专利名称：一种抗肝癌蛋白质pp3501及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物或保健品技术领域，特别是一种抗肝癌蛋白质PP3501及其制备方法和应用。
背景技术：
肝癌是严重威胁人类健康的疾病之一，抗肝癌药物的研究与开发在当今的医学领域中具有重大意义。寻找治疗肝癌的药物或其他治疗肝癌的方法是具有迫切性和深远的社会意义。 用限制性差异显示聚合酶链反应技术分析获得一基因序列与预测蛋白pp3501的基因序列相似的编码序列，蛋白质氨基酸序列是Met Val Leu Ala AspAla Ala Lys MetArg Ser Pro Arg Val Arg Met Ala Pro Asn Pro Val ProGly Thr Leu lie Arg Arg GlyLys Leu Gly Arg Arg Gln Glu Gly Arg ValLys Thr Glu Ala Glu Thr Gly Gly Gln GlyVal Pro Gly Val Ala Gln SerHis His Gly Leu Gln Glu Val Trp Asp Arg Leu Ser GlnPro Gln Lys GlyPro Ala Pro His Arg Pro Gly Phe Gln Arg Ala Asn lie Ser Val AlaGluAla Pro Ser Ala Phe Ala Val Leu Gly Asp Gly Arg Arg His lie Cys SerTrp ProVal Ser Arg Ser Val Ala Pro Thr Val Ser Gly His Trp Pro GluGly Asn Arg Lys SerTrp Arg Gly Arg His Thr His Glu Pro Phe Arg AsnAsn Glu。编码蛋白质分子量是 16kDa，等电点是11. 6。理论分析pp3501蛋白含有三个α-螺旋结构和6个β-折叠结构。我们实验发现ρρ3501抑制多种表型肝癌细胞生长，并增强丁酸钠抑制肝癌细胞生长。本品可用于制备抗肝癌药物的成分，并建立基因工程生产该蛋白的方法。经检索发现，在国内外均未发现用ρρ3501抗肝癌的报道。
发明内容
本发明的目的是针对肝癌发病率日益增加，寻找新的抗肝癌药物和靶点是筛选新型抗肝癌药物或药物前体的有效途径。提供一种抗肝癌蛋白质ΡΡ3501及其制备方法，本发明的另一个目的是提供抗肝癌蛋白质ΡΡ3501的新用途，即在治疗肝癌药物和保健品中的应用。这种蛋白能够抑制多种表型肝癌细胞生长，并增强丁酸钠抑制肝癌细胞生长。为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是该抗肝癌蛋白质ΡΡ3501的制备方法是通过基因工程生产抗肝癌蛋白质ΡΡ3501，具体按以下步骤(I)用含多聚腺苷酸序列的引物，35 42°C反转录，然后用上游引物5’ -GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3’，下游引物5’ -TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3’ 进行聚合酶链反应扩增，聚合酶链反应参数90°C 95°C预变性5分钟，90°C 95°C加热10 40秒，53°C 60°C反应25 40秒，70°C 75°C反应25 40秒，25 40个循环后72°C延伸3 10分钟，I 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收反转录-聚合酶链反应产物；(2)分别用制性内切酶酶切纯化后的反转录-聚合酶链反应产物和原核表达载体，再分别纯化后，用连接酶连接构建成真核或原核表达重组质粒，真核表达质粒携带的PP3501可用于基因治疗的成分，原核表达重组质粒转化大肠杆菌，用基因工程技术制备PP3501 蛋白；(3)将重组原核表达质粒转化大肠杆菌表达菌，在含有选择性抗生素的培养基中，35°C 38°C振荡培养，I 5小时后用终浓度为O. I 3mmol/L的异丙基-beta_D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导2 6小时，4°C，分别收集细菌和上清；(4)上清液浓缩后通过亲和树脂进行纯化，大肠杆菌中以包涵体形式存在的蛋白，用尿素处理，溶解，通过亲和树脂进行纯化。本发明的抗肝癌蛋白质PP3501在制备治疗肝癌药物和保健品中的应用，是利用PP3501抑制多种表型肝癌细胞的生长，增强丁酸钠抑制肝癌生长；采用基因工程方法制备抗肝癌蛋白质PP3501，利用该成分制备抗癌药物或药物组分。
