专利名称：具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒及其制法和用途的制作方法
具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒及其制法和用途
背景技术：
氧化铁等磁性纳米微粒作为一种重要的生物材料在生物医药，如磁共振造影剂方面取得了广泛的应用(J Am Chem Soc 2005; 127:5732, J Am Chem Soc 2008; 130:7542.)。目前，氧化铁纳米微粒正作为纳米平台来构建多功能的成像探针(Angew Chem Int Ed2009;48:4174)。其中一项非常重要的工作就是将药物负载到造影探针上制备集治疗、成像与示踪为一体的诊疗探针(Adv Funct Mater 2009; 19:1553)。但只通过氧化铁带来的单一的成像模式，不能一次获得足够的生物学信息满足临床的需要，因此同一探针的多模态成像成为目前医学成像的发展趋势，不同模态的成像技术可以提供不同信息，如PET/CT技术，PET图像提供生物体的功能信息，CT图像提供生物体的结构信息，将两种信息结合就可以确切了解在生物体的某个位置的功能状态。单模态成像只能观测一个方面，而多模态成像则可以同时观测生物体内的两个甚至两个以上的组织信息，这对研究生物体内不同系统之间的相互作用至关重要。多模态成像使得实时动态观察生物有机体内的生物反应变化过程成为现实，使得人们可以直观地从基因表达、蛋白质相互作用、信号网络、细胞功能的多层面、多视角、观察研究有机个体发育、遗传进化、重大疾病发生、环境对生命个体影响等生命现象的发生、发展过程，对阐释生命活动的基本规律，揭示疾病发生机理，建立疾病预警系统，提高医疗诊治水平，探询发现新药物具有重大作用。因此对于如何实现将PET成像、荧光成像和磁共振成像几种不同功能的成像技术结合在一个探针中，从而实现多模态成像具有非常重要的现实意义。PET (Positron Emission Tomography正电子发射断层成像术)是一种核医学三维成像技术，具有高分辨率，被证明是一种直接的，高灵敏度的技术，它可以用来定量地考察被标记物的体内行为。突光成像(Optical Imaging)主要采用生物发光(bioluminescence)与突光(fluorescence)两种技术。这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法，非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，在刚刚发展起来的几年时间内，己广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。磁共振成像(MRI)，利用人体组织中氢原子核(质子)在磁场中受到射频脉冲的激励而发生核磁共振现象，产生磁共振信号，经过电子计算机处理，重建出人体某一层面的图像的成像技术。磁共振成像(MRI)与PET和荧光成像相比，能提供更好的空间分辨率，因此能很好的描述出微粒的体内分布，而MRI的灵敏度比PET和荧光成像差，而PET成像的信噪比最高，荧光成像的信噪比虽然不及PET成像高，但其灵敏度非常好。由于荧光成像既可以使用小动物成像仪成像，也可以通过荧光显微镜或共聚焦显微镜来观察，因此荧光成像成为了构建体外成像和活体成像的桥梁。氧化铁纳米微粒，无毒，生物可降解，廉价而被作为制备诊疗探针的原料，但诊疗探针的研究进展还非常有限。为了达到预期的效果，诊疗探针必须具有合适的循环时间，良好的病灶聚集能力和高的血管溢出率。然而，普通氧化铁纳米微粒表面不易连接药物分子(Small 2006; 2:785)。到目前为止，氧化铁纳米微粒负载药物是通过供价联接(JAm Chem Soc 2004; 126:7206, Small 2006; 2:785)，药物的负载率较低，释放效果也比较差。一种解决办法是将氧化铁纳米微粒载入具有药物负载功能的载体中，和药物一起载入载体中(Angew Chem Int Ed 2008; 47:5362),而这一体系的药物负载率较低,预期的临床循环情况也未知。