石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种石榴皮抗肿瘤多酚有效部位，由石榴皮乙醇提取物经大孔树脂分离纯化得到，其中，多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50～80％，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10～25％、0.80～1.2％、35～53％。本发明所具有的优点是：充分利用了石榴皮资源、活性成分含量满足辅助治疗和/或预防肿瘤要求。本发明还公开了该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法及其在制备辅助治疗和/或预防肿瘤药物制剂中的应用。
【专利说明】石榴皮抗肿瘤多酚有效部位及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药制药【技术领域】，尤其是涉及一种石榴皮抗肿瘤多酚有效部位。本发明还公开了该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是威胁人类健康的最常见、多发疾病，其发病因素较多，且近些年来肿瘤性癌症在我国的发病率呈明显上升趋势。目前，主要的治疗手段有手术、放疗、化疗、内分泌和靶向治疗，它们各有优势和局限。寻找一种有效、低毒、适用范围广的抑肿瘤性癌症药物成为当前之研究热点。
[0003]多酚类物质在哺乳动物细胞中有广泛的生物效应，大量的流行病学研究以及动物试验都证明多酚类物质可以阻止和抑制癌症的发病。表现为:多酚的抗癌作用是多个方面的，可以对癌变的不同阶段进行相应抑制；多酚是一种十分有效的抗诱变剂，能够减少诱变剂的致癌作用，并提高染色体精确修复能力，从而达到提高细胞免疫力和抑制肿瘤细胞生长的目的。
[0004]石槽(学名:Punica granatum)为(安)石槽科(Punicaceae)(安)石槽属植物，别名安石榴、珍珠石榴、海石榴，又名若榴、丹若、沃丹、天浆、天浆果、金罂、金庞、涂林，新疆维吾尔语称“阿娜儿”。全世界共有I属[石榴属(Punica L.)]，2种，产于地中海及亚洲西部地区。我国引入栽培I种，即，石槽Punica granatum L.,在南北各省都有分布。主要分布在陕西、安徽、山东、四川、新疆、河南、云南等地。新疆是我国最西部的石榴产区，且质量好，年产量大。
[0005]石榴主要有效成分是多酚类化合物`，有黄酮类化合物(黄酮醇、黄烷醇、花色苷)、浓缩单宁(原花色素类)和水解单宁(鞣花单宁和没食子单宁)。其他的化学成分有有机酸和酚酸、生物碱类、留类、非留类雌激素拟雌内酯、磷脂、甘油三脂等。
[0006]石榴多酚对异种移植物增殖和人前列腺癌细胞入侵具有较强地抑制作用，通过调节细胞周期分布和诱导凋亡来实现其作用。石榴提取物可对乳腺癌细胞的增殖产生抑制作用，可起到对乳腺癌的化学预防和辅助治疗作用。近年来，穆拉德公司新推出的日用防晒护肤品系列中加入了石榴成分，该公司穆拉德博士认为，石榴所含的成分不仅可以抵御日光辐射，预防皮肤衰老，且可增加产品的SPF水平。
[0007]但是，文献调研表明:目前有关石榴的应用技术主要集中于石榴汁的榨取与利用，而榨汁后依然含有大量多酚物质的石榴皮则被当作食品加工的废渣被弃去，造成严重的资源浪费。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种石榴皮抗肿瘤多酚有效部位，它具有充分利用了石榴皮资源，且活性成分含量满足辅助治疗和/或预防肿瘤要求的特点。本发明还公开了该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法和应用。[0009]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:石榴皮抗肿瘤多酚有效部位，由石榴皮乙醇提取物经大孔树脂分离纯化得到，其中，多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50~72%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的 10 ~22%、0.80 ~0.95%,35 ~45%。
[0010]所述石榴皮乙醇提取物为石榴皮粉碎后过40~80目筛，按料液重量比(即石榴皮以g为单位的重量数值和乙醇以ml为单位的体积数值之比。下同)1: 10~1: 24加入浓度为30~60%乙醇作为提取溶剂，10~40°C浸提15~60min，滤过所得的提取物。
[0011]本发明所具有的优点是:1、充分利用了石榴皮资源。本发明的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位以食品加工废渣石榴皮为开发利用对象，对石榴皮多酚纯化工艺进行了研究，通过大孔树脂分离纯化技术得到石榴皮多酚有效部位，实现了石榴资源的高效利用。2、活性成分含量满足辅助治疗和/或预防肿瘤要求。有效部位提取物中总多酚重量百分比为50%~72%，其中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的含量分别为10~22%，0.80~0.95%,35~45%。药理实验表明石榴皮多酚有效部位作用48h后，MCF-7细胞GtlAi1期细胞增多，S期细胞减少，表示细胞周期被阻滞在GcZG1期。48h内对MCF-7、BEL-7404、PC-3、Caco-2、A375、Hela人源性肿瘤细胞增殖抑制率均大于50%。
[0012]该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法，依次包括以下步骤:
