该方式的组合物，也与着眼于牙髓干细胞本身的有用性并在有效成分中使用牙髓干细胞的组合物或制剂等具有文字上(这自不必说)、实质上的严格区别。该实施方式的特征为组合使用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”。此处的“组合使用”意味着合用“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”。代表性地为将上述中枢神经疾病治疗用组合物以“牙髓干细胞培养上清”与“牙髓干细胞”混合而成的配合剂的形式提供的方式。在这样的情况下，优选使用在采集后未进行分化诱导(换言之，维持未分化状态)的牙髓干细胞(在本说明书中也称为“未分化型牙髓干细胞”)。这种情况下，由于上述中枢神经疾病治疗用组合物发挥出较强的神经保护作用，因而特别适合应用于急性期或亚急性期的中枢神经疾 病(例如脊髓损伤、脑梗塞等伴随有严重的神经细胞脱落-退行的难治性神经疾病)中。该实施方式所用的牙髓干细胞中，神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)为阳性、神经干细胞标记物双皮质素(Doublecortin)为阳性、神经细胞标记物β-1II微管蛋白为阳性、神经细胞标记物NeuN为阳性、星形细胞标记物GFAP为阳性、少突神经胶质细胞标记物CNPase为阳性，且高表达BDNF (参照日本特愿2010-92585号)。另一方面，例如还可以以试剂盒的形态提供上述中枢神经疾病治疗用组合物，该试剂盒由含有“牙髓干细胞培养上清”的第I构成要件与含有“牙髓干细胞”的第2构成要件构成。这种情况下，对于进行第I构成要件的给药的治疗对象(通常为中枢神经疾病患者)，在与第I构成要件给药的同时或在其给药后进行第2构成要件的给药。同时进行第I构成要件与第2构成要件的给药的使用方法特别适于应用至急性期或亚急性期的中枢神经疾病中。为了在应用至急性期或亚急性期的情况下发挥出较高治疗效果，优选使用未分化型牙髓干细胞作为第2构成要件的有效成分。需要说明的是，此处的“同时”并不要求严密的同时性。从而，不消说，将两要件混合后向对象进行给药等的在两要件的给药无时间差的条件下进行实施的情况是包含在“同时”的概念中的，而即使是在一方给药后迅速进行另一方的给药等的两要件的给药实质上无时间差的条件下进行实施的情况也是包含在此处的“同时”的概念中的。
利用在急性期或亚急性期进行第I构成要件的给药、在其后(例如3天 I周后)进行第2构成要件的给药的使用方法，可以期待连续且综合的治疗效果。在计划该使用方法的情况下，作为第2构成要件的有效成分，优选使用分化诱导为神经系统细胞的牙髓干细胞(在本说明书中也称为“分化诱导型牙髓干细胞”)。此处的术语“神经系统细胞”包括运动神经元、多巴胺生成细胞、各种中枢神经细胞、星形细胞、少突神经胶质细胞、雪旺细胞。关于应该使用分化诱导为哪种神经系统细胞的牙髓干细胞这一点，可以考虑治疗对象的疾病、病症来确定。例如，若为脊髓损伤治疗用，则可在第2构成要件中使用分化诱导为成熟型神经细胞、少突神经胶质细胞或雪旺细胞的牙髓干细胞。下面给出分化诱导为神经系统细胞的方法的实例。在分化诱导为多巴胺产生神经细胞时，可利用由下述2个工序构成的方法。在第I工序中，使用聚-L-赖氨酸包被培养皿，利用例如含有12. 5U/ml制霉菌素、N2添加剂、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的DMED培养基对牙髓干细胞进行2 3天培养。利用该工序，将牙髓干细胞分化诱导为神经干细胞。在第2工序中，将第I工序后的细胞利用例如含有B27添加剂、ImM db_cAMP、0. 5mM ΙΒΜΧ、200 μ M抗坏血酸和50ng/ml BDNF的Neurobasal 培养基进行6 7天培养。所诱导出的多巴胺产生神经细胞可以使用抗酪氨酸羟化酶的抗体通过免疫染色进行确认。除上述方法外，还可根据需要将经报告为将神经干细胞或胚胎干细胞分化诱导为多巴胺产生神经细胞的方法的下述各种方法进行适宜修正后进行利用，所述方法为在bFGF存在下进行培养后利用悬浮聚集培养系进行培养的方法(Studer, L. et al. , Nat. Neurosc1. , 1:290-295, 1998);在 bFGF 和神经胶质细胞株培养上清的存在下进行培养的方法(Daadi, Μ. M. and Weiss, S. J. :Neuroscience, 19:4484-4497, 1999.);利用 FGF8、Shh, bFGF 和抗坏血酸等的方法(Lee, S. H. et al.，Nat.Biotechnol.，18:675-679, 2000.);与骨髓间质细胞进行共培养的方法(Kawasaki, H. etal. , :Neuron, 28:31-40，2000.);等等。
在分化诱导为星形细胞时，可以利用由下述2个工序构成的方法。在第I工序中，使用聚-L-鸟氨酸与纤连蛋白双重包被的培养皿，利用例如含有N2添加剂和10ng/mlbFGF的DMEM/F12培养基对牙髓干细胞进行4天培养。在第2工序中，使用进一步添加有80ng/mlLIF、80ng/ml BMP2的培养基进行3天培养。分化诱导出的星形细胞可以通过使用抗GFAP抗体的免疫染色进行确认。在分化诱导为少突神经胶质细胞时，可以利用由下述2个工序构成的方法。与分化诱导为星形细胞同样地，在第I工序中，使用聚-L-鸟氨酸与纤连蛋白双重包被的培养皿，利用例如含有N2添加剂、10ng/ml bFGF和0. 5%FCS的DMEM/F12培养基对牙髓干细胞进行4天培养。通过该工序将牙髓干细胞诱导为少突神经胶质细胞前体细胞。接下来在第2工序中，利用含有20ng/ml T3 (三碘甲状腺原氨酸)、20ng/ml T4 (甲状腺素)和N2添加剂的DMEM/F12培养基进行4天培养。分化诱导出的少突神经胶质细胞可使用抗04抗体进行确认。作为第2构成要件的成分，可以在分化诱导型牙髓干细胞的基础上使用分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞，也可以替代分化诱导型牙髓干细胞而使用分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞。多能干细胞的示例为诱导多能干细胞(iPS细胞)和胚胎干细胞(ES细胞)。“诱导多能干细胞(iPS细胞)”为通过初期化因子的导入等而对体细胞进行重新设定所制作出的具有多能性(多分化能力)与增殖能力的细胞。诱导多能干细胞表示出与ES细胞相近的性质。iPS细胞可以通过以往报告的各种iPS细胞制作法来制作。另外，认为当然也可应用今后开发出的iPS细胞制作法。 iPS细胞制作法的最基本方法为将转录因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc这4种因子利用病毒导入到细胞中的方法(Takahashi K, Yamanaka SiCell 126 (4)，663-676，2006 ;Takahashi, K, et al:Cell 131 (5)，861-72，2007)。关于人 iPS 细胞，有通过导A 0ct4、Sox2、Lin28 和 Nonog 这 4 种因子来建立的报告(Yu J, et al: Science318 (5858)，1917-1920, 2007)。也有通过导入除 c-Myc 外的 3 种因子(Nakagawa M, etal:Nat. Biotechnol. 26(1)，101-106，2008)、通过导入 0ct3/4 和 Klf4 这 2 种因子(Kim JB, et al: Nature 454 (7204)，646-650，2008)、或通过仅导入 0ct3/4 (Kim J B, et al:Cell136 (3) ,411-419，2009)来建立iPS细胞的报告。另外还报告了将作为基因表达产物的蛋白质导入到细胞中的方法(Zhou H, Wu S，Joo JY, et al:Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009 ；KimD, Kim CH, Moon JI, et al:Cell Stem Cell 4,472-476,2009)。另一方面，还有通过使用组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294或组蛋白脱乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)或BayK8644等可提高制作效率或可降低导入的因子等的报告(Huangfu D, et al :Nat.Biotechnol. 26(7), 795-797，2008 ；Huangfu D, et al:Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008 ；Silva J, et al:PLoS. Biol. 6(10), e 253,2008)。关于基因导入法也进行了研究，开发出了将逆转录病毒、以及慢病毒(Yu J，et al: Science 318 (5858)，1917-1920，2007)、腺病毒(Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903)，945-949，2008)、质粒(Okita K, etal: Science 322 (5903)，949-953，2008)、转座子载体(Woltjen K, Michael IP, MohseniP, et al:Nature 458,766-770, 2009 ；Kaji K,Norrby K,Pac a A, et al:Nature458, 771-775, 2009 ；Yusa K, Rad R, Takeda J, et al :Nat Methods 6，363-369，2009)、或附加型载体(Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al:Science 324, 797-801, 2009)用于基因导入中的技术。