专利名称：一种干涉GDF9基因表达的 siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学以及生物工程技术领域，具体涉及抑制水牛生长分化因子9 (⑶F9)基因表达的SiRNA片段。
背景技术：
RNAi (RNA interference),即RNA干扰，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。RNAi是通过双链RNA诱导与之同源的mRNA降解，导致目标基因转录后缄默的现象或机制。此现象于1998年在对线虫的研究中首次发现。siRNA是进入细胞内的外源dsRNA或内源产生的dsRNA，被Dicer酶切割成为21_23nt长的小分子，这种siRNA是RNAi机制中的关键中间产物，具有非常强的RNAi效应。 RNAi 途径中，RISC (RNA induced silencing complex)的形成发挥了极大的作用。RISC是由小分子RNA(siRNA / miRNA), Dicer, DadR蛋白和Argonaute家族蛋白组成的复合体，其作用是直接造成与复合体中siRNA高度互补的mRNA被降解。RISC作用过程中，mRNA的切割发生在对应的siRNA 5’端10 11位核苷酸间，切割将mRNA —分为二，切割后mRNA从RISC上释放。完成一次切割后，引导siRNA仍然结合在RISC中，继续完成更多轮的切割。生长分化因子9(growth differentiation factor 9 ,GDF9)主要在卵泡中表达，同时在非性腺组织中有表达，能促进始基卵泡的发育，与FSH协同刺激卵泡生长，主要调控卵泡的生长发育和生殖功能。⑶F9基因敲除小鼠因初级卵泡发育受阻，从而影响生殖。而体外给予生物活性的⑶F9可诱导窦前卵泡生长和细胞分泌。以上表明⑶F9对卵泡的生长发育影响是有阶段依耐性。Hanrahan等(2004)发现⑶F9的FecGH突变(G8突变)能显著提高杂合绵羊的排卵率。siRNA作为一种新型的基因工具来抑制特定基因的表达，目前大规模应用于生物细胞、组织和个体，特别是用来制备基因敲低模式动物，从动物整体水平研究基因的功能，siRNA的抑制特定基因的优点是其他基因技术都无法比拟的。而对于水牛生长分化因子9的siRNA还未见研究报道。
发明内容
本发明的目的在于通过下调GDF9基因的部分功能来提高水牛的繁殖率，由于水牛繁殖率普遍较低，本发明提供了一种抑制水牛生长分化因子9(⑶F9)基因表达的siRNA。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种抑制水牛生长分化因子9 (⑶F9)基因表达的siRNA，分别命名为⑶F9-1、⑶F9-2和⑶F9-3，其核苷酸双链中正义链序列如下
⑶F9-1 SEQ ID NO: I ；
⑶F9-2 SEQ ID NO:2 ；
⑶F9-3 SEQ ID NO:3。
所述siRNA与⑶F9基因mRNA反向互补，其长度为19 27bp。含有上述siRNA 的 shRNA。上述shRNA的编码基因，两端带有I和I酶切位点的序列，便于构建表达质粒，双链核苷酸序列如下
⑶F9-ldsDNA :正义链具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；
⑶F9-2dsDNA :正义链具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列；
⑶F9-3dsDNA :正义链具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。一种表达载体，由上述shRNA的编码基因与出发载体构建的，即将shRNA编码基因插入出发载体上构建而成。慢病毒载体可以直接高效率地感染分裂期和非分裂期细胞，且转染效果更加稳定，作为上述出发载体中的优选方案，其中病毒载体最优选pshRNA-copGFP Lentivector。该载体具有完整的shRNA插入位点以及绿色突光蛋白(green fluorescence protein,GFP)报告基因，实现了靶基因shRNA的高效表达、病毒包装以及转基因的直观展示。本发明的siRNA可以制备成基因药物或其他合适的制剂用于下调水牛生长分化因子9的表达，从而提闻水牛的繁殖性能。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的siRNA沉默效果好，能够特异性的下调GDF9基因的表达。