专利名称：一种双价dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种双价DNA疫苗及其制备方法，涉及动物医药生物工程研究领域。
背景技术：
草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)作为水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株，是中国分离鉴定的第一株鱼类病毒。该病毒可感染处于鱼种、育苗期的草鱼、青鱼、麦穗鱼、布氏鳌条鱼等，引起出血病，并可导致所感染的鱼死亡。在我国淡水养殖业中曾有因感染GCRV而导致草鱼大批死亡的实例。因此草鱼出血病是严重困扰草鱼等淡水养殖业发展的一种重要疾病。人们虽为防治该病进行了多方面的研究，获得了灭活病毒疫苗制剂，但这种制剂的制备成本昂贵，难以推广。当前的养殖户仍然使用传统的化学农药来预防和治疗草鱼出血病，农药的残留与污染问题严重。随着分子生物学、分子免疫学和基因工程技术的发展，基因工程疫苗越来越受到 人们的关注。特别是DNA疫苗已成为近年发展起来的一个新的研究领域。该疫苗既有减毒疫苗的优点，同时又无逆转的危险，克服了传统疫苗的缺陷，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗，在细菌、病毒、寄生虫等疾病以及肿瘤和过敏反应的防治中显示出巨大的潜力，具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种双价DNA疫苗及其制备方法，本发明方法更方便、免疫效果安全。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种双价DNA疫苗，所述双价DNA疫苗是一个质粒DNA构建物，该构建物包括两种编码草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的质粒DNA序列与一个质粒载体。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，所述两种编码草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的DNA序列包括下述序列中的任意两种具有SEQ. IDNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp6基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段；具有SEQ. 2DNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp7基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段；具有SEQ. 3DNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp5基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段。进一步，所述质粒载体为在质粒pIRES、pcDNA3系统、pTracer_CMV2、pShuttle-CMV、pVAXl、pGEM系统中任一个或几个质粒的基础上利用限制性核酸内切酶剪切或通过PCR扩增后再酶切获得的相应片段拼接而得。进一步，所述限制性核酸内切酶为Hind III、NheI、XhoI、EcoRI、XbaI、NotI、NdeI、MluI、SalI、BamHI、Seal、KpnI、smal、BglII、EcoRV>PvuI、NcoI、PmeI 中的任意一种或几种。本发明还提供了一种双价DNA疫苗的制备方法，技术方案如下I)从NCBI (国立生物技术信息中心)中选取2个草鱼呼肠孤病毒的基因序列，搜索其中的开放阅读框，在AUG上游加入利于高效表达的kozak序列(GCCACC )，根据草鱼基因表达所用的偏爱性密码子情况，对上述2个基因序列中与偏爱性密码子同义的氨基酸用偏爱性密码子替换，并合成替换后的基因序列，将合成的2个基因序列经相应的限制性内切酶酶切后分别插入到相应的质粒中，构建成2个重组DNA分子；2)对I)所构建的2个重组DNA分子分别用相应的限制性内切酶酶切，获得所需要的DNA片段；3)将2)得到的2个DNA片段进行拼接，即得双价DNA疫苗。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，I)中所述草鱼呼肠孤病毒的基因序列包括下述序列中的任意两种具有SEQ. I DNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp6基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段；具有SEQ. 2 DNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp7基因的全序列、全序列基础上的任意改变 序列或其片段；具有SEQ. 3 DNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp5基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段。