用pp3501蛋白直接作用肝癌细胞，可直接杀伤肝癌细胞。用基因载体将pp3501基因转入肝癌细胞，可显著抑制肝癌细胞增殖。抗肝癌实验过程简介体外培养不同表型的肝癌细胞，加入20 μ g/ml的目的蛋白，培养I 5天(结果见图4)。或建立裸鼠荷瘤模型，采用瘤内注射，观察目的蛋白抗肝癌效果(结果见图5)。pp3501蛋白的功能抑制多种表型肝癌细胞生长。PP3501蛋白的新用途pp3501蛋白在制备抗肝癌药物和保健品中的应用。具体的使用形式可制成注射针剂，按注射针剂要求使用。用法I.可单一使用。2.可作为抗肝癌药物或其中一个组份使用。使用条件使用条件参照蛋白质多肽药物的条件，同时参照抗肿瘤药物适用范围。
图I是克隆产物琼脂糖凝胶电泳图；图中1 :分子量标准；2 :克隆产物图2是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对pp3501融合蛋白的可溶性分析图；图中1 :分子量标准；2:异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导转染pET-32a-pp3501细菌抽提物上清液；3 :异丙基-beta_D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导转染pET-32a-pp3501细菌抽提物不溶物.图3是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PP3501融合蛋白的纯化图；图中1 :异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导转染pET_32a-pp3501细菌抽提物；2 :纯化后的pp3501融合蛋白图4是pp3501抑制不同表型肝癌细胞生长图5是动物实验结果；*P < O. 05，林P < O. 01与对照组比较；#P < O. 05与丁酸钠组比较。
具体实施例方式I.用特异引物用含多聚腺苷酸序列的引物，37°C反转录，然后上游引物5’ -GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3’，下游引物5’ -TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3’ 进行聚合酶链反应扩增。聚合酶链反应参数94°C预变性5分钟，94°C 30秒，56 °C 30秒，72 °C 30秒。30个循环后72°C延伸5分钟。I %琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收反转录-聚合酶链反应产物。2.原核表达重组质粒的构建 分别用制性内切酶EcoR I、Sal I酶切纯化后的反转录-聚合酶链反应产物和pET-32a载体，再分别纯化后，用T4连接酶连接构建成原核表达重组质粒，转化大肠杆菌E. coli DH5 α 03.原核表达重组质粒在大肠杆菌的表达将原核表达重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌，挑取原核表达重组质粒接种到含氨苄青霉素100微克/毫升的培养基，，37°C振荡培养过夜。取5微升原核表达重组质粒的过夜菌和5微升pET-32a空载质粒的过夜菌分别接种于含氨苄青霉素100微克/毫升的培养基中，37°C振荡培养。3小时后各取一支用终浓度为lmmol/L的异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导5小时。4°C，12000转/分钟，离心I分钟，分别收集细菌和上清。4.包涵体提取和纯化上清液浓缩后通过亲和树脂进行纯化。大肠杆菌中以包涵体形式存在的蛋白，用变6mmol/L尿素处理，溶解，通过亲和树脂进行纯化。纯化产物于10%或12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳进行分析。5. pp3501抑制肝癌细胞生长用pp3501蛋白直接作用肝癌细胞，可直接杀伤肝癌细胞。