通过实时定量Real-time PCR检测发现各干扰片段能使⑶F9 mRNA表达量有的发生100%的抑制现象，ELISA检测⑶F9蛋白表达量也相应降低。发明人构建了含有上述siRNA的编码基因的pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干扰质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，并制备了转基因小鼠模型，结果证明了pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干扰质粒转入细胞后能表达shRNA，并对水牛⑶F9基因进行特异性的抑制，从而在制备用于GDF9下调的生物制剂中有应用价值。
图I. pcDNA3. I (+/_)载体图 2. pPUC19-GDF9 酶切电泳图，M DL15000 makeer, I :空质粒，2 : BanR I 单酶切，3 Bam^ I/ BcoR I 双酶切；
图 3. pcDNA3. I (-)载体酶切图，I -.BatiiA I/ I 双酶切，2 -.BamR I 单酶切，3 :空质粒，M 15000bp make ；
图4.重组质粒pcDNA3. I-⑶F9菌落鉴定电泳图，箭头所指⑶F9基因扩增片段；
图 5. pshRNA-copGFP Lentivector 载体图 6. pshRNA-copGFP Lentivector 载体酶切图，I :空质粒,2 -.BamW I 单酶切，3 -.BanfAI/ I双酶切；
图7.退火产物鉴定电泳图 8.重组质粒 Lv-shRNA 鉴定，1、2 Lv-shRNAl, 3、4 Lv-shRNA2, 5 Lv-shRNA3, M 50bp maker ；
图9.细胞总RNA电泳检验 图10.水牛pcDNA3. I㈠-GDF9及LV_siRNA共转染CHO细胞48h荧光显微镜图(40X)；
图11.慢病毒干扰质粒对水牛⑶F9 mRNA表达水平的影响，其中*表示差异显著Gd< O. 05)；
图12.转染空质粒和慢病毒质粒后CHO细胞裂解液中GDF9蛋白浓度变化，其中*表不差异显者(/* < O. 05)。
具体实施方式
以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。实施例I构建P⑶NA3. I-⑶F9真核表达载体
I.合成水牛生长分化因子9 (⑶F9)序列(GenBank登录号NM_174681)，连接于载体PUC19上，酶切为点为I与BamH。双酶切(&oR I与BamH)和测序证明合成片段正确(见图2)。2.构建pCDNA3. 1-GDF9真核表达质粒
(I)酶切反应
反应体系WcoR I与BamH I双酶切PCR产物。BcoR I与BamH I双酶切pcDNA3. I (-)，酶切体系10 X Buffer K 2 μ UEcoR I I μ L，BamH I I μ L，质粒 6 μ L，蒸馏水 10 μ L，总体积20yL。反应条件37°C作用I. 2h，进行1%琼脂糖凝胶电泳。酶切产物用DNA纯化试剂盒纯化，最后各以30 μ L水洗脱DNA，-20°C保存。(2)连接反应
反应体系线性化pcDNA3. 1(_) 4μ , IOXLigation Buffer 2μ ,Τ4 DNA Ligase μ ,⑶F9目的片段13μ ，总体积为20 μ L。反应条件16°C连接过夜，获得重组pCDNA3. 1-GDF9真核表达质粒。3.重组质粒转化大肠杆菌
筛选步骤2中P⑶NA3. 1-GDF9真核表达质粒的阳性克隆，通用引物(T7和BGH)，序列号分别为SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11 ;扩增有1300bp左右长度的插入片段释放出者视为阳性重组体(见图4)。从上述方法鉴定的阳性克隆中挑选2个克隆，接种于LA培养基中制备新鲜菌液，经测序鉴定插入片段正确，构建PCDNA3. 1-GDF9真核表达载体成功。实施例2构建pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干扰质粒
I.根据水牛生长分化因子9的mRNA序列设计方法和原则筛选出靶序列，设计siRNA，与水牛生长分化因子9基因mRNA反向互补，分别命名为⑶F9-1、⑶F9-2、⑶F9-3，其正义链序列如下
⑶F9-1 SEQ ID NO: I ；
⑶F9-2 SEQ ID NO:2 ；