进一步，1)中所述质粒为在质粒pIRES、pcDNA3系统、pTracer_CMV2、pShuttle-CMV、pVAXl、pGEM系统中任一个或几个质粒的基础上利用限制性核酸内切酶剪切或通过PCR扩增后再酶切获得的相应片段拼接而得。本发明还提供了一种双价DNA疫苗在制备抗草鱼呼肠孤病毒的药物中的应用。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，所述草鱼呼肠孤病毒可感染处于鱼种期的草鱼、青鱼、麦穗鱼、布氏鳌条鱼。开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断。偏爱密码子指由于密码子的简并性，每个氨基酸至少对应I种密码子，最多有6种对应的密码子。不同物种、不同生物体的基因密码子使用存在着很大的差异。各种生物体似乎更偏爱使用某些同义三联密码子，不同的物种利用同义密码中的各密码的几率不同，有些同义密码在该物种中应用的几率高，有些应用的几率低。例子在整个酵母基因组中，所有精氨酸的48%由密码子AGA确定，而其余五种编码精氨酸的同义密码子(CGT，CGC, CGA,CGG，AGG)则以较低的大致相等的频率被使用(每种10%左右)。类似地，果蝇以完全不同的密码子使用偏性编码精氨酸，即比起其它五种选择(每一种的出现频率约为13%)来说，果蝇更倾向于使用密码子CGC (33%)。鱼种鱼苗经过短时间的培养，体长达到3 13cm的幼鱼称为鱼种。本发明的有益效果本发明利用分子生物学和基因工程技术，构建成可在鱼体细胞(如草鱼肾细胞)中同时表达两种抗原蛋白的双价质粒DNA疫苗。该质粒DNA疫苗可在宿主细胞中表达两种不同的抗原蛋白，这些抗原蛋白能够诱导出抗草鱼呼肠孤病毒感染性疾病的保护性免疫反应，刺激机体产生抵抗同一病原的两种不同抗体，其免疫效果不仅优于只产生一种抗体的疫苗，而且比联合疫苗免疫更方便、安全。该质粒DNA疫苗可根据实际情况制备成相应的制剂，并采用适宜方式注入鱼体，如与脂质体、壳聚糖或PEG等混合成复合物，采用注射、电击、基因枪方式将该复合物导入鱼体，能够防止鱼体感染草鱼呼肠孤病毒。
具体实施例方式以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本发明所使用的真核表达载体pcDNA3. I+、pIRES均购自invitrgen公司，宿主大肠杆菌DH5a由本实验室保存。
实施例II.参照NCBI中AF403394. I和AF403396. I序列，优化草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白基因序列并添加酶切位点，委托生工生物工程(上海)有限公司合成vp6和vp7，序列见SEQ. I和 SEQ. 2。2.利用PCR技术扩增vp6和vp7,使vp6和vp7携带有利于在真核细胞中表达的kozak序列和相应的酶切位点。所用引物序列如下V6F TTGCTAGCGCCACCATGGCACAGCGTCAGTTTTTCGGACV6R CTACGCGTTTAGACGAACATCGCCTGCGCTAATGV7S TTTCCCGGGCCACCATGCCTCTCCACATGATTCV7H GGTCTGAGTTAGTGATGGTGGTGATGGTGATCGGATGG3.用EcoR I/Sma I对pIRES质粒进行酶切，获得IRES片段。4.将2中所获得的vp6片段用限制性内切酶Nhe I和Mlu I进行酶切，将所获得的vp6酶切片段插入到用同样酶切后的pcDNA3. 1+中，获得pcDNV6质粒；同时，将2中所获得的vp7序列用限制性内切酶Sma I和Xba I进行酶切，获得vp7的酶切片段。5.对4所构建的重组质粒pcDNV6用EcoR I和Xba I进行酶切，将所获得的酶切质粒与3中所获得的IRES片段及4中所获得的vp7酶切片段连接，获得pcDV6-IR-V7质粒。7.将 pcDV6_IR_V7 质粒与 Lipofectamine2000 (Invitrogen)充分混合后加入到长有CIK细胞的培养皿中，孵育，同时进行相应的对照实验。8.分别于48h、72h、96h及120h收集所培养的细胞，经细胞破碎后，检测表达VP6和VP7的有效性，从而证实pcDV6-IR-V7能在鱼体细胞中表达。9.将所获得的pcDV6-IR-V7质粒与适量的辅助剂(佐剂)混合，以10 50 (所含DNA的量为0. I lug/yl)对鱼背鳍或腹部肌肉注射，在鱼体内表达出抗原蛋白，产生保护性免疫反应。实施例2I.参照NCBI中AF403394. I和AF239175. I序列，优化草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白基因序列并添加酶切位点，委托生工生物工程(上海)有限公司合成vp6和vp5，序列见SEQ. I和 SEQ. 3。2.利用PCR技术扩增vp6和vp5,使vp6和vp5携带有利于在真核细胞中表达的kozak序列和相应的酶切位点。所用引物序列如下V6F TTGCTAGCGCCACCATGGCACAGCGTCAGTTTTTCGGACV6R CTACGCGTTTAGACGAACATCGCCTGCGCTAATG