产生了向iPS细胞的转化、即产生了初期化(重新设定)的细胞可通过以Fbxol5、Nanog、0ct/4、Fgf-4、Esg-l和Cript等多能干细胞标记物(未分化标记物)的表达等为指标来进行选择。可将所选择的细胞作为iPS细胞进行回收。另一方面，有多种ES细胞可由公共机构提供或有市售。作为小鼠ES细胞的示例，可以举出ES-E14TG2a细胞(ATCC)、ES-D3细胞等(ATCC)、Hl细胞(理研生物资源中心，日本筑波市)、B6G-2细胞(理研生物资源中心，日本筑波市)、Rl细胞(SamuelLunenfeldResearch Institute，加拿大多伦多)、小鼠ES细胞(129SV、目录编号R-CMT1-1-15、R-CMT1-1A)(大日本住友制药株式会社，日本大阪)、小鼠ES细胞(C57/BL6，目录编号R-CMT1-2A(大日本住友制药株式会社，日本大阪)。猴ES细胞可由京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心等获得。人ES细胞可由京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心、WiCell Research Institute (美国麦迪逊)、ES Cell InternationalPte Ltd(新加坡)等获得。已确立了 ES细胞的建立方法，其一部分也已被常规化，因而，也可按照常规方法自行建立目的ES细胞。例如，关于小鼠ES细胞的树立方法可以参M Nagy. A. et al. , eds. !Manipulating the MouseEmbryo, A Laboratory Manual, ThirdEdition, Cold spring Harbor Laboratory Press, 2003,实验医学分册培养细胞实验手册(羊土社)等。若为猴ES细胞的建立方法,则可参照Suemori H, Tada T, Torii R, et al.,,Dev Dyn 222，273-279，2001等。若为人ES细胞的建立方法，则可参照Wassarman, P. M. etal.，Methods in Enzymology, Vol. 365(2003)等。上述中枢神经疾病治疗用组合物优选不含有血清。通过不含有血清，其安全性得到提高。例如，通过利用不含有血清的培养基(无血清培养基)对牙髓干细胞进行培养，可以制备出不含有血清的培养上清。可进行I次或多次传代培养，最后或最后几次的传代培养利用无血清培养基进行培养，即可得到不含血清的培养上清。另外，可利用通过透析或柱所进行的溶剂置换等由回收的培养上清中除去血清，由此也可得到不含血清的培养上清。上述中枢神经疾病治疗用组合物用于中枢神经(脑、脊髓)疾病的治疗中。作为可适用上述中枢神经疾病治疗用组合物的中枢神经疾病，可举出脊髓损伤、神经退行性疾病(肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默氏病、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症等)、伴有脑缺血或脑内出血等的脑梗塞所致的神经细胞的退行-脱落、伴有神经细胞障碍的视网膜疾病。若应用上述中枢神经疾病治疗用组合物，则通过对神经突起生长作用和/或神经细胞的凋亡抑制作用，促进中枢神经组织的再生-治愈。只要是基于这样的机理进行治疗会有效的疾病或病症，则不管其种类或原因(例如，外伤或脑梗塞等所致的一次原因；感染、肿瘤等所致的二次原因)等如何，均可为本发明的对象疾病。脊髓损伤指的是脊髓由于来自外部的冲击、脊髓肿瘤或疝气等内在因素而发生损伤的状态。根据损伤的程度，分为完全型(脊髓在中间被完全切断的状态)与不完全型(脊髓尽管受到损伤或压迫但脊髓仍维持部分功能的状态)。在目前的医疗技术中，脊髓损伤无法完全恢复，迫切希望确立新的治疗方法。脊髓损伤为期待适用再生医疗的疾病之一，研究了骨髓、神经干细胞、胚胎干细胞、人工多能干细胞等的使用。但是，由于各种问题，尚未实现决定性的治疗技术。在这样的状况下，上述中枢神经疾病治疗用组合物提供了可期待较闻治疗效果的治疗方法，其意义、价值极 闻。可适用上述中枢神经疾病治疗用组合物的其它疾病、病症为由于急性期或亚急性期脑缺血、脑内出血等所致的神经细胞的退行-脱落而产生的脑梗塞；作为由于围产期的缺氧缺血而广生的新生儿脑疾病的脑室周围白质软化症等。脑缺血为脑内血液不足、脑中未供给充分的氧或营养的状态。脑缺血引起神经细胞死亡、脑水肿，为脑梗塞的原因。本发明的组合物也可适用于由于这样的脑缺血等所引起的神经细胞的破坏或与其相伴的各种疾病的治疗。帕金森氏病、脊髓小脑变性症、阿兹海默氏病、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症、进行性核上清麻痹为由于大脑、中脑和小脑区域中的区域特异性神经细胞的脱落变异所引起的难治性神经疾病。上述中枢神经疾病治疗用组合物通过抑制神经细胞的退行-脱落而在这些疾病中发挥出治疗效果。上述中枢神经疾病治疗用组合物也可适用于伴有神经细胞障碍的视网膜疾病中。视网膜中可大致分为5种神经细胞，S卩，其中存在有视细胞(椎体细胞、杆体细胞)、双极细胞、水平细胞、无长突细胞和神经节细胞。上述中枢神经疾病治疗用组合物通过对下述疾病中的神经细胞死亡和脱落进行抑制，从而可发挥出治疗效果，所述疾病不仅有以视网膜中存在的这些神经细胞(I种或2种以上)的障碍为原因的视网膜疾病，还有作为这些神经细胞(I种或2种以上)呈现出障碍的病症的视网膜疾病(外伤性视网膜脱落、视网膜裂孔、视网膜震荡症、视神经管骨折、糖尿病视网膜症、老化黄斑变性、视网膜色素变性症、青光眼、无脉络膜、Leber’s遗传性视神经病变、椎体营养不良、家族性玻璃疣、中心性晕轮样脉络膜营养不良、常染色体显性视神经萎缩等)。在可维持所期待的治疗效果的条件下，在本发明的组合物中追加其它成分进行使用也是无妨的。下面列举出可在本发明中追加使用的成分。(i)生物体吸收性材料作为有机系生物体吸收性材料，可以使用透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白原(例如B0LHEAL (注册商标))等。(ii)凝胶化材料凝胶化材 料优选使用生物体亲和性高的材料，可以使用透明质酸、胶原蛋白或纤维蛋白糊等。作为透明质酸、胶原蛋白，可以选择各种物质进行使用，优选采用适于本发明组合物的应用目的(应用组织)的物质。所使用的胶原蛋白优选为可溶性的(酸可溶性胶原蛋白、碱可溶性胶原蛋白、酶可溶性胶原蛋白等)。(iii)其他也可以含有制剂上容许的其它成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂，可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟基甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为无痛化剂，可以使用苯甲醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。也可以含有抗生素、PH调节剂、生长因子(例如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF))等。对上述中枢神经疾病治疗用组合物的最终形态没有特别限定。形态例为液体状(液态、凝胶状等)和固体状(粉状、细粒、颗粒状等)。对上述中枢神经疾病治疗用组合物的制造方法没有特别限定，优选为包括下述步骤(I) (3)的制造方法，即(I)从牙髓细胞中挑选出粘附细胞的步骤；(2)对上述粘附细胞进行培养的步骤；(3)回收培养上清的步骤。下面，对每一步骤进行说明。在步骤(I)中，从牙髓细胞中挑选出属于粘附细胞的牙髓干细胞。在下文中，只要事先从生物体中进行分离等来准备牙髓细胞即可。本挑选步骤可包括牙髓细胞的准备。下面给出从牙髓细胞的准备到牙髓干细胞的挑选的一系列操作过程的具体例。(a)牙髓的采集将自然脱落的乳牙(或拔下的乳牙、或恒牙)利用氯己定或聚乙烯吡咯酮碘(IS0DINE)溶液消毒后，分离出齿冠部，利用牙钻回收牙髓组织。(b)酶处理将采集的牙髓组织悬浮在基础培养基(含有10%牛血清-抗生素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM))中，利用2mg/ml的胶原酶和分散酶(Dispase)在37°C处理I小时。通过5分钟的离心操作(5000转/分钟)回收酶处理后的牙髓细胞。由于利用细胞滤网进行的细胞挑选会降低SHED、DPSC等神经干细胞级分的回收效率，因而原则上不使用该方法。(C)粘附细胞的挑选 将细胞利用4cc基础培养基进行再悬浮，播种在直径6cm的粘附细胞培养用培养皿中。添加培养液(例如含有 10%FCS 的 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium))后，利用调整为5%C02、37°C的培养箱进行2周左右的培养。去除培养液后，利用PBS等对细胞进行I次或多次清洗。也可以进行形成了菌落的粘附细胞(牙髓干细胞)的回收来代替该操作(培养液的去除和细胞的清洗)。这种情况下，例如利用O. 05%胰蛋白酶-EDTA于37°C进行5分钟处理，回收从培养皿脱落的细胞。在接着步骤(I)的步骤(2)中，对挑选出的粘附细胞进行培养。例如，将细胞播种在粘附细胞培养用培养皿中，利用调整为5%C02、37°C的培养箱进行培养。根据需要进行传代培养。