[0013]a)将石榴皮乙醇提取物滤过得提取液；
[0014]b)将提取液在0.4~0.8MPa、50~70°C条件下减压浓缩至每ImL含石榴皮药材10~30mg的浓缩液。
[0015]c)将步骤b)制备的浓缩液加入大孔吸附树脂，上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为2~3.5，上样量为2BV，以I~2BV/h吸附速度上样，吸附时间3~12h，用6~8BV蒸馏水洗脱树脂，依次用6~12BV30%乙醇、3~6BV50%乙醇洗脱树脂，洗脱速度为I~4BV/h，收集乙醇洗脱液，0.4~0.8MPa、50~70°C条件下减压浓缩；
[0016]d)将步骤c)制备的浓缩液放入真空冷冻罐中，冷冻罐中的初始温度为-5~-10°C，然后在4~5h内降至-30~-60°C ;将冷冻后的冻干物升温至10~20°C，保持1~3h，所得粉末即为该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位。
[0017]所述步骤C)中所用6~12BV30%乙醇、3~6BV50%乙醇以6~12BV50%乙醇代替。
[0018]所述的石槽皮为为石槽科植物石槽Punica granatum L.的干燥果皮。
[0019]该方法能够充分提取石榴皮中的有效成分，简单可行。
[0020]本发明的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位在制备辅助治疗和/或预防肿瘤药物制剂中的应用。即，该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以采用中药制剂的常规方法制备成常规剂型。例如:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散齐?、膏剂、丹剂、糖浆剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等。
[0021]比如，该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以制备为糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂等片剂。该片剂中含有效部位0.3g/片、药理上可以接受的辅料0.2g/片。服用方法为:一日三次，一次一片。
[0022]比如，该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以制备为硬胶囊剂、软胶囊剂等胶囊剂。该胶囊剂中含有效部位0.15g/粒、药理上可以接受的辅料0.15g/粒。服用方法为:一日服用三次，一次两粒。
[0023]比如，该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位可以制备为糖浆剂。该糖浆剂中每IOml含有效部位0.3g，其余为药理上可以接受的辅料。服用方法为:一日服用三次，一次10ml。
[0024]本发明的药物具有抑制人肿瘤细胞生长的功能，可用于辅助治疗和/或预防肿瘤。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明:
[0026]图1是本发明的石榴皮多酚有效部位作用48h后MCF-7细胞的Annexin V-FITC和PI双染检测结果图；
[0027]图2a是本发明的倒置显微镜观察MCF-7细胞形态结果图；
[0028]图2b是本发明的倒置显微镜观察有效部位作用24h后的MCF-7细胞形态结果图；
[0029]图3是石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱的18个共有指纹峰。
[0030]图中:
[0031]图1中A为对照组MCF-7细胞，B、C、D分别用5mg/ml, 20mg/ml, 80mg/ml石槽皮多酚有效部位作用48h的MCF-7细胞；
[0032]图3中4号峰为α -安石榴苷，5号峰为β -安石榴苷，17号峰为鞣花酸。
【具体实施方式】
[0033]下面通过实施例说明本发明的石榴皮多酚有效部位及其制备:
[0034]实施例1:通过以下步骤:
[0035]a)将石榴皮30g粉碎后按料液重量体积比1: 8加入240ml80%乙醇作为提取溶剂，5°C浸提lOmin，滤过。
[0036]b)将步骤a)制备的提取液0.4MPa、70°C条件下减压浓缩至每ImL含生药30mg混悬液。
[0037]c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD500型大孔吸附树脂，上样溶液经1.2mol/L盐酸调PH值为2，上样量为2BV，以2BV/h吸附速度上样，吸附时间3h，用8BV蒸馏水洗脱树脂，依次用6BV30%乙醇、6BV50%乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/h，收集乙醇洗脱液，0.4MPa、70°C条件下减压浓缩。
[0038]d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中，冷冻罐中的初始温度为_5°C，然后在4h内降至-60°C ;将冷冻后的冻干物升温至10°C，保持lh。取所得粉末即为有效部位。
[0039]该有效部位为Sg，得率为27%。经含量测定，含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10^^0.80^^35?^按以下色谱条件检查，色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