V5F TTCCCGGGCCACCATGTGGAACGTTCAAACV5R GGTCTGAGTTACTTGCCGGGCCACAAGTTCCCTATC3.用EcoR I/Sma I对pIRES质粒进行酶切，获得IRES片段。4.将2中所获得的vp6片段用限制性内切酶Nhe I和Mlu I进行酶切，将所获得的vp6酶切片段插入到用同样酶切后的pcDNA3. 1+中，获得pcDNV6质粒；同时，将2中所获得的vp5序列用限制性内切酶Sma I和Xba I进行酶切，获得vp5的酶切片段。5.对4所构建的重组质粒pcDNV6用EcoR I和Xba I进行酶切，将所获得的酶切质粒与3中所获得的IRES片段及4中所获得的vp5酶切片段连接，获得pcDV6-IR-V5质粒。7.将 pcDV6_IR_V5 质粒与 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)充分混合后加入到长有CIK细胞的培养皿中，孵育，同时进行相应的对照实验。8.分别于48h、72h、96h及120h收集所培养的细胞，经细胞破碎后，检测表达VP6和VP5的有效性，从而证实pcDV6-IR-V5能在鱼体细胞中表达。9.将所获得的pcDV6-IR-V5质粒与适量的辅助剂(佐剂)混合，以10 50 U I (所含DNA的量为0. I lug/u I)对鱼背鳍或腹部肌肉注射，在鱼体内表达出抗原蛋白，产生保护性免疫反应。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 序列表SEQ. l(1261bp)ttgctagcgc caccatggcg cagcgccagt tcttcggcct cacctacaac ttctacggcc 60agcccgcccc gctcttcgac ctcaacgacc tgcaggagct cgccggctgc tacgcgcgcc 120cgtggaccag ccggttcagc cacctcgcca tctccactgg ttctcttcca gtctggtcag 180cccgataccc cagtgttgca tcacgcaaca tcgttgtcaa tactttgctt ggtgcccatc 240tcaatccgtt tgccggtggc caaatcacta gccatcaagg tatcacttgg cgcgacccgg 300tcctctcctc gctcgcgccg gtcccggcca tccagccgcc cccggtctgg gcggtcgccg 360agaacgtgct cctcgactcg aacaactacc ccacgtacgt cctcaacctc tcgagcatgt 420ggcccatcaa ccaggacgtg cacatcatga ccatgtgggc gctctcggat cagggcccga 480tctaccacct ggaggtgccg gtggacccga tgcccgccgc gaccacggcc gcgctgatgg 540cgtacaccgg cgtgccgatc gcgcacctcg cgcagaccgc ctaccgcttc gccggccagc 660tcggctccct gaccggccgc ctcaaccgct ctcgcacttg caacggattc tacttcgaat 720ttgcgaagcc agcgctcaat ccagatcaag ccgtgcttaa gtggaacgat ggtgccagag 780ctgccccccc tgccgccgcc caatcatctt acattcgatg catttcccct cattggcagc 840accaaatcgt agaagtggca ggcgccttga tgtcccagtc ggtcaccgcc gtaacgggcc 900tccccgccct catagatgag gccaccctcc ccgcttggag tcaaggcgtt gctaacttga 960ccggtaatgg ccaaggcgtg gtgccctgcc tcgactacaa ccccgtgccg atggccgcgg 1020cccggcacct gcagtggcgc caggacggcc tcatcaccgc cgcccaggag gcgcagctca 1080acaacgacta caccgcgtac gcgctcacca tcgagcggca cctgaccgcc atgctcgtcg 1140ccaaccccat cgccgccggc cggatgccga tccagccctt caacgccgcg gacttcggcc 1200aggccggcca gacggcggcc gcggtcgccc tcgcgcaggc gatgttcgtc taaacgcgta 1260
g1261SEQ. 2(871bp)tttcccgggc caccatgcct ctccacatga ttccgcaggt cgcccacgct atggtccgtg60cagccgctgc aggacgcctt accctgtaca caagaactag aactgagacc accaactttg 120