此外，虽然蛋白基药物载体，如血清白蛋白(HSA)长期被用于药物载体(J Clin Oncol 2005; 23:7794.),也用来包裹氧化铁用作造影材料(Angew Chem Int Ed2009;48:4174)，研究表明血清白蛋白可以延长药物分子的循环时间，以及肿瘤富集效率。血清白蛋白药物复合物通常是通过将药物溶解在极性溶剂中然后加入血清白蛋白的水溶液中而制得(Expert Opin Pharmacother 2006; 7:1041)。这对于通过共沉淀法或者高温分解法制得的氧化铁纳米微粒来说并不适合。因为通过水相共沉淀法制得的氧化铁纳米微粒表面的亲水性较强，而通过热分解法制得的氧化铁纳米微粒表面的疏水性太强，都不利于与血清白蛋白形成稳定的复合物。
发明内容
针对上述问题，本发明首先制备了表面经过柠檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮修饰的具有中等极性的氧化铁纳米微粒，然后通过模板聚合法(Adv Mater,2004，16:933)使表面修饰的氧化铁纳米微粒与大分子-单体对共聚合，在水相，无有机溶剂的条件下，通过非共价键合力很方便的将氧化铁纳米微粒负载入大分子载体中。然后在大分子表面标记近红外荧光染料(Cy5. 5染料，NIR-797，ICG荧光染料等)(Mol Imaging2009;8:65.)和核素分子(64Cu-DOTA螯合剂，99mTc-DTPA等)，进一步负载药物(如抗肿瘤药物，光动力治疗药物)，并注入异种移植有肿瘤的小鼠模型中。实现近红外/PET/磁共振多模态成像并检测载药纳米微粒的体内输运过程。这项发明可成为集药物传输、示踪和成像的纳米平台。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案
一种具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒，它是由大分子单体和丙烯酸的共聚物包裹的氧化铁等磁流体的复合纳米微粒表面标记有近红外荧光染料和核素分子后进行交联，最后进行载药的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒，所述的大分子单体是壳聚糖、明胶、纤维素或酪蛋白。
上述的载药纳米粒，所述的氧化铁磁流体是柠檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化铁纳米微粒，流体动力学半径为5 20nm。上述的载药纳米粒，所述的壳聚糖是脱乙酰度为80-95%的数均分子量为I -20万的壳聚糖。上述的载药纳米粒，所述的荧光染料是Cy5. 5-NHS染料或异硫氰酸NIR-797染料。上述的载药纳米粒，所述的标记有核素分子是标记有99mTc或64Cu。上述的载药纳米粒，所述的载药是载有顺钼或阿霉素等抗肿瘤药物。.
一种制备上述载药纳米粒的方法，它包括如下步骤
步骤I.表面修饰的氧化铁纳米微粒(磁流体):通过共沉淀法、水热法或热分解法制备的柠檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化铁纳米微粒，流体动力学半径5 20nm，得到产物；
步骤2.大分子-单体对与表面修饰的氧化铁纳米微粒共聚合制备包裹有氧化铁的复合纳米微粒(Angew Chem Int Ed, 2004, 43:6369):将大分子单体(壳聚糖，明胶,纤维素，酪蛋白等)溶于含有一定量的聚丙烯酸水溶液中，当体系变为均相且澄清透明后，在超声条件下加入计量的步骤 I制备的磁流体，于氮气气氛下升温至70-90°C，然后加入计算量的K2S2O8溶液(1%)引发丙烯酸的聚合，反应结束后，得到带有浅蓝色乳光的溶液，经过滤后在截留分子量为12 kDa的透析袋中用蒸馏水透析24 h以除去剩余的单体和引发剂；
步骤3.复合纳米微粒表面标记近红外荧光分子
方法一由步骤2制得的纳米微粒分散在硼酸盐缓冲溶液中(50 mM, pH 8.5)通过PD-IO column色谱柱，荧光染料(Cy5. 5-NHS)溶解在DMSO中，与Cy5. 5-NHS的摩尔比为5:1，避光反应30分钟；