[0040]色谱柱:AgilentTC-C18 ⑵(4.6mmX 250mm，5 μ m);流动相为 0.1 % 三氟乙酸(A):甲醇(B)，梯度洗脱:0~IOmin甲醇由5%升为20%，10~25min甲醇由20%升为45%, 25~35min甲醇由45%升为65%，35~40min甲醇保持65% ;流速lmL/min ;柱温30 0C ;检测波长370nm ;进样量10 μ L。[0041]实施例2:与实施I的区别在于:步骤a)中将石榴皮30g粉碎后按料液重量体积比I: 100加入3000ml80%乙醇作为提取溶剂，70°C浸提lOOmin，滤过。
[0042]所得有效部位为8.lg，得率为27%。经含量测定，含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10%、0.按实施例1色谱条件检查，色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
[0043]实施例3:通过以下步骤:
[0044]a)将石榴皮30g粉碎后过40目筛，按料液重量体积比1: 10加入300ml30%乙醇作为提取溶剂，10°c浸提15min，滤过。
[0045]b)将步骤a)制备的提取液0.4MPa、50°C条件下减压浓缩至每ImL含生药IOmg混悬液。
[0046]c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD500型大孔吸附树脂，上样溶液经1.2mol/L盐酸调PH值为2，上样量为2BV，以lBV/h吸附速度上样，吸附时间3h，用6BV蒸馏水洗脱树脂，依次用6BV30%乙醇、3BV50%乙醇洗脱树脂，洗脱速度为lBV/h，收集乙醇洗脱液，0.4MPa、50°C条件下减压浓缩。
[0047]d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中，冷冻罐中的初始温度为_5°C，然后在4h内降至-30°C ;将冷冻后的冻干物升温至10°C，保持lh。取所得粉末即为有效部位。
[0048]该有效部位为9g，得率为30%。经含量测定，含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的52%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的11^^0.80^^37?^按实施例1色谱条件检查，色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
[0049]实施例4:通过以下步骤:
[0050]a)将石榴皮30g粉碎后过60目筛，按料液重量体积比1: 16加入480ml50%乙醇作为提取溶剂，30°C浸提45min，滤过。
[0051]b)将步骤a)制备的提取液0.6MPa、60°C条件下减压浓缩至每ImL含生药20mg混悬液。
[0052]c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD500型大孔吸附树脂，上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为3.0，上样量为2BV，以2BV/h吸附速度上样，吸附时间9h，用7BV蒸馏水洗脱树脂，依次8BV30%乙醇、5BV50 %乙醇洗脱树脂，洗脱速度为3BV/h，收集乙醇洗脱液，
0.6MPa、65°C条件下减压浓缩。
[0053]d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中，冷冻罐中的初始温度为_6°C，然后在4.5h内降至_40°C ;将冷冻后的冻干物升温至15°C，保持2.5h。
[0054]得有效部位9.lg，得率为30.3 %。经含量测定，含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的62%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的17^^0.93^^44?^按实施例1色谱条件检查，色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
[0055]实施例5:通过以下步骤:
[0056]a)将石榴皮30g粉碎后过80目筛，按料液重量体积比1: 24加入720ml60%乙醇作为提取溶剂，40°C浸提60min，滤过。[0057]b)将步骤a)制备的提取液0.8MPa、70°C条件下减压浓缩至每ImL含生药30mg混悬液。
[0058]c)将步骤b)制备的浓缩液加入HPD100型大孔吸附树脂，上样溶液经1.2mol/L盐酸调PH值为3.5，上样量为2BV，以2BV/h吸附速度上样，吸附时间12h，用8BV蒸馏水洗脱树脂，依次用12BV30%乙醇、6BV50%乙醇洗脱树脂，洗脱速度为4BV/h，洗收集乙醇洗脱液，0.8MPa、70°C条件下减压浓缩。
[0059]d)将c)浓缩液放入真空冷冻罐中，冷冻罐中的初始温度为-10°C，然后在5h内降至-60°C ;将冷冻后的冻干物升温至20°C，保持3h。
[0060]得有效部位9.0g，得率为30%。经含量测定，含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的58%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的12%、0.按实施例1色谱条件检查，色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
[0061]实施例6:与实施例4的区别在于:石榴皮采取石榴科植物石榴Punica granatumL.的干燥果皮；步骤c)中8BV30%乙醇、5BV50%乙醇的洗脱以6BV50%乙醇代替。