例如在通过肉眼观察达到亚融合(细胞占据培养容器表面的约70%的状态)或融合时，将细胞从培养容器剥离进行回收，再次播种在填满培养液的培养容器中。可反复进行传代培养。例如进行I 8次传代培养，增殖到必要的细胞数(例如约I X IO7个/ml)。另外，细胞从培养容器的剥离可通过胰蛋白酶处理等常规方法来实施。在上述培养后，可回收细胞进行保存(保存条件例如为_198°C)。也可将从各种供体回收的细胞以牙髓干细胞库的形态进行保存。培养液中可以使用基础培养基、或在基础培养基中添加有血清等而成的培养液等。其中，为了制备不含血清的“牙髓干细胞培养上清”，可在整个过程中、或在最后或最后几次的传代培养中使用无血清培养基。另外，基础培养基，可以使用DMEM，还可以使用伊思考夫改良杜尔贝可培养基GMDM) (GIBC0社等)、Ham’s F12培养基(HamF12) (SIGMA社、GIBCO社等)、RPMI1640培养基等。也可以合用两种以上的基础培养基。作为混合培养基的一例，可以举出将頂DM与HamF12等量混合而成的培养基(例如作为商品名IMDM/HamF12(GIBC0社)市售)。另外，作为可添加到培养基中的成分的示例，可以举出血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)、血清替代物(Knockout serum replacement (KSR)等)、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、各种维生素、各种矿物质。在接着步骤(2)的步骤(3)中，对于利用上述方法挑选、培养出的牙髓干细胞培养上清进行回收。例如，可利用滴管或移液管等抽吸培养液来进行回收。所回收的培养上清可以原样或经过一种以上的处理后作为本发明组合物的有效成分进行使用。作为此处的处理，可示例出离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存(例如，4°C、-80°C)o另外，如后述的实施例所示，牙髓干细胞培养上清即使不经复杂高度的精制，也会显示出所期望的作用(神经突起生长作用和凋亡抑制作用)。这意味着，对中枢神经疾病有效的本发明的组合物可通过简便的工序进行制造。无需复杂的精制工序在可避免与精制相伴的活性降低这一点上也是有利的。为了确认培养上清的品质，可对回收的培养上清进行下述步骤(a)或步骤(b)、或进行这两个步骤。(a)针对培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤
(b)针对培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤对于在步骤(a)中获得了肯定结果的培养上清，可期待其基于神经突起生长作用的良好的治疗效果。同样地，对于在步骤(b)中获得了肯定结果的培养上清，可期待其基于对神经细胞的凋亡抑制作用的良好治疗效果。优选进行步骤(a)与步骤(b)这两个步骤，采用均显示出肯定结果的培养上清作为本发明组合物的有效成分。关于步骤(a)和(b)中的确认方法如上所述(本发明第I方面的栏目中)。另外，利用步骤(a)和(b)也可对回收或制备的、或所保存的培养上清的品质进行确认。因而可以认为，这些步骤作为牙髓干细胞培养上清的品质判定法(即，判断其作为中枢神经系统疾病治疗用有效成分的适宜性的手段)其本身具有很高的有用性和价值。<干细胞培养上清的浓缩方法>对于包含在本发明中的损伤部位治疗用组合物和中枢神经疾病的治疗用组合物来说，可以对干细胞培养上清所含有的生理活性物质进行制剂化。由此，例如可进行神经再生活性物质的制剂化。作为用于制剂化的细胞培养上清的浓缩方法，可以适当使用通常为了该目的所进行的方法。作为浓缩方法的示例，例如可以举出以下的两种方法。1.离心柱浓缩法将培养上清利用AmiconU ltra Centrifugal Filter Units-lOK(Millipore社制造)进行浓缩(最大75倍浓缩)。具体操作过程如下。(i)将培养上清(最大 Ιδπι )投入到 Amicon Ultra Centrifugal FilterUnits-1OK中，以X4000g进行约60分钟的离心，浓缩至200 μ I。(ii)向上述管中投入与培养上清等量的灭菌PBS，再次以X4000g进行约60分钟的离心，将基础溶液置换为PBS。(iii)将所得到的溶液200μ I回收到微量离心管中，制成浓缩干细胞培养上清。2.乙醇沉淀浓缩法将培养上清利用乙醇沉淀法进行浓缩(最大10倍浓缩)。具体操作过程如下。⑴向培养上清5ml中加入100%乙醇45ml，进行混合，在_20°C放置60分钟。(ii)于4°C以X 15000g进行15分钟离心。(iii)去除上清，加入90%乙醇10ml，充分搅拌。(iv)于4°C以X 15000g进行5分钟离心。(V)去除上清，将所得到的颗粒物溶解在灭菌水500 μ I中，回收到微量离心管中，制成浓缩干细胞培养上清。<干细胞培养上清的冷冻干燥方法>另外，本发明组合物中的干细胞培养上清也可进行冷冻干燥。由此得到良好的保存稳定性。作为干细胞培养上清的冷冻干燥方法，可以适当使用通常为了该目的所进行的方法。作为冷冻干燥方法的示例，例如可以举出下述方法。(i)将利用上述方法得到的干细胞培养上清或浓缩干细胞培养上清在_80°C进行2小时至半天的冷冻。(ii)冷冻后，打开样品管的盖子，置入冷冻干燥机中。(iii)进行I 2天的冷冻干燥。(iv)将所得的样品作为冷冻干燥干细胞培养上清(可在_80°C进行保存)。
本发明进一步的方式提供中枢神经疾病的治疗方法，其包括将上述中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。对本发明组合物的给药途径没有特别限定，只要可送达目的组织即可。例如，可通过局部给药来应用。作为局部给药的示例，可以举出注入或涂布到目的组织。也可以通过静脉注射、动脉注射、门静脉注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射、或者腹腔注射来进行本发明组合物的给药。作为给药方案，例如可以采用一日一次 数次、两日一次、或三日一次等。在给药方案的制作中，可以考虑对象(接受者)的性別、年龄、体重、病症等。本发明组合物的给药对象代表性地为罹患中枢神经系统疾病的人患者，认为其也可应用于人以外的哺乳动物(包括宠物动物、家畜、实验动物。具体地说，例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、牛、猪、山羊、绵羊、犬、猫等)中。优选针对急性期或亚急性期对象进行本发明组合物的给药，从而最大限度地发挥出本发明组合物的效果。在本发明的一个实施方式中，在与上述中枢神经疾病治疗用组合物给药的同时或在该组合物的给药后，对同一对象进行牙髓干细胞的给药，如此可发挥出复合或连续的效果。作为此处的牙髓干细胞，可以使用在采集后未进行分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞、或在采集后分化诱导为神经系统细胞的分化诱导型牙髓干细胞。其中，在与上述中枢神经疾病治疗用组合物给药的同时进行牙髓干细胞的给药的情况下，优选进行未分化型牙髓干细胞的给药以发挥出较高的治疗效果。另外，在上述中枢神经疾病治疗用组合物给药后进行牙髓干细胞的给药的情况下，可以使用分化诱导为神经系统细胞的牙髓干细胞。可以在分化诱导型牙髓干细胞的基础上使用分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞(例如iPS细胞或ES细胞)，也可以替代分化诱导型牙髓干细胞而使用分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞(例如iPS细胞或ES细胞)。下面对本发明的实施例进行说明，但本发明并不限于此。另外，只要不特别声明，实施例中的％为重量(质量)基准。实施例
[实施例1]<材料和方法>(I)被测体和细胞培养由8名患者拔下的临床健康的乳牙和恒牙得到人牙髓组织。本实验协议受到了名古屋大学伦理委员会的承认。SHED和DPSC按照Proc Natl Acad Sci U S A 2000 ；97:13625-30 或Proc Natl Acad Sci U S A 2003 ;100:5807_12 中的报告进行了分离和培养。简单地说,缓缓地取出牙髓，在3mg/mL I型胶原酶和4mg/mL分散酶的溶液中于37°C进行 I 小时消化。使用 70mm 的细胞滤网(Falcon ；BD Labware, Franklin Lakes, NJ)进行过滤后，在含有20%间充质细胞成长添加物(Lonza Inc, Walkersville, MD)和抗生素(100U/mL的青霉素、100mg/mL的链霉素以及0. 25mg/mL的两性霉素B ；GIBC0社制造)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM ；GIBC0, Rockville, MD)中，于37°C、5%C02条件下进行细胞培养。一次培养后，将细胞以约I X IO4细胞/cm2进行传代培养。将I 3次传代后的细胞用于实验。人BMMSC由Lonza社购入，按照制造商的操作说明书进行培养。(2)细胞增殖的分析
按照制造商(Invitrogen, Carlsbad, CA)的操作说明书使用BrdU染色试剂盒,加入溴脱氧尿苷(BrdU) 12小时，对SHED、DPSC以及BMSC的增殖速度进行评价(各组中n=3)。实验反复进行5次。在单因素方差分析后通过Tukey-Kramer检验来评价统计的显著性差