用基因载体将pp3501基因转入肝癌细胞，可显著抑制肝癌细胞增殖。制备裸鼠荷瘤模型，瘤内分别注射PP3501蛋白质(3mg/kg)或丁酸钠(30mg/kg)，或两者同时注射。裸鼠荷瘤实验显示，瘤内注射可显著抑制肝癌生长，并增强丁酸钠的作用效果。结果简介I、人pp3501基因的克隆pp3501重组表达质粒经特异性引物的初步鉴定成功扩增出pp3501基因的编码序列，大小为432碱基对(见图I)。2、pp3501融合蛋白的表达经凝胶电泳检测，诱导的pp3501重组表达质粒转化的大肠杆菌，在蛋白分子量标准34kDa左右出现了明显的高表达的蛋白条带(见图2)。pp3501基因编码的蛋白分子量是16kDa, Pet_32a载体编码的组氨酸标签分子量为18kDa,重组pp3501蛋白分子量是34kDa。经电泳检测，诱导的pp3501重组表达质粒转化大肠杆菌的沉淀中，在蛋白分子量标准34kDa处出现了明显的高表达的蛋白条带，而在上清中pp3501融合蛋白的表达量较低(见图2)。用亲和树脂纯化出高纯度的pp3501融合蛋白(见图3)。3、pp3501对肝癌细胞的增殖抑制作用
结果如图4和图5所示。pp3501抑制不同表型肝癌细胞生长，各实验组曲线明显迟缓于相应对照组。制备裸鼠荷瘤模型，瘤内分别注射PP3501蛋白质或丁酸钠，或两者同时注射均抑制肝癌生长，PP3501增强丁酸钠抗肝癌效果。
权利要求
1.一种抗肝癌蛋白质PP3501的制备方法，是通过基因工程生产抗肝癌蛋白质PP3501，具体按以下步骤 (1)用含多聚腺苷酸序列的引物，35 42°C反转录，然后用上游引物5’-GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3’，下游引物5’ -TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3’ 进行聚合酶链反应扩增，聚合酶链反应参数90°C 95°C预变性5分钟，90°C 95°C加热10 40秒，53°C 60°C反应25 40秒，70°C 75°C反应25 40秒，25 40个循环后72°C延伸3 10分钟，I 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收反转录-聚合酶链反应产物； (2)分别用制性内切酶酶切纯化后的反转录-聚合酶链反应产物和原核表达载体，再分别纯化后，用连接酶连接构建成真核或原核表达重组质粒，真核表达质粒携带的PP3501可用于基因治疗的成分，原核表达重组质粒转化大肠杆菌，用基因工程技术制备PP3501蛋白； (3)将重组原核表达质粒转化大肠杆菌表达菌，在含有选择性抗生素的培养基中，35°C 38°C振荡培养，I 5小时后用终浓度为O. I 3mmol/L的异丙基-beta_D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导2 6小时，4°C，分别收集细菌和上清； (4)上清液浓缩后通过亲和树脂进行纯化，大肠杆菌中以包涵体形式存在的蛋白，用尿素处理，溶解，通过亲和树脂进行纯化。
2.—种抗肝癌蛋白质pp3501在制备抗癌药物和保健品的应用。
3.一种抗肝癌蛋白质PP3501在制备抗癌药物组份和保健品组份中的应用。
全文摘要
本发明属于药物或保健品技术领域，特别是一种抗肝癌蛋白质pp3501及其制备方法和应用。这种蛋白可用基因工程的方法生产制备，将重组原核表达质粒转化大肠杆菌表达菌，在含有选择性抗生素的培养基中，35℃～38℃振荡培养。1～5小时后用终浓度为0.1～3mmol/L的异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导2～6小时。4℃，分别收集细菌和上清；上清液浓缩后通过亲和树脂进行纯化。大肠杆菌中以包涵体形式存在的蛋白，用尿素处理，溶解，通过亲和树脂进行纯化。蛋白质pp3501在制备抗肝癌药物和保健品或作为抗肝癌药物和保健品组份中的应用。这种蛋白能够抑制多种表型肝癌细胞生长，并增强丁酸钠抑制肝癌细胞生长。
文档编号A61K38/17GK102851296SQ20121009024
公开日2013年1月2日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者张海涛, 汪亚君, 马超, 伍俊 申请人:广东医学院