方法二 由步骤2制得的纳米微粒分散在硼酸盐缓冲溶液中(50 mM, pH 8.5)通过PD-IO column色谱柱，然后将异硫氰酸NIR-797溶于二甲亚砜(DMSO)中，使其浓度为10mg/mL，取O. I mL染料溶液缓慢滴入2 mL调整过pH值的纳米微球溶液中，在37°C避光反应搅拌2 h，然后将溶液通过ro-10 column色谱柱纯化纳米微球；
步骤4.复合纳米微粒表面标记核素分子
方法一将二乙烯三胺五乙酸(DTPA) 二酐(合成方法见(Chem. Eur. J. 2004,10:3252.))溶于DMSO中，使其浓度为20 mg/mL, DTPA与表面修饰的氧化铁纳米微粒摩尔比为5:1，避光反应过夜，然后将上述溶液通过ro-10色谱柱，并分散在PBS缓冲溶液中(pH 7. 4)，纳米微球的放射性核素标记的方法如下将氯化锡和99mTcCM 加入到标记了 DTPA的纳米微球的PBS溶液中(O. I mol/L，pH=7. 4)，在室温下搅拌30 min，然后，将99mTc-DTPA-纳米粒子通过O. 2 μ m注滤头过滤，来纯化得到的99mTc标记的载药纳米微球；方法二 将偶联剂DOTA-NHS (D0TA 1,4,7, 10-四氮杂环十二烷四乙酸，合成方法见(Cancer Res 2006; 66:9673))溶解在DMSO中，DOTA与表面修饰的氧化铁纳米微粒摩尔比为5:1，避光反应过夜，然后将上述溶液通过ro-10色谱柱，并分散在PBS缓冲溶液中(pH 7. 4)，将64CuCl2 (2 mCi)盐酸溶液加入到标记了 DOTA的纳米微球的PBS溶液中(O. Imol/L, pH=7. 4),在室温下搅拌30 min,然后，将64Cu-DOTA-纳米粒子通过0. 2 μ m注滤头过滤，来纯化得到的64Cu标记的载药纳米微球(64CuTv2= 12. 7 hours, Er= 655 keV (17%);Er= 573 keV (39%)))；
步骤5.标记有核素分子和近红外荧光分子的复合纳米微粒的药物负载在双标记的复合纳米微球溶液中加入计算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联反应(Angew Chem Int Ed 2003, 42: 1516·),在室温的条件下搅拌10 h后，将溶液放入截留分子量为12 kDa的透析袋中用蒸馏水透析24 h以除去未反应的交联剂，然后将计算量的顺钼加入到交联后的复合纳米微球溶液中，使药物浓度为I mg/mL,并将其放入37°C摇床中搅拌2天,然后根据kataoka课题组的方法来除去没有负载上的游离的顺钼(Langmuir 1999，15，377.)，得到本发明的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒。本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点I、本发明由于同时具有近红外荧光分子、核素分子并负载磁性纳米粒子，因此可以将荧光成像、PET成相和磁共振成像结合起来，有机的达到同步的多模式成像，同时获得多模态的信息。2、本发明在结构中的大分子具有氨基，羟基，羧基官能团，不仅可以嫁接荧光分子，核素分子，还能与药物分子产生非共价结合，有助于药物的负载和控制释放。3、本发明在温和的条件下反应，几乎不使用溶剂，复合微粒的生物相容性好。4、本发明所采用的纳米载体，尺寸和表面性质易于调控，可使得成像材料具有合适的体内循环半衰期和合适的视窗时间。5、本发明与单模态成像相比，多模态成像可以同时使用核素、光学标记和磁共振成像的探针同时探测生物体的不同分子，对在体研究生物体内的分子一分子相互作用具有重要意义，也可以使用核素和光学标记的探针同时探测生物体的同一分子，从不同侧面研究生物体的同一种分子，充分发挥PET成像和荧光学成像的优势。6、本发明的药物载体中虽然已经负载了纳米氧化铁，但药物的负载量反而增加了，可能与载体内部的比表面积增加有关。7、本发明可成为集药物传输、示踪和成像的纳米平台，所涉及的磁性纳米材料、大分子、小分子单体、荧光染料和核素分子并不局限于本发明实例中所提到的具体物质，凡符合本发明思想的均属于本发明范畴。
