多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用，其是含有血清型6A和至少一种选自下组的额外血清型的肺炎链球菌荚膜多糖的组合物；其中，所述额外血清型为1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F。本发明的多价肺炎球菌荚膜多糖组合物能诱导机体产生体液免疫，对由上述24种最常见血清型肺炎球菌引起的感染性疾病能产生较好的保护效果，免疫覆盖率广，效果优于市面上已有的各类肺炎球菌多糖疫苗和结合疫苗。
【专利说明】多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用
【技术领域】[0001]本发明属于微生物学及免疫学领域，具体地说，涉及一种多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae),简称肺炎球菌(pneumococcus), 1881年首次由法国人巴斯德(Louis Pasteur)及美国人G.M.Sternberg分别从患者痰液中分离出。该菌为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株在其菌体外形成荚膜多糖。肺炎球菌是细菌感染性疾病的主要病原菌之一，可引起肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病，59TlO%健康成年人以及209^40%儿童的鼻咽等呼吸道中携带此菌，有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。据联合国统计，每年有超过一百万两岁以下儿童死于肺炎球菌引起的疾病。在我国，由肺炎球菌引起的菌血症的死亡率约为259^29%。肺炎链球菌寄居在人类上呼吸道内，通过飞沫传播。不同人群均可被肺炎链球菌感染，但以下3类人群特别容易受到侵袭:65岁以上的人群，5岁以下儿童，特别是2岁以下的幼童，高危族，如长期病患者等。当前由于肺炎球菌对抗菌药物的抗药性增加，以及抗药菌株在世界范围的传播，因此除使用疫苗预防外，尚无其他有效的公共干预措施。
[0003]肺炎链球菌具有几种致病因子，包括多糖荚膜，能帮助入侵寄主的免疫系统。已经发现的肺炎链球菌有90多个血清型，肺炎球菌多糖抗原是非T细胞依赖性抗原，初次免疫能诱导产生保护水平的抗体，再次免疫不能诱导产生免疫记忆；并且该疫苗对2岁以下的儿童不能引起有效的保护性抗体应答，而该年龄段人群是肺炎球菌感染的高危人群。
[0004]1880年美国Steinberg和法国Pasteur最先分离出肺炎球菌,并于1882年的实验中指出通过疫苗预防肺炎球菌感染的可能性。1914年，全菌体疫苗首次得以使用，但因副反应强、效果差，其安全性和有效性受到广泛质疑，之后逐渐被淘汰。1927年，Sehiemann等证明了肺炎球菌荚膜多糖对人的免疫原性，并开始了对肺炎球菌多糖疫苗的研究。
[0005]目前我国仅有7价肺炎球菌结合疫苗，如沛儿⑩被批准上市，针对2~23个月大的婴儿或2飞岁有存在风险的孩童进行被动免疫，保护孩童免受肺炎链球菌的深层感染，如败血病及脑膜炎；仅能保护7个价次，保护范围有限，而23价肺炎球菌多糖疫苗(如“纽莫法?'”)可以对85%的55岁以上的人群提供长达五年的保护，由于上述血清型组合主要针对欧美发达国家流行情况而设计，对亚洲特有的血清型缺乏保护。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种多价肺炎球菌荚膜多糖组合物、其制备方法及应用。
[0007]本发明的另一目的是提供一种含有上述组合物的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗。
[0008]为了实现本发明目的，本发明的一种多价肺炎球菌荚膜多糖组合物，其为含有肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6A和至少一种选自下组的额外血清型的荚膜多糖的组合物；其中，所述额外血清型为1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
[0009]优选地，所述多价肺炎球菌荚膜多糖组合物为含有血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、
8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎链球菌的荚膜
多糖的组合物。
[0010]前述多价肺炎球菌荚膜多糖组合物中，不同血清型的荚膜多糖按等质量混合。优选各型荚膜多糖含量为25-7511§/1111，更优选的为5011§/1111。其中，24价肺炎球菌多糖组合物各型多糖的标准物质可购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。
[0011]前述多价肺炎球菌荚膜多糖组合物中，还含有赋形剂，所述赋形剂为氯化钠和磷酸盐缓冲剂等。
[0012]本发明还提供一种制备多价肺炎球菌荚膜多糖组合物的方法:分别对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6A和至少一种选自下组的额外血清型的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各纯化的血清型荚膜多糖混合，任选加入赋形剂，即得多价肺炎球菌荚膜多糖组合物；其中，所述额外血清型为1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
[0013]其中，肺炎链球菌荚膜多糖分离纯化的步骤为:
[0014]I)建立肺炎球菌菌种库，采用肺炎球菌工作种子进行肺炎球菌发酵；
[0015]2)向肺炎球菌发酵液中加入适量的去氧胆酸钠进行杀菌并剥离肺炎球菌荚膜多糖；
[0016]3)对杀菌后的发酵液进行离心，去除菌体，收集离心上清，然后进行超滤浓缩；