巳为进行STR0-1免疫荧光，将SHED、DPSC以及BMSC利用3%多聚甲醛固定后，利用磷酸缓冲生理盐水漂洗2次，利用IOOmM甘氨酸进行20分钟处理。接下来，将细胞利用O. 2%的Triton-X (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)进行30分钟渗透处理后，在5%的驴血清和O. 5%的牛血清白蛋白的混合物中进行20分钟温浴。接下来，将细胞与作为一次抗体的小鼠抗人STR0-1抗体(1:100 ;R&D，Minneapolis, MN) —同温浴I小时，与作为二次抗体的山羊抗小鼠免疫球蛋白 M-FITC 抗体(1:500 ；Southern Biotech, Birmingham, AL) 一同温浴 30 分钟，米用 VECTASHIELD 与 DAPI (Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA)进行封固。(3)动物实验(图1)5周龄雌性无毛小鼠(Hos ；HR-1)由SLC社(SLC Inc.)(日本、静冈)提供。将所有小鼠置于12/12h光暗循环下的气候调节区域(22±1°C、湿度50%)中。动物可自由摄取水和固体饲料，每天进行观察。使用UVB放射装置RMX-3W(Handok Biotech,韩国首尔)在小鼠背部进行8周的照射，I周进行5次。在不使用UVB用滤波处理的情况下，使用由10个东芝社制造的SE灯构成的灯排(放射峰为312nm附近，290nm 320nm的照射相当于UVB总量的55%)。由灯至动物背部的距离为89cm。在照射(暴露)时，动物可在笼中自由行动。辐射剂量在最初2周为IMED (最小红斑量；60mJ/cm2)、在第3周为2MED (120mJ/cm2)、在第4周为 3MED (180mJ/cm2)、在第 5 8 周为 4MED (240mJ/cm2)。总 UVB 线量为约 115MED (6. 9J/cm2)。在褶皱诱导5周后，将SH-CM (100%)皮下注射到小鼠的划定区域中。作为阳性对照，直接向真皮注射PBS悬浮SHED(4X IO5);作为阴性对照，仅利用PBS处理真皮。(4) SH-CM 的制备在DMEM/F12 (Invitrogen-Gibco-BRL，Grand Island, NY)无血清培养基中进行SHED (4X IO5细胞)的培养。培养72小时后，回收SHED的培养上清，在300 Xg进行5分钟离心，使用0. 22mm的针头过滤器进行过滤。(5)皮肤复制和图像分析在褶皱诱导时以及注射I周后，使用硅酮系印模材料FLEXHME I (HeraeusKulzer, New York, NY)采集背部皮肤表面的复制阴模。为了由相同皮肤区域得到复制褶皱，利用油性马克笔在皮肤上进行标记。在最后将SH-CM和SHED注射到皮肤5周后，由进行标记的区域采集印象。为了容易测定，将所有复制品(> 7 U力)切成Icm见方，使用相同印模材料将各复制品的背面加工成平坦的面。以208°的角度照射光，使用CCD照相机由复制品获取图像。负型复制的图像使用裙皱分析装置Skin VisiometerSV 600 (Courage &Khazaka, Cologne, Germany)进行观察。皮肤裙皱评价中所用的参数为数目、深度、面积。(6)组织学将背部皮肤(IcmXlcm)利用10%福尔马林中性缓冲溶液固定，包埋在聚酯蜡中，制作6mm的切片。切片以苏木素&伊红(H & E)处理,进行Masson’ s三色染色。(7) HDF培养和UVB辐射剂量
在添加有10%胎牛血清、100U/ml青霉素以及100mg/ml链霉素的DMEM中，在5%C02条件下于37°C进行HDF的培养。利用无血清培养基饥饿24小时后，将细胞用PBS清洗，与3 4 滴 PBS —同暴露于 UVB。UVB 照射使用 UV 光源(Waldmann, Schwenningen, Germany)来进行。在照射后，立即吸出PBS，置换为完全培养基。在UVB辐射剂量为50mJ/cm2 250mJ/cm2的范围进行试验，最终固定在后面的实验所用的70mJ/cm2。(8)细胞增殖分析将HDF以5X IO3细胞/孔的密度铺在96孔微板中，使用CCK-8试剂盒(Dojindo, Gaithersburg, MD)测定HDF的增殖。利用无血清培养基饥饿24小时后，与SH-CM一起或在无SH-CM的条件下对细胞进行24小时连续培养，在UVB (70mJ/cm2)中暴露90秒。接下来，将UVB照射细胞在完全培养基中培养24小时，进行回收。将HDF加入到IOmL的CCK-8溶液中，温浴3小时。使用酶标仪(TECAN, Gro ·· dig, Austria)测定450nm的吸收。将各孔的OD值基于可比较的标准曲线换算为相对细胞数。(9) Western 印迹分析将HDF (2 X IO4细胞/孔)播种在24孔微板上，如上所述进行前处理。接下来，将细胞溶解在RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl.O. 15M NaClUmM EDTA、l%TritonX_100、l%SDS、50mMNaF>ImM Na3V04、5mM 二硫苏糖醇、lmg/ml 亮抑酶肽以及 20mg/mlPMSF, pH 7. 4)中。将蛋白质50微克在8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来进行分离。将蛋白质转印至PVDF膜。将该膜与抗I型胶原蛋白抗体(Santa Cruz, Saint Louis, MO)、抗基质金属蛋白酶I (MMP-1)抗体(Calbiochem, Darmstadt, Germany) —同进行温浴。接下来，对膜进行清洗，与辣根过氧物酶偶联抗山羊IgG抗体(1: 10，000、SantaCruz, Saint Louis, MO) 一同进行温浴。使印迹与免疫球蛋白Western试剂反应，在X射线膜上曝光。< 结果 >(I) SHED、DPSC 以及 BMSC 的特征分析SHED和DPSC显示出与BMSC同样的成纤维细胞形态(图2A C)。由免疫荧光分析示出了 SHED、DPSC以及BMSC含有STR0-1阳性细胞(图2D F)。SHED的增殖速度显著快于 DPSC 和 BMSC (图 2G)。 (2) SH-CM所致的UV诱导褶皱的减轻在UV暴露期间，对小鼠皮肤的细小褶皱进行观察。但是，在处理中，SH-CM处理组和SHED注射组的褶皱少于PBS组(各组中n=8)。在复制的分析中，图3和图4说明了 UVB照射所诱导的细小褶皱由于SH-CM的反复处理而减轻。SHED注射组也与SH-CH组显示出了相同的倾向。本发明人的小组利用Skin Visiometer SV 600对所复制裙皱的参数进行了测定，结果在注射天然水平(100%)的SH-CM时，褶皱的全部参数有显著降低。但是，SHED处理的皮肤显示出了比SH-CM组更高的有效性。(3)组织学的观察UVB照射无毛小鼠在皮肤附件显示出较大变化，研究了 SH-CM对于UVB照射无毛小鼠中的真皮厚度的影响。图5中表示基于H & E染色的无毛小鼠皮肤真皮厚度的组织学测定。如图5所示，胶原蛋白纤维发生染色，其在SH-CM处理组(A)与SHED注入组(B)有显著提高。真皮厚度的测定在SHED注射组和SH-CM处理组中显示出了显著的增加(图6)。进一步地，在二者的组中观察到了胶原纤维束的显著性增加，但在对照组中未观察到这一点(图5)。(4) SH-CM所致的HDF的增殖促进关于SHED所致的皮肤褶皱的改善，为了进一步对旁分泌机制进行研究，利用与SH-CM —同进行一次培养的HDF进行了细胞增殖分析。UVB照射显著降低HDF的增殖，但基于SH-CM的前处理对HDF显示出保护效果(图7)。SH-CM包含多种生长因子，生长因子的固有特性为启动静止细胞的有丝分裂的能力的情况下，本实验中基于SH-CM的增殖促进可由SHED中分泌出的生长因子来介导。(5) I型胶原蛋白和MMPl的表达在SH-CM处理的无毛小鼠中，真皮中的胶原蛋白含量有显著增加，因而对于SH-CM处理后HDF中的I型胶原蛋白和MMPl的蛋白质的表达进行了研究(图8)。UVB照射明显降低I型胶原蛋白的表达，诱导MMPl的表达。但是，I型胶原蛋白的表达在SH-CM前处理后有显著增加，另一方面，MMPl的表达在SH-CM前处理后发生降低。这些结果显示出，SH-CM处理的无毛小鼠真皮中胶原蛋白含量的增加是由于真皮成纤维细胞中胶原蛋白合成的刺激和胶原蛋白分解的抑制而造成的。考察将SHED的特征与DPSC和BMSC (该DPSC和BMSC被认为是组织工程和再生医疗中的标准干细胞源)进行了比较。结果显示出，SHED具有高增殖能力，通过细胞外基质而被强化。这暗示出，SHED对于基于干细胞的治疗来说是有用的细胞源。在SHED、DPSC以及BMMSC中发现有STR0-1阳性细胞。已知STR0-1可识别存在于骨髓细胞亚群(包括具有高生长、分化能力的优势比例的骨骼干细胞)和菌落形成单元的成纤维细胞群上的胰蛋白酶耐性细胞表面抗原。高增殖能力为生后成体干细胞最重要的特征之一。通过使用BrdU的增殖研究明确了，在SHED、DPSC以及BMSC中，SHED显示出最高的群比例。以往，有基于微阵列分析的报告指出，SHED高水平地表达与该通路相关的FGF、TGF-b、CTGF, NGF、BMP等中的2种以上的生长因子(S. Nakamura, Y. Yamada et al. , Stem Cell Proliferation PathwaysComParisonbetween Human Exfoliated Deciduous Teeth and Dental Pulp Stem Cellsby GeneExpression Profile from Promising Dental Pulp, JOE, Vol. 35, (11)，1536-1542，2009)。据报告，FGF2为促进组织再生和创伤治愈中多种细胞的增殖、发挥调节细胞外基质的生成的作用的细胞因子。VEGF、KGF、FGF等旁分泌因子可用于皮肤再生中，这暗示了干细胞移植也为“基于细胞”的细胞因子疗法。重要的是，为了避免UVB对HDF的负影响，可以使用含有生长因子的培养上清。