图I、具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒合成过程示意图。图2、具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的负载顺钼药物纳米粒在37°C时，PBS溶液(pH=7. 4)中的体外释放曲线。图3、A为不同时间点肿瘤部位的近红外荧光强度曲线出为静注后72小时不同组织器官的近红外荧光照片。图4、通过尾静脉注射多模态成像复合载药纳米微球后，在不同时间点纳米微球在荷瘤小鼠的不同组织器官中的分布，其中图4A为实施例I制备的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒；图4B为实施例I制备的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒；图4C为实施例I制备的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒。
具体实施例方式本发明属于集多模态成像技术与药物输运为一体的复合载药纳米微粒的制备，它包括PET成像，荧光成像和磁共振成像三种不同功能的成像探针，并可以负载药物实施体内的输运和控制释放。多模态成像载药纳米微粒的合成过程如图I所示。以下通过实施例并结合附图对本发明的结构进行详细的描述。实施例I.具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒的制备
称取精制后I万或20万数均分子量、脱乙酰度为80%或95%的壳聚糖O. 25克，溶解在50 ml含有计算量的丙烯酸的水溶液中。其中壳聚糖中的氨基和丙烯酸中羧基的比例为1:1。对于不同分子量的壳聚糖，丙烯酸的量略微作了一些调整。常温条件下搅拌，直至壳聚糖完全溶解。大概需要15分钟。向体系中加入O. Ig磁流体，维持整个体系的体积为50 ml，装上冷凝装置，接通冷凝水。快速升温到70°C，加入少量的引发剂过硫酸钾，保持在70°C反应。反应过程中观察体系颜色的变化。当体系颜色变为乳白色后，继续反应2小时，以确保体系中的丙烯酸反应完全。然后加入O. 5 ml的戊二醛交联2小时。所得的乳液通过磁分离得到包裹有磁性纳米微粒的复合微球。将上述磁性纳米微球分散在硼酸盐缓冲溶液中(50 mM, pH 8. 5)通过Η)_10column色谱柱；荧光染料(Cy5. 5-NHS)溶解在DMSO中，与Cy5. 5-NHS的摩尔比为5:1，避光反应30分钟。得到标记有荧光染料Cy5. 5的复合纳米微球，然后继续通过磁分离去除未反应的 Cy5. 5-NHS ο将二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐溶于DMSO中，使其浓度为20 mg/mL。取O. 2 mL的DTPA 二酐溶液缓慢滴入2 mL的PBS，pH=8的标记有Cy5. 5-NHS的壳聚糖-聚丙烯酸/氧化铁复合纳米微球溶液中，在室温下搅拌24 h。经过滤后将溶液放入截留分子量为12kDa的透析袋中用PBS溶液透析2天以除去没有连接到纳米微球上的DTPA。将氯化锡和99mTc04加入到标记了 DTPA的纳米微球的PBS溶液中(O. I mol/L, pH=7. 4)，在室温下搅拌30 min。然后，经过超滤的方法(截留分子量为100 kDa)来纯化得到的99mTc标记的载药纳米微球。然后将上述溶液通过ro-10色谱柱除去未反应的99mTc04 。
将双标记的磁性复合纳米微球溶液中加入计算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联反应。在室温的条件下搅拌10h后，将溶液放入截留分子量为12 kDa的透析袋中用蒸馏水透析24 h以除去未反应的交联剂。然后将计算量的顺钼加入到交联后的复合纳米微球溶液中，使药物浓度为I mg/mL。并将其放入37°C摇床中搅拌2天。然后除去没有负载上的游离的顺钼。得到具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的壳聚糖-聚丙烯酸-氧化铁载药纳米微粒MIDLNl，基本理化参数见表I，采用I万或20万数均分子量和脱乙酰度为80%或95%的壳聚糖制得的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的壳聚糖-聚丙烯酸-氧化铁载药纳米微粒的理化性质没有本质的区别。实施例2.具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒的制备