⑶F9-3 SEQ ID NO:3。2.再根据siRNA靶序列设计构建抑制水牛生长分化因子9基因表达的siRNA载体所需的DNA序列⑶F9 shRNA模板，两端引入I和I酶切位点，送上海生物工程技术服务有限公司合成。具体序列如下(F表示正义链，R表示反义链)
⑶F9-lshRNA F SEQ ID NO:4 ；
⑶F9-lshRNA R SEQ ID NO:5 ；
⑶F9-2shRNA F SEQ ID NO:6 ；
⑶F9-2shRNA R SEQ ID NO:7 ；
⑶F9-3shRNA F SEQ ID NO:8 ；
⑶F9-3shRNA R SEQ ID NO:9。3.将合成好的上述寡核苷酸序列溶解并稀释至浓度为I μ g/μ L，将上述6条序 列分成 3 对，其中⑶F9-lshRNA F 和⑶F9_lshRNA R 为 I 对，⑶F9_2shRNA F 和⑶F9_2shRNAR为I对，⑶F9-3shRNA F和⑶F9_3shRNA R为I对。3对序列分别进行退火反应。退火反应体系如下DNA模板单链I (⑶F9-lshRNA F)1 μ I,DNA模板单链2 (⑶F9_lshRNA R)1 μ 1，IOX退火溶液I μ 1，ddH20 17 μ I。反应条件混匀，95°C加热IOmin ;室温静置过夜；稀释至终浓度 IOng/μ I。-20°C备用。⑶F9-2shRNA F 和⑶F9_2shRNA R，以及⑶F9_3shRNA F和⑶F9-3shRNA R的退火反应体系同上，DNA模板单链替换成相应核苷酸序列即可。4. LV-shRNA-GFP 空质粒载体(即 pshRNA-copGFP Lentivector 空质粒,见图 6)酶切，酶切体系如下:汉·H I I μ I,BcoR I I μ 1，10XBuffer K 2 μ I，LV-shRNA-GFP空质粒6 μ I, ddH20 10 μ I。37°C作用lh，进行I %琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图6。Omega凝胶片断回收纯化试剂盒回收载体片段。将步骤3所得的退火产物与酶切质粒载体连接，连接体系如下双酶切质粒LV-ShRNA-GFP (O. I μ g/μ I) I μ I，退火产物 I μ 1，Τ4 DNA Ligase Buffer 2 μ 1，T4 DNALigase I μ l，ddH20 15 μ I。充分混匀，16 1水浴连接，反应过夜。5.转化与阳性克隆的PCR鉴定转化连接产物，挑取单个菌落，接种到LA液体培养基中，37°C恒温振荡培养3h。PCR鉴定阳性克隆，采用引物设计软件Primer 5设计引物，其中上游引物序列为SEQ ID NO: 12，下游引物序列为SEQ ID NO: 13，由上海生物工程技术服务有限公司合成。扩增包括插入目的基因的DNA片段。PCR扩增片段为156bp，反应采用50μ 反应体系。体系的组成为=IOXPCR缓冲液5PL，2. 5mM dNTP 4μ ，上游引物(10pmol/>L) μ ，下游引物(10pmol/>L) μ ，步骤 5 中转化后的菌液3PL，Taq DNA聚合酶(5U/^L) 0. 3μ ,补加ddH20至50μ 。按以下条件进行PCR反应-MV，5min ；94°C，30sec ；60°C，30sec ；72°C, 30sec，共 35 个循环；72°C, IOmin 延伸后结束反应。分别取5PL PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳，检查目的基因的扩增效果，电泳结果见图8。6.阳性克隆测序挑选阳性克隆菌液测序(由Invitrogen公司进行3730型测序仪进行测序分析)。利用生物分析软件DNAMAN进行同源性分析。构建成功的三种慢病毒干扰质粒分别命名为LV-siRNA I、LV-siRNA II和LV_siRNA III (LV_siRNA是对于用pshRNA-copGFP Lentivector构建的干扰质粒的简称,里面插入了 RNA干扰的dsDNA的序列)。实施例3 RNA干扰有效靶点的筛选 I.三种慢病毒干扰质粒转染真核细胞