介导干细胞疗法效果中的至少一部分的旁分泌效果这一概念与以前的数据不矛盾。基于细胞的细胞因子疗法在创伤治愈方面具有优点。基于SHED来源生长因子的角化细胞分化可有助于创伤闭合中的上皮再形成。进一步地，SHED来源生长因子在创伤治愈、组织重建以及植皮片形成方面带来优点。光老化是与皮肤创伤具有病理学类似点的复杂过程。MSC在该过程中发挥重要作用，与角化细胞、脂肪细胞以及肥大细胞相互作用。并且，MSC也是显著降低真皮乳头层的纤维状I型和III型胶原蛋白的细胞外基质蛋白质源，已揭示出其减少与光老化的临床重症度有深度相关。其减少是由于介导MMP作用的前胶原蛋白生物合成的降低和酶分解的增加的组合作用。Fisher等人揭示出体内UV照射可诱导人皮肤中的MMP合成(Phipps RP,Borrello MA, Blieden TM. , Fibroblast heterogeneity in theperiodontium and othertissues, J Periodontal Res. 1997 Jan ；32 (IPt 2) 159-165 ；FisherGJ, Datta SC,TalwarHS, Wang ZQ, Varani J, Kang S, et al. , Molecular basis ofsun-1nduced prematureskin ageing and retinoid antagonism, Nature 1996;379:335-339]。在 MMP 家族中，MMPUMMP13以及膜型MMP14显示出胶原蛋白分解作用，MMP2和MMP9据报告为真的弹性蛋白酶。说明了光老化的皮肤中产生的缔结组织损伤中的大部分是由于MMP介导的胶原蛋白和弹力蛋白的破坏而引起的(Tsukahara K, Nakagawa H, Moriwaki S，Takema Y,Fujimura T, Imokawa G, Inhibition ofultraviolet-B-1nduced wrinkle formation byan elastase—inhibiting herbal extract:1mplication for the mechanism underlyingelastase-associated wrinkles, Int J Dermatol2006 ;45:460-468)。 在本研究中发现，SH-CM在HDF中不仅抑制UVB诱导的I型胶原蛋白的减少，而且还降低UVB诱导的MMPl的表达。创伤治愈和光损伤后的皮肤活力恢复(若返>9 )为一复杂但有秩序的过程，通过细胞因子和生长因子进行组织化。因此，若将这些数据与本研究组合，则暗示出局部细胞因子的释放可能是介导SHED中有益的活力恢复效果的重要因素，该效果是在SH-CM送达后所观察到的。SHED的局部送达还可能通过使循环的干前体细胞返回到伤害区域而有助于治愈。作为结论，在SHED在真皮创伤治愈中的应用停留在推测阶段时，首次对SHED来源生长因子与HDF间的相互作用进行了研究。SHED通过增加胶原蛋白合成以及活化HDF的增殖和移行从而对HDF产生影响。由这些暗示出，SHED或SH-CM可用于光老化和创伤治愈的处理中。本结果还暗示出，SHED在性质上比MSC更适合于真皮创伤治愈中。SHED主要与分泌型生长因子或ECM蛋白质一同在HDF创伤治愈可能性的增加方面发挥作用。[实施例2](I)生长因子混合物(粉末)的制备将永生化人间充质干细胞(MSC ；Ronza Co.，Ltd, USA)用于生长因子(GF)混合物的制备中。使用含有10%FSC的DMEM对细胞进行2 8代培养，在培养皿中的细胞融合为80%的阶段对上清(培养培养基CM)进行取样，加到乙醇中(CM :乙醇=1 9)。在-20°C对该CM进行60分钟温浴后，离心(4°C、1500rpm、15分钟)进行浓缩。在90%乙醇中于_20°C对留下的CM进行清洗，之后再次进行离心。通过对该浓缩的CM进行冷冻干燥，得到生长因子粉末。(2)粉末中的生长因子通过Western印迹法对粉末中的各生长因子进行分析。检测出的生长因子如下PDGF, VEGF, IGF、KGF、HGF 以及 TGF。[实施例3]<基于生长因子的骨再生的实验研究>(I)方法在犬下颚骨中形成直径10mm、深度IOmm的4处圆筒状缺损。在各缺损的中心插入钛移植物(直径3. 75mm)。移植物周围空间填入下述移植材料(l)PRP、(2) 100%GF、(3) MSC (I X I, 000，000)以及⑷空白缺损(对照)(图10)。
⑵结果8周后，对犬施以安乐死，对带有移植物的下颚骨进行解剖。制作组织学标本，使用光学显微镜和图像分析装置对BIC(骨-移植物接触部(Bone-1mplant Contact))进行计算(图11)。^BIC=与移植物表面接触的骨部分的全长/移植物表面的全长X 100 (%)MSC (65. O)与GF (58. 6)间的BIC并无显著性差异，各BIC值远高于对照(26. 4)和PRP (44. 2)。(图 12 和 13)。(3)结论作为结论，相比于与骨再生相关的活的干细胞，来源于间充质干细胞的生长因子与之具有相同能力。临床例56岁、男性在上颚骨的大臼齿区域设置2个移植物施行上颌窦提升术。将100%基于细胞的GF与b-TCP ( β -磷酸三钙)颗粒移植到副鼻腔中。8周后，移植部分被新骨填满，通过X射线观察确认移植物与骨之间的骨整合(图14和15)。[实施例4]<基于生长因子的牙周组织再生的实验研究>(I)方法在犬下颚骨的 白齿末梢部分制作二壁性牙周缺损(图16)。按下述方法或步骤对各犬进行缺损处理(图17和18)。I)牙周翻瓣术(F0、对照)2) GTR 法3) MSC (I X 100，000)4) GF (100%)⑵结果手术8周后，对带有白齿和牙周的犬下颚骨进行解剖，制作其组织学标本。通过组织学观察，使用光学显微镜对袋深度(N1-JE:上皮向下生长的长度)和新形成的牙骨质的长度(N2-NC)进行评价(图19)。这些参数在牙周病的改善评价中是有用的。新的牙骨质的长度在GF和MSC中比在GTR和对照中长得多。进一步地，与GTR组和对照组相比，GF组和MSC组的袋深度有显著改善(图20 22)。⑶结论MSC来源生长因子在牙周组织的再生方面与MSC本身具有相同能力。病例报告64岁-女性在右下犬齿的内侧部分可见深度7mm的较深牙周缺损。将100%GF与缺端胶原蛋白药棉填塞在缺损部(图23、24)。16周后，缺损被新形成的牙周组织临床修复(图25)。如上所述，细胞因子疗法在安全性、稳定性、操作容易性、保存容易性、传输容易性以及低成本之类的方面具有优于干细胞疗法的优点。[实施例5]脑梗塞治疗效果的确认脑缺血模型
全部动物实验受到了动物实验委员会(名古屋大学医学部)的承认。使用300g 400g的雄性成年Sprague-Dawley大鼠(日本静日本SLC株式会社)。将动物首先用5%异氟烧(Abbott Laboratories, North Chicago)麻醉，使用含有L 5%异氟烧的70%N20与30%02的混合物维持在麻醉下。在加热垫上维持直肠温度为37°C ±0. 5°C。通过永久局部脑缺血来诱发局部脑缺血(pMCHO)(第O天)(图26)。将通过火焰加热将尖端弄圆的4-0单丝尼龙缝合线(Shirakawa, Tokyo, Japan)与娃酮(KE-200、Shin-EtsuChemical, Tokyo, Japan)从外颈动脉进入到内颈动脉中直至塞住MCA的起源。闭塞后，使用激光-多普勒血流计(Omega FL0-N1 Omega Wave Inc, Tokyo, Japan)对 MCA 区域的局部脑血流进行测定。反应仅在局部脑血流的减少超过70%的情况下被视为阳性且仅包括该情况。SH-CM的鼻腔给药 在pMCAO的72小时后(第3天)，再次利用5%异氟烷(AbbottLaboratories, NorthChicago)对大鼠进行麻醉，利用含有1. 5%异氟烷的70%N20与30%02的混合物维持在麻醉下。在加热垫上维持直肠温度为37°C ±0. 5°C。将动物随机分为3组，进行SHED来源培养上清(SH-CM)的鼻腔给药(η=第1、16天、屠杀=1) (I组)、或生理盐水磷酸缓冲液(PBS)的鼻腔给药(η=第1、16、屠杀=1) (II组)、或仅进行pMCAO操作(η=第5、16天、屠杀=5) (III组)。SH-CM与实施例1同样地制备，用于本实验中。使大鼠仰卧，利用卷起的4cmX4cm的纱布将头垫起，使用哈密顿微量注射器在交替变换鼻腔的情况下，在嗅觉路径中以每次10 μ1、给药间隔2分钟进行给药，每只大鼠合计给药100 μ I。这些步骤中，口和相反侧的鼻腔闭合。鼻腔给药在第3天 第15天每天进行。运动障碍的评价对标准化运动障碍尺度施以轻微变更来进行使用，在第1、3、6、9、12以及15天对大鼠进行盲试研究。以下各参数给大鼠加I分提尾瞬间吊起时与卒中对侧的前肢的屈曲；从桌上拉起时对侧后肢的伸展；以及在阻力下向麻痹侧的旋转。进一步地，在欲行走时向麻痹侧旋转运动则加I分；未能在10秒以内走出直径50cm的圆的情况下加I分；未能在20秒以内走出圆的情况下加2分；未能在60秒以内走出圆的情况下加3分。进一步地,在桌上由上方按压时，在横向(laterally)按压时以及侧向(sideways)按压时,在大鼠无法伸出麻痹的前肢的情况下，分别加I分。各动物在每一时间点对运动障碍尺度进行3次评价。梗塞体积的评价将由第16天的样品得到的冷冻切片利用苏木素和伊红进行染色。使用ImageJ(ML、美国国立卫生研究所)，求出厚度20mm、l. OOmm间隔的12个冠状切片中的各梗塞面积。这12个冠状切片覆盖了全部梗塞区域。计算梗塞面积的合计，用切片间的距离(1. 00mm)乘以这些面积，从而计算出局部梗塞体积，其后进行脑水肿的治疗。结果运动功能的评价在早期阶段，所有组(I组、II组以及III组)在运动功能方面显示出较高评分(评分在第I天为8 ；9 ；8. 