将O. 8 g明胶溶于含有O. 2 g丙烯酸的水溶液中，当体系变为均相且澄清透明后，大概需要25分钟。向体系中加入O. Ig磁流体，维持整个体系的体积为50 ml，装上冷凝装置，接通冷凝水。于氮气气氛下升温至80°C，加入少量的引发剂过硫酸钾，保持在80°C反应。反应过程中观察体系颜色的变化。当体系颜色变为乳白色后，继续反应2小时，以确保体系中的丙烯酸反应完全。然后加入O. 5 ml的戊二醛交联2小时。所得的乳液通过磁分离得到包裹有磁性纳米微粒的复合微球。将上述磁性纳米微球分散在硼酸盐缓冲溶液中(50 mM, pH 8. 5)通过Η)_10column色谱柱；荧光染料(Cy5. 5-NHS)溶解在DMSO中，与Cy5. 5-NHS的摩尔比为5:1，避光反应30分钟，得到标记有荧光染料Cy5. 5的复合纳米微球，然后继续通过磁分离去除未反应的 Cy5. 5-NHS ο将二乙烯三胺五乙酸(DTPA)二酐溶于DMSO中，使其浓度为20 mg/mL。取O. 2 mL的DTPA 二酐溶液缓慢滴入2 mLPBS,pH=8的标记有Cy5. 5-NHS的壳聚糖-聚丙烯酸/氧化铁复合纳米微球纳米微球溶液中，在室温下搅拌24 h。经过滤后将溶液放入截留分子量为12 kDa的透析袋中用PBS溶液透析2天以除去没有连接到纳米微球上的DTPA。将氯化锡和99mTc04 加入到标记了 DTPA的纳米微球的PBS溶液中(O. I mol/L, pH=7. 4)，在室温下搅拌20 min。然后，经过超滤的方法(截留分子量为100 kDa)来纯化得到的99mTc标记的载药纳米微球。然后将上述溶液通过ro-10色谱柱除去未反应的99mTc04 。
将双标记的磁性复合纳米微球溶液中加入计算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联反应。在室温的条件下搅拌10h后，将溶液放入截留分子量为12 kDa的透析袋中用蒸馏水透析24 h以除去未反应的交联剂。然后将计算量的顺钼加入到交联后的复合纳米微球溶液中，使药物浓度为I mg/mL。并将其放入37 °C摇床中搅拌2天。然后根据kataoka课题组的方法来除去没有负载上的游离的顺钼。得到具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的明胶-聚丙烯酸-氧化铁载药纳米微粒MIDLN2，基本理化参数见表I。实施例3.具核素成像 、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒的制备
将I g酪蛋白溶于含有0.2 g丙烯酸的水溶液中，当体系变为均相且澄清透明后，大概需要40分钟。向体系中加入O. Ig磁流体，维持整个体系的体积为50 ml，装上冷凝装置，接通冷凝水。于氮气气氛下升温至90°C，加入少量的引发剂过硫酸钾，保持在90°C反应。反应过程中观察体系颜色的变化。当体系颜色变为乳白色后，继续反应2小时，以确保体系中的丙烯酸反应完全。然后加入O. 5 ml的戊二醛交联2小时。所得的乳液通过磁分离得到包裹有磁性纳米微粒的复合微球。将上述磁性纳米微球分散在硼酸盐缓冲溶液中(50 mM, pH 8. 5)通过Η)_10column色谱柱。然后将异硫氰酸NIR-797溶于二甲亚砜(DMSO)中，使其浓度为10 mg/mL。取O. I mL染料溶液缓慢滴入2 mL调整过pH值的纳米微球溶液中，在37°C避光反应搅拌2ho然后将溶液通过ro-10 column色谱柱纯化纳米微球。。将偶联剂DOTA-NHS (D0TA: 1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸，合成方法见(Cancer Res 2006;66:9673 - 81.))溶解在DMSO中，DOTA与表面修饰的氧化铁纳米微粒摩尔比为5:1，避光反应过夜。然后将上述溶液通过ro-10色谱柱，并分散在PBS缓冲溶液中(pH 7.4)。将64CuCl2 (2 mCi)盐酸溶液加入到标记了 DOTA的纳米微球的PBS溶液中(O. I mol/L，pH=7. 4)，在室温下搅拌30 min。然后，将64Cu-DOTA-纳米粒子通过O. 2 μ m注滤头过滤，来纯化得到的64Cu标记的载药纳米微球(64CuTv2= 12.7 hours, Er= 655 keV(17%); Er= 573 keV (39%))