将 pcDNA3. 1-GDF9 分别和 LV-siRNA I ,LV-siRNA II 和 LV-siRNA III共转染入 CHO 细胞进行表达。设pcDNA3. I-⑶F9和LV-shRNA-GFP空质粒共转染CHO细胞作为对照，目的为与处理组转染背景一致，每个处理设6个重复。其中pcDNA3. I-⑶F9与慢病毒干扰质粒的比例为1:1。脂质体转染，按照Polyfect (购自QIAGEN公司)试剂说明书进行。(I)转染前一天，在新六孔板培养皿中接种细胞，完全吹散细胞以保证细胞均匀的分布。当转染时细胞最好铺满培养皿的40-90%。(2)将pcDNA3. I-⑶F9和慢病毒干扰质粒按I: I共4ug，加RPMI-1640培养基补至IOOul,温柔地上下颠倒混匀6-8次,室温孵育5min ；
(3)取IOul的Polyfect加入到IOOul DNA/RPMI-1640培养基中温柔地上下颠倒混匀6-8次,室温孵育lOmin。
(4)在第3步孵育形成转染混合物的同时，用不含血清和抗生素的RPMI-1640洗细胞一次，然后加入I. 5mL含10%血清和1%抗生素的RPMI-1640完全培养基。(5)将第3步中产生的DNA/ RPMI-1640试剂混合物逐滴加入第4步中处理的六孔板培养皿中，轻轻地将混合物和培养基混匀，C02培养箱中37°C培养48小时，荧光倒置显微镜观察转染效率，部分细胞用Trizol收集，_70°C保存，用于RNA提取。2.转染细胞总RNA提取
采用Invitrogen公司TRIzol Reagent提取转染细胞总RNA。所用器材均经O. 1%DEPC水浸泡过夜，高压灭菌后在鼓风干烤箱中烤干，操作过程均在超净台中进行。具体操作步骤如下
(1)在六孔板中立刻加入ImlTrizol/孔,裂解5min后转移到RNase-free的I. 5ml的离心管中；
(2)每管加入200ul氯仿；
(3)旋润振荡器上混勻2min,室温静置lOmin,4°C 12000rpm离心15min ；
(4)离心后分三层，吸取上层清液(小心尽量不要吸到中层蛋白)到新的离心管中，力口入等体积的异戊醇；
(5)混勻，-20°C静置沉淀40min, 4°C 12000rpm 离心 15min ；
(6)离心后可见白色沉淀于管底，小心弃掉上清，加入500ul75%乙醇，4°C，7500rpm离心 5min ；
(7)弃去乙醇后再洗涤一次，干燥，加入适量RNase-free水溶解；
(8)RNA定量取IulRNA样品，加入99ul无RNA酶水中，混匀，稀释100倍，用无RNA酶水做空白对照，于核酸蛋白分析仪中测OD值，RNA浓度；
(9)RNA电泳检测取Iul样品上样，电压90V，跑30min，照胶。为了防止质粒DNA的污染，提取的RNA用无RNase的DNA酶消化(IOXbuffer2yL，DNA酶O. luL，17.9yL RNA，反应总体系20uL，37°C，lh)。然后按加入酚一氯仿抽提，去除DNA酶，异丙醇沉淀，最后用O. P/oDEPC水溶解。I %琼脂糖凝胶电泳，结果拍照。(见图9)。3. Real time-PCR检测细胞内⑶F9的表达丰度
GDF9的引物如下，GDF9上游引物SEQ ID NO: 14，下游引物SEQ ID NO: 15, PCR扩增片段为151bp。同体系设仓鼠β-actin基因为内参(β-actin上游引物SEQ ID N0:16，下游引物SEQ ID NO: 17)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增片段为428bp。以提取的总RNA为模板，以Oligo-dT为引物(工作浓度为IOpmol/μ L)进行RT反应。取总RNA 10μ L，65°C水浴lOmin，加Oligo-dT引物1μ L，70°C预变性5min，立即冰浴 5min ;在冰浴状态下加入 5 X AMV 缓冲液 6 μ L, Rnasin O. 4 μ L(40U, Promega)，dNTP
I.5μ L, AMV O. 2μ L(8U, Promega)，用水补足至总体积 30μ L，混匀后于 42°C反应 Ih,80°C灭活5min。所有反转录产物用IXTE稀释4倍，_20°C保存备用。以RT反应产物为模板，进行PCR反应(⑶F9扩增片段151bp ； β -actin扩增片段428bp)，体系的组成为10\ 0 缓冲液541^，2· 5mM dNTP 4μ ，上、下游引物(10pmol/>L)各1KL，模板2PL，Taq DNA聚合酶(5U/^L)0. 3μ ，补加ddH20至50μ 。反应条件95°C预变性5min ；95°C 30sec,56°C 30sec，72°C，30sec，35 个循环；72°C 延伸 lOmin。。