2±0. 45、在第3天为8 ；9 ；8. 6±0. 89)。在第6天，与II组和III组比较，6天后的I组中的运动障碍的渐进性提高显著(6 ；9 ；8. 2±0. 84);在第9天，与II组和III组比较，I组中更为显著(5 ；8 ;8. 8±1.0)(图27)。在I组中，在第12天(4)和第15天(3)记录到持续改善,在II组和III组中,第15天观察到了运动障碍的持续损伤(超过 8 的评分)(9 ；8. 25±O. 96)。梗塞体积的减少与II 组和 III 组(第 16 天、192. 7mm3、n=l ;第 16 天、222. 7mm3、n=l)比较，在第 16天，I组(第16天、54. 3mm3> n=l)的梗塞体积有显著减少(图28)。该结果暗示出，SH-CM的鼻腔给药促进了再生。由此可知，确认到了细胞因子疗法对脑梗塞区域具有良好的恢复效果，对于脑梗塞的治疗是有用的。在其它多个大鼠中也确认到了同样的结果。另外可知，在细胞因子疗法中，通过选择鼻腔给药，使侵袭性降低，可透过血脑屏障而对缺血部位直接发挥出效果。进一步地，考虑到乳牙干细胞培养上清中含有各种营养因子，因而与营养因子单独给药相比，可期待更迅速的恢复。[实施例6]1.牙髓干细胞培养上清的制备按照以下步骤制备牙髓干细胞(SHED和DPSC)的培养上清(参照图29参照)，用于神经再生效果的验证实验中。(i)在含有血清(10%FBS)的培养基中，在37°C、5%C02条件下对牙髓干细胞进行培养，直至培养皿成70% 80%融合。(ii)在呈70% 80%融合时，利用PBS对培养皿进行2次清洗，将培养基交换为无血清(0%FBS)培养基。
(iii)在37°C、5%C02条件下进行48小时培养。(iv)将经过了 48小时的无血清培养基回收到离心管中。(V)将回收的无血清培养基在1500转离心4 5分钟，使死细胞等杂质沉淀。(vi)在不从离心的离心管中吸引出杂质的条件下，将上清回收到新的离心管中。(vii)将回收的上清进一步在4°C、以15000转离心I分钟，再次使杂质沉淀。(viii)在不从离心的离心管中吸引出杂质的条件下，将上清再次回收到新的离心管中。(ix)将所得到的上清作为牙髓干细胞培养上清。2.体外(In vitro)分析中所用的神经系统细胞作为神经系统细胞使用PC12细胞。该细胞为永生株化的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞。已知通过添加作为神经营养因子之一的NGF (神经生长因子，nerve growth factor)可使神经轴突样突起生长，分化为神经细胞样细胞，用作各种体外神经系统实验的模型细胞。3.牙髓干细胞培养上清的神经突起生长效果和凋亡抑制效果(使用神经再生抑制物质的神经突起生长实验、凋亡诱导实验)在神经再生抑制物质(神经突起生长抑制因子)的存在下和非存在下对于牙髓干细胞培养上清的神经突起生长效果和凋亡抑制效果进行了研究。作为神经再生抑制物质使用CSPG和MAG。实验操作步骤如下。(I)神经突起生长实验(i)在24小时、37°C的条件下，利用神经再生抑制物质(CSPG或MAG)包被细胞培养用孔(聚-L-赖氨酸包被)。(ii)将PC12细胞播种于神经再生抑制物质涂布微板中，利用牙髓干细胞培养上清进行24小时培养。作为比较对照组，使用无血清培养基、成纤维细胞培养上清、骨髓间充质干细胞培养上清。(iii)利用相位差显微镜照片对PC12细胞的神经突起生长进行评价。(2)凋亡诱导实验 将PC12细胞播种于神经再生抑制物质涂布微板中，利用牙髓干细胞培养上清进行24小时培养。利用TUNEL法对细胞凋亡进行评价。作为比较对照组，使用无血清培养基、成纤维细胞培养上清、骨髓间充质干细胞培养上清。在神经再生抑制物质(CSPG、MAG)涂布微板中，与其它对照组比较，牙髓干细胞培养上清显示出了较强的神经突起生长效果(图30 33)和凋亡抑制效果(图34、35)。另外，即使不添加对于PC12细胞分化为神经细胞样细胞为必须的NGF ( S卩，单独为牙髓干细胞培养上清)，牙髓干细胞培养上清也显示出了较强的神经突起生长效果。S卩，如图30所示，即使在包被有神经再生抑制物质CSPG的培养皿上，在利用牙髓干细胞培养上清对PC12神经样细胞进行培养(24小时)时，神经突起也会生长(牙髓干细胞培养上清显示出突起生长作用)(参照图30)。在单独加入骨髓间充质干细胞或皮肤来源成纤维细胞的培养上清、或者抑制ROCK活化的Y27632时，则确认不到这样的生长作用。并且，如图31所示，即使在神经再生抑制物质CSPG存在的条件下，牙髓干细胞培养上清也会使显示出神经突起生长的细胞比例增高，促进形成更长的突起。另一方面，如图32所示，在包被有神经再生抑制物质MAG的培养皿上，在利用牙髓干细胞培养上清对PC12神经样细胞进行培养(24小时)时，神经突起也会生长(牙髓干细胞培养上清显示出突起生长作用)。在单独加入骨髓间充质干细胞或皮肤来源成纤维细胞的培养上清、或者抑制ROCK活化的Y27632时，则确认不到这样的生长作用。如图33所示，即使在神经再生抑制物质MAG存在的条件下，牙髓干细胞培养上清也会使显示出神经突起生长的细胞比例增高，促进形成更长的突起。如图34和图35所示，在包被有神经再生抑制物质MAG或CSPG的培养皿上对PC12神经样细胞进行24小时培养时，几乎全部细胞产生凋亡。牙髓干细胞培养上清几乎完全抑制了该凋亡。另外，图30中各记号表示如下内容。PLL :聚_L_赖氨酸包被；PLL+NGF :聚_L_赖氨酸包被和NGF (神经生长因子)添加；PLL/CSPG ■ 聚-L-赖氨酸包被和CSPG包被；PLL/CSPGY27632 :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和Y27632添加；PLL/CSPGSHED_CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/CSP⑶PSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/CSPGBMSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/CSPG Fibro-CM 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于成纤维细胞培养上清的培养。图31的各记号表示如下内容。PLL :聚_L_赖氨酸包被；PLL+NGF :聚_L_赖氨酸包被和NGF (神经生长因子)添加；PLL/CSPG :聚-L-赖氨酸包被和CSPG包被；PLL/CSPG+NGF 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和NGF添加；PLL/CSPG+SHED-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/CSPG+NGF+SHED-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被、NGF添加和基于SHED培养上清的培养；PLL/CSPG+DPSC-CM 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/CSPG+NGF+DPSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被、NGF添加和基于DPSC培养上清的培养；PLL/CSPG+BMSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/CSPG+NGF+BMSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被、NGF添加和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/CSPG+Fibro-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于成纤维细胞的培养上清的培养；PLL/CSPG+NGF+Fibro-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被、NGF添加和基于成纤维细胞的培养上清的培养；PLL/CSPG+Y27632 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和Y27632添加；PLL/CSPG+NGF+Y27632 ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被、NGF添加和Y27632添加。图32中各记号表示如下内容。PLL :聚_L_赖氨酸包被；PLL+NGF :聚_L_赖氨酸包被和NGF (神经生长因子)添加；PLL/MAG :聚-L-赖氨酸包被和MAG包被；PLL/MAG Y27632 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和Y27632添加；PLL/MAGSHED_CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/MAGDPSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/MAGBMSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/MAG Fibro-CM 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于成纤维细胞的培养上清的培养。 图33中各记号表示如下内容。