atcacgctga gtacgtcacc tgcggtcgct acaccatctg cgccttctgc cttacgactc180tggctcccca cgccaacgtc aagaccattc aggactccca cgcttgctcc cgtcaaccaa 240acgaagccat tcgctcactc gtcgaagtga gtgacaaagc gcagaccgcc ctcgtcggta 300gccgtactgt cgactatcac gaattggatg tgaaggctgg gttcgtcgcc ccaactgccg 360atgaaacaat cgccccctct aaggatatcg tcgaacttcc gtttcgcacc tgtgacttgg 420acgattcctc tgctaccgc ttgcgtccgaa accactgcca ggccggtcac gacggcgtta 480tccacctccc gatcctttct ggagatttca agttgcctaa cgagcatccc accaagccgc540tggacgatac gcatccccac gacaaggtgc tgactcgctg ccccaagact ggtctcctcc600tcgtccatga cactcacgcc cacgccaccg ccgtcgttgc caccgctgct acgagagcta 660tcctcatgca cgacctcctg acatccgcga acgcggacga cggccatcag gcacgttccg 720cttgctacgg tccagcgttc aacaacctga ccttcgcttg ccactccacc tgtgcttcag 780acatggctca cttcgactgc ggccagatcg ttggactcga cttgcatgtg gagccatccg 840atcaccatca ccaccatcac taactcagac c871SEQ. 3(1969bp)tttcccgggc caccatgtgg aacgttcaaa cctccgtcaa cacttacaat attactgggg 60atggtaattc atttaccccc acctctgaca tgacatccac cgccgccccg gccattgacc120tcaaacctgg ggttctcaat cctaccggta agctatggcg acccgtcggt acctctgttg 180ctaccatcga ctcacttgcc atcgttagcg atcgttttgg tcagtattca tttgtcaatg 240aaggcatgcg agagaccttt tcaaaagcgc tcttcgacat caacatgtgg caacctttat300tccaagcgac aaagactggc tgcggaccga ttgtactctc ctccttcaca accaccacct360ccggttatgt tggcgccact gccggtgatg cccttgacaa ccctgtaacg aatggcgttt420tcatcagtac tgtgcaaatc atgaaccttc agcggaccat cgctgcccgc atgcgtgacg 480tcgctctctg gcagaaacac ttagacaccg ccatgaccat gctaacacct gacatttctg 540ccggtagcgc ctcctgcaac tggaagagct tgctcgcttt tgcgaaggat atcctccccc600tcgacaacct gtgcctcacc tacccaaatg agttctacaa cgttgccatc caccgttatc660ccgcactcaa gcctggtaac ccagacacca agcttcccga tgcccaggct catccgctgg 720gagaagtagc cggtgcgttc aatgccgcca cctctgaagt tgggagtctc gttggttcca 780gctccaccct ctcacaggcc atctccacca tggctggcaa agacctcgat ctaattgaag 840ccgacactcc gctccccgtg agcgtattta ctccatctct cgcccctcgt tcttatcgac900ccgccttcat taaacctgag gatgctaagt ggatcgcgga attcaataac tcatccctca 960tacgtaagac tcttacctac tcgggtgcaa cttacaccgt tcaactcggc cctggtccaa 1020ctcgcgtcat tgatatgaat gcgatgatcg actccgtgtt gaccctggat gtgagcggta 1080ccatcctccc atatgacaca agccctgatc tgtctacttc agtcccggct ttcgtcctca 1140tccagacctc agtaccaatt caacaagtca ctaccgctgc taacatcaca gccatcaccg 1200tcgtatccgc cgctggcgct tccgccatca atctcgctat caatgtacgc ggccagcccc1260