[0017]4)向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为259^45%，搅拌后离心去除核酸；
[0018]5)向上清中加入乙醇使其终浓度达到55%~80%，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀；
[0019]6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白质；
[0020]7)向上清中加入乙醇，使其终浓度达到559^80%，离心后收集沉淀，即得纯化的肺炎球菌荚膜多糖。
[0021]还可采用本领域熟知的其它纯化技术，如柱层析、乙醇沉淀、酶切等方法对肺炎链球菌荚膜多糖进行纯化。
[0022]本发明还提供所述多价肺炎球菌荚膜多糖组合物在制备用于预防或治疗肺炎链球菌所致疾病的药物中的应用。
[0023]本发明还提供一种多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗，其含有将上述多价肺炎球菌荚膜多糖组合物与载体蛋白共价连接形成的缀合物，以及任选基于铝的佐剂。所述载体蛋白应为无毒性，且能与肺炎球菌荚膜多糖结合并且能够引起多糖免疫原性显著升高的蛋白，同时易于大量获得。本发明的载体蛋白优选为白喉类毒素或破伤风毒素，更优选为白喉类毒素CRM197。上述蛋白载体的获得，需经过菌体发酵、超滤、纯化、脱毒等步骤，均为本领域常规技术。
[0024]本发明还提供制备所述多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的方法，分别对不同血清型肺炎链球菌的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各血清型荚膜多糖分别与载体蛋白进行共价连接(例如，先将纯化的荚膜多糖化学活化，通过还原胺化法将活化荚膜多糖分别单独结合到载体蛋白上)，形成单价缀合物，将各型单价缀合物分别采用铝佐剂吸附后混合，或各型单价缀合物混合后再采用铝佐剂吸附，即得多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗。所述基于铝的佐剂，如氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，其终浓度为0.25-4.0mg/ml。所述基于铝的佐剂可市售获得，也可以采用本领域常规方法进行制备。
[0025]前述的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗，其可以为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂等。可通过以下方式进行免疫:皮肤、注射(包括皮下注射、肌肉注射、静脉注射)、口服、滴鼻或粘膜喷雾等。
[0026]本发明的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可以用于保护或者治疗由于肺炎球菌感染引发肺炎的病人，疫苗可以通过肌肉、皮下、皮内途径注射或经过粘膜给药，适于接种人和动物。
[0027]本发明是针对我国特有血清型肺炎球菌的流行情况，首次选择了 6A以及1、2、3、
4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F 中至少一
种的血清型组合，从而开发出针对我国特有血清型肺炎球菌的流行情况而设计的多价肺炎球菌荚膜多糖组合物，提供最大限度的保护。
[0028]采用本发明方法制备的多价肺炎球菌荚膜多糖组合物，其稳定性较好。该组合物具有针对上述24种血清型的肺炎球菌侵袭的多重免疫原性和保护性能，血清型覆盖范围更广，理化性质稳定，互无干扰，优于已上市的低价次肺炎组合物，且免疫应答不低于低价次的组合物。接种本发明的多价肺炎球菌荚膜多糖疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，同时可有效预防人及动物因上述24种血清型肺炎球菌所致的疾病，覆盖更加广泛，免疫效果更好。
[0029]本发明的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可以由预防上述24种血清型肺炎球菌所致的侵袭性疾病，更加方便多效，成本更低。上述24种血清型荚膜多糖的生产，均采用发酵后纯化的方式进行制备，具有相似的生产工艺，便于工业化大规模生产，且通过灭活后提纯荚膜多糖，使疫苗具有更高的安全性及良好的免疫原性，同时，所述多价肺炎球菌荚膜多糖组合物吸附完全，理化性质稳定，互无干扰。另外，该多价结合疫苗免疫原性效果远高于同类多价次的多糖类疫苗，可有效激活2岁以下儿童B细胞，从而产生抗体，并激活记忆B细胞，诱发免疫记忆反应，可以起到更好的保护效果。
[0030]动物实验表明，本发明的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可有效诱导机体产生针对上述24种血清型荚膜多糖的高滴度、特异性抗体，体外实验表明，由该多价结合疫苗所诱导的抗体具有明显的反应性与中和活性；特别是组合物中各血清型荚膜多糖的免疫效果不受另一组分的影响与干扰，吸附率大于75%，免疫原性不低于单价缀合物。该多价结合疫苗具有与各血清型单价结合原液相同的免疫原性，组合接种可以在不影响疗效的基础上大大减少接种次数。
【具体实施方式】
[0031]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0032]实施例1肺炎球菌荚膜多糖原液制备