PLL :聚_L_赖氨酸包被；PLL+NGF :聚_L_赖氨酸包被和NGF (神经生长因子)添加；PLL/MAG ■ 聚-L-赖氨酸包被和MAG包被；PLL/MAG+NGF 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和NGF添加；PLL/MAG+SHED_CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/MAG+NGF+SHED-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被、NGF添加和基于SHED培养上清的培养；PLL/MAG+DPSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/MAG+NGF+DPSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被、NGF添加和基于DPSC培养上清的培养；PLL/MAG+BMSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/MAG+NGF+BMSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被、NGF添加和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/MAG+Fibro-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于成纤维细胞培养上清的培养；PLL/MAG+NGF+Fibro-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被、NGF添加和基于成纤维细胞培养上清的培养；PLL/MAG+Y27632 ■ 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和Y27632添加；PLL/MAG+NGF+Y27632 :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被、NGF添加和Y27632添加。图34中各记号表示如下内容。PLL 聚_L_赖氨酸包被；PLL/CSPG 聚_L_赖氨酸包被和CSPG包被；PLL/CSPG SHED-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/CSPG DPSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/CSPG BMSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/CSPG Fibro-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于成纤维细胞培养上清的培养；PLL/CSPG+Y27632 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和Y27632添加；PLL 聚-L-赖氨酸包被、PLL/MAG :聚-L-赖氨酸包被和MAG包被；PLL/MAG SHED-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/MAG DPSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/MAG BMSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/MAG Fibro-CM 聚-L-赖氨酸包被、MG包被和基于成纤维细胞培养上清的培养；PLL/MAG Y27632 :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和Y27632添加。图35中各记号表示如下内容。PLL ■ 聚_L_赖氨酸包被；PLL/CSPG ■ 聚_L_赖氨酸包被和CSPG包被；PLL/CSPG SHED-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/CSPG DPSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/CSPG BMSC-CM ■ 聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/CSPG Fibro-CM :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和基于成纤维细胞培养上清的培养；PLL/CSPG+Y27632 :聚-L-赖氨酸包被、CSPG包被和Y27632添加；PLL :聚-L-赖氨酸包被；PLL/MAG :聚-L-赖氨酸包被和MAG包被；PLL/MAG SHED-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于SHED培养上清的培养；PLL/MAG DPSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于DPSC培养上清的培养；PLL/MAG BMSC-CM :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于骨髓间充质干细胞培养上清的培养；PLL/MAG Fibro-CM 聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和基于成纤维细胞培养上清的培养；PLL/MAG Y27632 :聚-L-赖氨酸包被、MAG包被和Y27632添加。由以上内容明确了牙髓干细胞培养上清抑制神经再生抑制物质的作用、促进神经突起的生长、抑制凋亡这一令人吃惊的事实。换言之，其判明牙髓干细胞培养上清对于中枢神经系统的再生或中枢枢神经疾病的治疗是极为有效的。4.使用脊髓损伤模型动物的检证(I)下肢运动功能基于培养上清给药的改善在利用戊巴比妥钠全身麻醉的状态下切除8周龄雌性SD大鼠的第十胸椎，使用IH Impactor自硬膜外以200kDyn的力施加挤压伤，制作脊髓挤压伤模型。在施与挤压伤后，立即将与完全埋入式微量注射泵(该注射泵中填入有牙髓干细胞培养上清(SHED-CM)、骨髓间充质干细胞培养上清(BMSC-CM)或者PBS(对照))连结的硅橡胶管由第十二胸椎下的蛛网膜下腔插入，按照在损伤部位的正上方流出的方式进行设置。以24 μ I/日的流速进行8周的持续给药直至处死为止，每I周进行下肢运动功能评价。评价中使用 Basso-Beattie- Bresnahan (BBB)评分(Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. , Asensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats, J.Neurotrauma. , 1995:12:1-21.)。<BBB 评分 >0.股关节、膝关节、足关节完全不能活动。1.1 2个关节稍能活动。2.仅I个关节可伸展。3.仅2个关节可伸展。4. 3个关节全部稍能活动。5. 2个关节稍能活动、I个关节可伸展。6.1个关节稍能活动、2个关节可伸展。7. 3个关节全部可伸展。8.未能支撑体重，但足底部可着地、可爬行。9.下肢有时可支撑体重，有时走有时爬。10.有时(5 50%)可支撑体重行走，但无上下肢协调性。11.经常(50% 100%)可支撑体重行走，但无上下肢协调性。
12.有时(5 50%)可支撑体重行走，有时(5 50%)确认到上下肢的协调性。13.经常(50% 100%)可支撑体重行走，经常(50% 100%)确认到上下肢的协调性。14.经常由足底部支撑体重，可确认到上下肢的协调性/经常由足底部支撑体重， 但两足方向外转(由于肌力弱)。15.确认到上下肢的协调性，有时(5 50%)快速地抬起足跟行走。但足踝外转。16.确认到上下肢的协调性，经常(50 100%)快速地抬起足跟行走。有时足的位 置为中间位。17.确认到上下肢的协调性，经常(50 100%)快速地抬起足跟行走。足的位置为 中间位。18.确认到上下肢的协调性，快速地抬起足跟行走。足的位置为中间位。19.确认到上下肢的协调性，快速地抬起足跟行走。足的位置为中间位。尾巴朝 下。20.确认到上下肢的协调性，快速地抬起足跟行走。足的位置为中间位。尾巴朝上。21.确认到上下肢的协调性，快速地抬起足跟行走。足的位置为中间位。尾巴朝 上，且可支撑体重。利用BBB评分对下肢运动功能的改善效果进行比较。其评价结果示于图36中。牙 髓干细胞培养上清给药组(SilED-CM)的评分为15 (确认到上下肢的协调性、有时(5 50%) 快速地抬起足跟行走。但足踝外转)，下肢运动功能显示出令人吃惊的改善和恢复。骨髓间 充质干细胞培养上清(BMSC-CM)给药组也显示出了一定程度的改善，但其改善效果远不及 SHED-CM 组。(2)8周后的脊髓形态变化在SHEM-CM (或BMSC-CM或者PBS)给药开始后第8周，对大鼠进行多聚甲醛灌流 固定。接着，在自损伤部位起头侧5mm和尾侧5mm处切断脊髓并取出。在Sham组、对照组、 BMSC-CM组、SilED-CM组间对其重量进行比较。在给药开始后第8周对脊髓的形态变化进行了研究。图37上部表示所取出的脊 髓的状态。另外，图37下部表示脊髓的重量(质量)的比较。在SffiD-CM处理组中，相对 于损伤部位(中心，epicenter)尾侧脊髓(尾部，caudal)的萎缩受到了抑制(图37上)。 即，SHED-CM给药抑制了损伤脊髓的形态变化。与该结果相一致地，SHEM-CM组中的脊髓重 量也有增加(图37下)。