gcttcaacat gctccacctg caagccacct ttgagcgcga gacaatcacc gggatcccgt1320atatctatgg cttgggcaca ttcctcatcc catcacccac atcctcctcc aatttctcca1380accccacgct gatggacggc cttctcactg tcacccccgt actgctacgt gagacgacat1440acaagggcga agtcgttgac gctatcgtac cagctaccgt catggccaac caaacgtctg1500aggaggtcgc ctctgcctta gccaacgacg cgatcgtgtt agtgtcgaat catctcaaca1560agttggccaa tgtcgtagga gacgcgattc ccgtcgcctc aaaaacggat gattccgcga1620ctagcgccat cgtcagtcga ctcgccgtcc agcacaagct gtcacaggta ggccaagcct1680
cacccactcc ccccgattat ccacttctgt ggcgccgtgc caagcgtgcc gcgtctatgt1740tcgtctccaa cccctccctg gccttgcagg taggtatccc tgtgttaact caatcgggta1800tgctttccgc cctaacgtct ggcgtaggca cggctttacg tactggtagc ttgggcaaag1860gtgtaaccga tgcgtcagaa aaactacgtg cacgtcagag tttgacggtt gcgaagcaag1920cgttcttcga ccagataggg aacttgtggc ccggcaagta actcagacc1969
权利要求
1.一种双价DNA疫苗，其特征在于，所述双价DNA疫苗是一种质粒DNA构建物，该构建物包括两种编码草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的质粒DNA序列和一个质粒载体。
2.根据权利要求I所述的双价DNA疫苗，其特征在于，所述两种编码草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的DNA序列包括下述序列中的任意两种具有SEQ. IDNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp6基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段；具有SEQ. 2DNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp7基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段；具有SEQ. 3DNA序列的草鱼呼肠孤病毒vp5基因的全序列、全序列基础上的任意改变序列或其片段。
3.根据权利要求I所述的双价DNA疫苗，其特征在于，所述质粒载体为在质粒pIRES、pcDNA3系统、pTracer-CMV2、pShuttle_CMV、pVAXl、pGEM系统中任一个或几个质粒的基础上利用限制性核酸内切酶剪切或通过PCR扩增后再酶切获得的相应片段拼接而得。
4.根据权利要求3所述的双价DNA疫苗，其特征在于，所述限制性核酸内切酶为Hind III、NheI、XhoI、EcoRI、XbaI、NotI、NdeI、MluI、SalI、BamHI、Seal、KpnI、smaI、Bgl II、EcoRV> PvuI、NcoI、PmeI中的任意一种或几种。
5.一种双价DNA疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下 1)从NCBI中选取2个草鱼呼肠孤病毒的基因序列，搜索其中的开放阅读框，在AUG上游加入利于高效表达的kozak序列(GCCACC)，根据草鱼基因表达所用的偏爱性密码子情况，对上述2个基因序列中与偏爱性密码子同义的氨基酸用偏爱性密码子替换，并合成替换后的基因序列，将合成的2个基因序列经相应的限制性内切酶酶切后分别插入到相应的质粒中，构建成2个重组DNA分子； 2)对I)所构建的2个重组DNA分子分别用相应的限制性内切酶酶切，获得所需要的DNA片段； 3)将2)得到的2个DNA片段进行拼接，即得双价DNA疫苗。
6.一种双价DNA疫苗在制备抗草鱼呼肠孤病毒的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的双价DNA疫苗的应用，其特征在于，所述草鱼呼肠孤病毒可感染处于鱼种期的草鱼、青鱼、麦穗鱼、布氏鳌条鱼。
全文摘要
本发明涉及一种双价DNA疫苗及其制备方法，本发明双价DNA疫苗是一种质粒DNA构建物，该构建物包括两种编码草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的质粒DNA序列和一个质粒载体。本发明双价DNA疫苗可在宿主细胞中表达两种不同的抗原蛋白，这些抗原蛋白能够诱导出抗草鱼呼肠孤病毒感染性疾病的保护性免疫反应，刺激机体产生抵抗同一病原的两种不同抗体，其免疫效果不仅优于只产生一种抗体的疫苗，而且比联合疫苗免疫更方便、安全。
文档编号A61P31/14GK102755652SQ20121022996
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者张莉, 王晓洁, 肖波, 迟晓艳 申请人:鲁东大学