首先在荧光定量PCR专用96孔PCR板(置于冰上)的每个孔里分别加入 μ 模板(样本的RT产物或系列标准品)，然后加入19μ1预混溶液(包括10μ1 Realtime PCRMaster Mix、l. 2 μΙΙΟμΜ引物、7. 8μ1灭菌双蒸水)，总反应体系为20μ1。用小心将荧光定量PCR专用的96孔PCR板封口膜(ABgene公司，英国)覆盖在PCR板上，压紧，保证每个孔不透气，短暂离心。每个处理设3个重复，并在每块板上同时设阴性对照(以水为模板)。按ΑΒΙ7500型荧光定量PCR仪的操作说明放入96孔PCR板，设置PCR反应条件为95 °C /lmin预变性；95°C /15s变性，56°C /15s退火，72°C延伸40s，循环40圈。在确认目的基因与内参照β-actin基因实时荧光定量PCR扩增效率基本接近时(差异小于5% )，目的基因⑶F9的扩增效率为93%，内参β -actin的扩增效率为91. 3%。目的基因mRNA表达丰度可以用
^ (I+ Em)Ctx
At/ Am= P计算得到。转染CHO细胞系荧光图见图 ο。
￠+Erfrr结果发现，与共转染pcDNA3. 1-GDF9 质粒和 pshRNA-copGFP Lentivector 空质粒48h后相比，细胞共转染pcDNA3. 1-GDF9和慢病毒干扰质粒LV- siRNA以后，⑶F9 mRNA表达极显著下降(见图11)。结果显示三个慢病毒干扰质粒都一定程度抑制了⑶F9的表达，数据分析表明LV- siRNA I和LV- siRNA II抑制效率为均达到100%，LV- siRNA III抑制效率为90%以上(见图11)。转染慢病毒质粒后的CHO细胞裂解液中GDF9蛋白浓度明显下降(见图12)。综上所述，体外细胞实验表明本发明涉及的⑶F9 shRNA干扰质粒可有效地干预⑶F9基因的表达,可用于制造下调水牛生长分化因子9基因表达的制剂,提闻水牛繁殖率。
权利要求
1.一种抑制水牛生长分化因子9基因表达的siRNA，其特征在于，所述SiRNA的正义链具有以下任一序列GDF9-1 SEQ ID NO:I ；GDF9-2 SEQ ID NO:2 ；GDF9-3 SEQ ID NO:3。
2.—种shRNA，其特征在于含有权利要求I所述的siRNA。
3.如权利要求2所述shRNA，其特征在于，是以下任一双链核苷酸序列 ⑶F9-ldsDNA :正义链具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列； ⑶F9-2dsDNA :正义链具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列； ⑶F9-3dsDNA :正义链具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反义链具有如SEQ IDN0:9所示的核苷酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于是由权利要求3所述的shRNA编码基因与出发载体构建。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述出发载体为慢病毒载体pshRNA-copGFP Lentivector0
6.如权利要求I所述的siRNA在制备抑制水牛生长分化因子9表达的药物中的应用。
7.如权利要求I所述的siRNA在提高水牛繁殖率上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制水牛生长分化因子9(growthdifferentiationfactor9，GDF9)基因表达的siRNA，属于基因工程技术领域。本发明所述的siRNA正义链具有SEQ ID NO:1～3所示的任一序列。本发明还公开了含有该siRNA的shRNA编码基因及由其构建的慢病毒干扰质粒pshRNA-copGFPLentivector。通过实时定量Real-timePCR检测，相对表达量公式计算，其中两个siRNA片段分别对水牛GDF9mRNA抑制效率超过100%，ELISA检测GDF9蛋白表达量也相应降低。本发明的siRNA片段及其表达载体可用于制备抑制水牛GDF9表达的制剂，能够显著下调GDF9基因的表达量。
文档编号A61P43/00GK102965372SQ20121043802
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者习欠云, 张永亮, 施振旦, 肖敏, 蕉莉, 石德顺, 刘庆友 申请人:华南农业大学