(3)8周后的脊髓神经轴突在SHEM-CM(或PBS)给药开始后第8周，对大鼠进行多聚甲醛灌流固定。在自损 伤部位起头侧5mm和尾侧5mm处切断脊髓并取出。接着，利用0. C. T复合物对脊髓进行冷 冻包埋，制作脊髓冷冻切片。将脊髓冷冻切片利用抗血清素(5-HT)抗体与抗神经轴突抗体 神经丝蛋白-M(NF-M)进行免疫染色。在给药开始后第8周对损伤部位及其附近进行组织学研究。免疫染色的结果示于 图38。通过SffiD-CM的持续微量给药来维持相对于损伤部位为尾侧的总神经纤维(NF-M) 的数目。由脑干的缝际核(raphe nuclei)投射到脊髓的血清素纤维数目也得到维持。可判明，通过SHED-CM的给药，神经纤维的消失得到抑制，属于上部位置-脑干产生的神经传递物质的血清素被由损伤部位传输到下部位置。(4)基于培养上清的凋亡抑制实验在脊髓挤压伤后24小时和I周对对照组、SHED-CM组进行多聚甲醛灌流固定。在自损伤部位起头侧5mm和尾侧5mm处切断脊髓并取出。利用O. C. T复合物对取出的脊髓进行冷冻包埋，制作脊髓冷冻切片。分别利用与片段化DNA特异性反应的TUNEL、星形细胞特异性抗体GFAP、神经细胞特异性抗体NeuN、少突神经胶质细胞特异性抗体CNPase对脊髓冷冻切片进行双重免疫染色，对神经细胞、神经胶质细胞的细胞死亡进行比较研究。在脊髓挤压伤后24小时和I周的时刻，对损伤部位及其附近的神经细胞死亡进行评价。结果示于图39。SHED-CM的持续微量给药抑制了神经损伤后立即产生的星形细胞、神经、少突神经胶质细胞的凋亡性细胞死亡。在脊髓损伤中，在损伤I周后，在更大的区域观察到了少突神经胶质细胞的凋亡性死亡(二次损伤的扩大)。这揭示出了 SHED-CM还抑制该凋亡性死亡，从而抑制了神经损伤的扩大。根据上述内容，作为能够适用本发明中的中枢神经疾病治疗用组合物的疾病，推测有脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默氏病、帕金森氏病、进行性核上清麻痹、亨丁顿舞蹈症、多系统萎缩症或脊髓小脑变性症等神经退行性疾病；脑缺血、脑梗塞或脑内出血等所致的神经细胞的退行-脱落；伴有神经细胞障碍的视网膜疾病。因而，根据本发明，由于使用含有通过对干细胞进行培养而得到的细胞因子混合物的干细胞培养上清，因而可使靶组织的内源性干细胞发生分化且发生增殖。其结果，通过损伤部位处的细胞的增殖以及细胞外基质的生成等，能够进行靶组织的修复和再生。
本发明并不受上述发明实施方式和实施例说明的任何限制。只要不脱离权利要求书的记载，在本领域技术人员可以容易地想到的范围内的各种变形方式也包含在发明中。2010年3月26日提交的美国临时专利申请第61/317,713号、2010年11月5日提交的美国临时专利申请第61/410，370号、2010年12月I日提交的日本专利申请第2010-267962号、2011年I月31日提交的美国临时专利申请第61/437,697号和2011年2月23日提交的日本专利申请第2011-037028号的公开内容全部以参考的形式并入到本说明书中。本说明书所记载的全部文献、专利申请、和技术标准以参考的方式并入各文献、专利申请、和技术标准，是与具体且分别单独记载的情况同等程度地援引并入到本说明书中的。
权利要求
1.一种损伤部位治疗用组合物，其用于修复靶组织的损伤部位，该组合物含有通过培养干细胞而得到的干细胞培养上清。
2.如权利要求1所述的损伤部位治疗用组合物，其中，该组合物不含有所述干细胞。
3.如权利要求1或权利要求2所述的损伤部位治疗用组合物，其中，所述干细胞培养上清含有至少2种细胞因子。
4.如权利要求1 3的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，所述干细胞培养上清含有选自由血管内皮增殖因子(VEGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源生长因子(TOGF)、转化生长因子-β (TGF-β)组成的组中的至少2种细胞因子。
5.如权利要求1 4的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物,其中,所述干细胞为成体干细胞。
6.如权利要求1 5的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物,其中,所述干细胞来源于间充质干细胞。
7.如权利要求1 6的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物,其中,所述干细胞为牙髓干细胞。
8.如权利要求1 7的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，该组合物不含有血清。
9.如权利要求1 8的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，所述损伤部位治疗为皮肤、牙周组织或者骨的损伤的治疗；脑硬塞治疗；或中枢神经疾病治疗。
10.如权利要求1 9的任一项所述的损伤部位治疗用组合物，其中，所述损伤部位治疗为中枢神经疾病的治疗，所述中枢神经疾病为选自由脊髓损伤、神经退行性疾病、神经细胞的退行或脱落以及伴有神经细胞障碍的视网膜疾病组成的组中的疾病或病症。
11.如权利要求1 10的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物的制造方法，其包括以下的步骤⑴ ⑶ (1)从牙髓细胞中挑选出粘附细胞的步骤； (2)对所述粘附细胞进行培养的步骤；和 (3)回收培养上清的步骤。
12.如权利要求11所述的制造方法，其进一步包括以下的步骤(4) (4)对于回收后的培养上清进行处理的步骤，所述处理选自由离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐和保存组成的组中的至少I种。
13.如权利要求11或权利要求12所述的制造方法，其进一步包括下述步骤(a)和(b)中的至少一个步骤 (a)针对所回收的培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；和 (b)针对所回收的培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。
14.一种损伤部位治疗方法,其为用于修复靶组织的损伤部位的损伤部位治疗方法,其中，该方法包括将权利要求1 10的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物以用于修复所述靶组织的损伤部位的有效量对具有所述损伤部位治疗用组合物的靶组织的患者进行给药的步骤。
15.如权利要求14所述的损伤部位治疗方法，其中，所述损伤部位的修复是基于内源性干细胞的能力来进行的。
16.如权利要求14或权利要求15所述的损伤部位治疗方法，其中，通过选自由静脉给药、动脉给药、门静脉给药、皮内给药、皮下给药、肌肉给药、腹腔给药和鼻腔给药组成的组中的给药方法进行所述损伤部位治疗用组合物的给药。
17.一种脑梗塞的治疗方法，该方法包括将权利要求1 10的任意I项所述的损伤部位治疗用组合物以用于修复脑损伤部位的治疗有效量对脑梗塞患者进行给药的步骤。
18.如权利要求17所述的脑梗塞的治疗方法，其中，所述损伤部位治疗用组合物通过鼻腔给药进行给药。
19.一种中枢神经疾病的治疗方法，该方法包括将权利要求1 10的任一项所述的损伤部位治疗用组合物作为中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。
20.如权利要求19所述的治疗方法，其中，在与所述中枢神经疾病治疗用组合物给药的同时或在该中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以牙髓干细胞对所述中枢神经疾病患者进行给药。
21.如权利要求20所述的治疗方法，其中，所述牙髓干细胞为采集后未进行分化诱导处理的未分化型牙髓干细胞、或者为采集后分化诱导为神经系统细胞的分化诱导型牙髓干细胞。
22.如权利要求19 权利要求21的任意I项所述的治疗方法，其中，在所述中枢神经疾病治疗用组合物的给药后，以分化诱导为神经系统细胞的多能干细胞对所述中枢神经疾病患者进行给药。
23.一种方法，其是判断所制备的牙髓干细胞的培养上清作为在所述权利要求19 权利要求22的任意I项所述的中枢疾病治疗方法中使用的中枢疾病治疗用组合物的有效成分是否有效的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b)中的至少一个步骤 (a)针对所述培养上清，确认其是否在神经再生抑制物质的存在下具有神经突起生长作用的步骤；和 (b)针对所述培养上清，确认其对于神经细胞是否具有凋亡抑制作用的步骤。
全文摘要
本发明提供损伤部位治疗用组合物，其用于修复靶组织的损伤部位，该组合物含有通过培养干细胞而得到的干细胞培养上清；损伤部位治疗方法，其是用于修复或恢复靶组织的损伤部位的损伤部位治疗方法，该方法包括将上述损伤部位治疗用组合物以用于修复上述靶组织的损伤部位的治疗有效量对具有上述损伤部位治疗用组合物的靶组织的患者进行给药的步骤；脑梗塞的治疗方法，该方法包括将上述损伤部位治疗用组合物以用于修复脑损伤部位的有效量对脑梗塞患者进行给药的步骤；中枢神经疾病的治疗方法，该方法包括将上述损伤部位治疗用组合物作为中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。
文档编号A61P17/00GK103037872SQ201180025468
公开日2013年4月10日 申请日期2011年3月25日 优先权日2010年3月26日
发明者上田实, 山田阳一, 蛯泽克己, 山本朗仁, 酒井阳, 松原弘记, 服部宇, 杉山昌彦, 井上崇德 申请人:国立大学法人名古屋大学