[0062]得有效部位9.lg，得率为30.3 %。经含量测定，含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的80%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的25%、1.按实施例1色谱条件检查，色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
[0063]实施例7:与实施例6的区别在于:步骤c)中6BV50%乙醇以12BV50%乙醇代替。
[0064]得有效部位9.0g，得率为30%。经含量测定，含多酚类成分重量之和占有效部位总重量的79%，且多酚类成分中鞣花酸、`没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的25%、1.按实施例1色谱条件检查，色谱行为符合图3所示石榴皮多酚有效部位HPLC指纹图谱。
[0065]下面通过实验例进一步说明本发明的石榴皮多酚有效部位的有益效果:
[0066]实验例:本发明的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的毒性、药性实验如下:
[0067]1.石榴皮多酚有效部位的抗肿瘤活性的试验研究
[0068]1.1药物溶液的配制:等量取以上实施例1~7所得石榴皮多酚有效部位，混合均匀后采用灭活培养基溶解。阴性对照为正常培养基溶液。
[0069]1.2MTT 液配制:250g MTT+50ml D-hank，s — 5mg/ml MTT 液
[0070]1.3方法与结果:
[0071](I)用MTT比色法测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用:
[0072]取对数生长期人源性肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单层培养细胞，用含10 %新生牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，调节细胞浓度为5 X IO4个/ml接种于96孔培养板中，每孔体积200 μ I。将培养板放入CO2孵箱，在37°C、5% CO2及饱和湿度条件下培养24h。待大部分细胞贴壁后，药物处理组加入不同浓度样品液，空白对照组加无药血清，每组均设6个样本孔。继续培养。72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20μ 1,37°C继续孵育4小时；终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μ I DMS0，振荡lOmin，使甲臢充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果，按照以下公式计算细胞增殖抑制率。结果见表1。[0073]
【权利要求】
1.石榴皮抗肿瘤多酚有效部位，其特征在于:所述石榴皮抗肿瘤多酚有效部位由石榴皮乙醇提取物经大孔树脂分离纯化得到，其中，多酚类成分重量之和占有效部位总重量的50~80%，且多酚类成分中鞣花酸、没食子酸、安石榴苷的重量分别占有效部位总重量的10 ~25%、0.80 ~1.2%、35 ~53%。
2.根据权利要求1所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位，其特征在于:所述石榴皮乙醇提取物为石榴皮粉碎后过40~80目筛，按料液重量体积比1: 10~1: 24加入浓度为30~60%乙醇作为提取溶剂，10~40°C浸提15~60min，滤过所得的提取物。
3.根据权利要求1或2所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法，依次包括以下步骤: a)将石榴皮乙醇提取物滤过得提取液； b)将提取液在0.4~0.8MPa、50~70°C条件下减压浓缩至每ImL含石榴皮药材10~30mg的浓缩液； c)将步骤b)制备的浓缩液加入大孔吸附树脂，上样溶液经1.2mol/L盐酸调pH值为2~3.5，上样量为2BV，以I~2BV/h吸附速度上样，吸附时间3~12h，用6~8BV蒸馏水洗脱树脂后，依次用6~12BV30%乙醇、3~6BV50%乙醇洗脱树脂，洗脱速度为I~4BV/h，收集乙醇洗脱液，0.4~0.8MPa、50~70°C条件下减压浓缩； d)将步骤c)制备的浓缩液放入真空冷冻罐中，冷冻罐中的初始温度为-5~-10°C，然后在4~5h内降至-30~-60°C ;将冷冻后的冻干物升温至10~20°C，保持I~3h，所得粉末即为该石榴皮抗肿瘤多酚有效部位。
4.根据权利要求3所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法，其特征在于:所述步骤c)中所用6~12BV30%乙`醇、3~6BV50%乙醇以6~12BV50%乙醇代替。
5.根据权利要求3所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位的制备方法，其特征在于:所述的石槽皮为石槽科植物石槽Punica granatum L.的干燥果皮。
6.根据权利要求1或2所述的石榴皮抗肿瘤多酚有效部位在制备辅助治疗和/或预防肿瘤药物制剂中的应用。
【文档编号】A61K131/00GK103505480SQ201210206095
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2012年6月21日
【发明者】高晓黎, 马桂芝, 常占英, 姜靖, 丁楠, 王春梅 申请人:新疆医科大学