[0033]1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F血清型肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)菌株均来源于中国药品生物制品检定所与丹麦血清研究所(SSI)。将上述菌种进行传代建立原始种子库、主种子库和工作种子库，代次分别为:原始种子批为第I代，主种子批为第4代，工作种子批为第8代。工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过10代。每代种子采用奶粉做冻干保护剂，冻干保藏。取工作种子在大豆蛋白胨固体培养基划线挑取菌种，接种于5ml的液体综合培养基，35°C ±2°C培养后，转种到500ml的培养液后经过培养再扩增至IOL培养液和50L培养液。于对数生长期的后期或静止期的前期中止培养，取样进行纯菌检查，纯菌检查合格后在收获的培养液中加入合适量的无菌的去氧胆酸钠至终浓度为1%杀菌两小时以裂解细菌细胞并释放荚膜多糖。将已杀菌的培养液离心后收集上清液，上清液用100KD截留分子量的超滤膜包超滤浓缩3-10倍。
[0034]用pH7.0左右的磷酸盐缓冲液对超滤液采进行超滤换液，然后加入无水乙醇，使乙醇终浓度为259^45%，充分搅拌后离心去除核酸。
[0035]向上清中加入乙醇使其终浓度达到559^80%，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀。
[0036]加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白。
[0037]向上清中加入乙醇，使其终浓度达到559^80%，离心后收集沉淀，将沉淀采用注射水复溶，经过0.22 iim的无菌滤器除菌过滤后，获得1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和 33F共 24 种纯化血清型的肺炎球菌荚膜多糖。
[0038]实施例2多价肺炎球菌荚膜多糖组合物的制备
[0039]将实施例1中制备的24种肺炎球菌荚膜多糖原液，按照各血清型多糖含量终浓度50ug/ml混合后添加缓冲液(注射水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)定容至终体积，制成24价肺炎球菌多糖组合物。
[0040]将上述制备的24价肺炎球菌荚膜多糖疫苗，采用低温干燥的方式制成冻干剂型，使用前采用注射水、生理盐水或者磷酸盐缓冲`液进行复溶。
[0041]采用免疫浊度法检测冻干后多价肺炎球菌多糖组合物的各型多糖含量，并与冻干前的检测结果进行对比，比较抗原物质的变化。结果见表1。
[0042]表1 24价肺炎球菌多糖疫苗各型多糖含量
【权利要求】
1.多价肺炎球菌荚膜多糖组合物，其特征在于，其为含有肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型6A和至少一种选自下组的额外血清型的荚膜多糖的组合物；其中，所述额外血清型为 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其为含有血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎链球菌的荚膜多糖的组合物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，不同血清型的荚膜多糖按等质量混合。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，各型荚膜多糖含量为25-75y g/ml。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有赋形剂，所述赋形剂为氯化钠和磷酸盐缓冲剂。
6.一种制备多价肺炎球菌荚膜多糖组合物的方法，其特征在于，分别对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型6A和至少一种选自下组的额外血清型的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各纯化的血清型荚膜多糖混合，任选加入赋形剂，即得多价肺炎球菌荚膜多糖组合物；其中，所述额外血清型为1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 或 33F。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，肺炎链球菌荚膜多糖分离纯化的步骤为: 1)建立肺炎球菌菌种库，采用工作种子进行肺炎球菌发酵； 2)向肺炎球菌发酵液中加入适量的去氧胆酸钠进行杀菌并剥离肺炎球菌荚膜多糖； 3)对杀菌后的发酵液进行离心，去除菌体，收集离心上清，然后进行超滤浓缩； 4)向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为259^45%，搅拌后离心去除核酸； 5)向上清中加入乙醇使其终浓度达到559^80%，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀； 6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液体积的苯酚进行抽提，去除蛋白； 7)向上清中加入乙醇，使其终浓度达到559^80%，离心后收集沉淀，即得纯化的肺炎球菌荚膜多糖。
8.权利要求1-5任一项所述组合物在制备用于预防或治疗肺炎链球菌所致疾病的药物中的应用。
9.多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗，其含有将权利要求1-5任一项所述组合物与载体蛋白共价连接形成的缀合物，以及任选基于铝的佐剂。
10.根据权利要求9所述的结合疫苗， 其特征在于，其为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂。
【文档编号】A61K39/385GK103656632SQ201210359369
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月24日 优先权日:2012年9月24日
【发明者】高强, 蔡芳, 王见冬, 孙胜军, 王治伟, 陈磊, 王新立, 阮力, 尹卫东 申请人:北京科兴中维生物技术有限公司