将双标记的磁性复合纳米微球溶液中加入计算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联反应。在室温的条件下搅拌10 h后，将溶液放入截留分子量为12 kDa的透析袋中用蒸馏水透析24 h以除去未反应的交联剂。然后将计算量的顺钼加入到交联后的复合纳米微球溶液中，使药物浓度为I mg/mL。并将其放入37 °C摇床中搅拌2天。同样根据kataoka课题组的方法来除去没有负载上的游离的顺钼。得到具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的酪蛋白-聚丙烯酸-氧化铁载药纳米微粒MIDLN3，基本理化参数见表I。表权利要求
1.一种具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒，粒径为80-250nm，其特征是它是由大分子单体和丙烯酸的共聚物包裹的氧化铁磁流体的复合纳米微粒表面标记有近红外荧光染料和核素分子后进行交联，最后进行载药的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒，所述的大分子单体是壳聚糖、明胶、纤维素或酪蛋白。
2.根据权利要求I所述的载药纳米粒，其特征是所述的氧化铁磁流体是柠檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化铁纳米微粒，流体动力学半径为5 20nm。
3.根据权利要求I所述的载药纳米粒，其特征是所述的壳聚糖是脱乙酰度为80-95%的数均分子量为1-20万的壳聚糖。
4.根据权利要求I所述的载药纳米粒，其特征是所述的荧光染料是Cy5.5-NHS染料或异硫氰酸NIR-797染料。
5.根据权利要求I所述的载药纳米粒，其特征是所述的标记有核素分子是标记有99mTc 或 64Cu。
6.根据权利要求I所述的载药纳米粒，其特征是所述的载药是载有顺钼药物。
7.一种制备权利要求I所述载药纳米粒的方法，其特征是它包括如下步骤 步骤I.表面修饰的氧化铁纳米微粒的磁流体通过共沉淀法、水热法或热分解法制备的柠檬酸、聚乙烯醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮包裹的氧化铁纳米微粒，流体动力学半径5 20nm，得到产物； 步骤2.大分子-单体对与表面修饰的氧化铁纳米微粒共聚合制备包裹有氧化铁的复合纳米微粒将大分子单体壳聚糖、明胶、纤维素或酪蛋白溶于含有聚丙烯酸水溶液中，当体系变为均相且澄清透明后，在超声条件下加入计量的步骤I制备的磁流体，于氮气气氛下升温至70-90°C，然后加入1%的K2S2O8溶液引发丙烯酸的聚合，反应结束后，得到带有浅蓝色乳光的溶液，经过滤后在截留分子量为12 kDa的透析袋中用蒸馏水透析24 h以除去剩余的单体和引发剂； 步骤3.复合纳米微粒表面标记近红外荧光分子 方法一由步骤2制得的纳米微粒分散在浓度为50 mM、pH 8. 5的硼酸盐缓冲溶液中，通过TO- Ο column色谱柱，荧光染料Cy5. 5-NHS溶解在二甲亚砜中，与Cy5. 5-NHS的摩尔比为5:1，避光反应30分钟； 方法二 由步骤2制得的纳米微粒分散在浓度为50 mM、pH 8. 5的硼酸盐缓冲溶液中，通过ro-10 column色谱柱，然后将异硫氰酸NIR-797溶于二甲亚砜中，使其浓度为10 mg/mL,取O. I mL染料溶液缓慢滴入2 mL调整过pH值(8. 5)的纳米微球溶液中，在37°C避光反应搅拌2 h，然后将溶液通过ro-10 column色谱柱纯化纳米微球； 步骤4.复合纳米微粒表面标记核素分子 方法一将二乙烯三胺五乙酸二酐(DTPA)溶于DMSO中，使其浓度为20 mg/mL，二乙烯三胺五乙酸二酐与表面修饰的氧化铁纳米微粒摩尔比为5:1，避光反应过夜，然后将上述溶液通过ro-10色谱柱，并分散在pH= 7. 4的PBS缓冲溶液中，纳米微球的放射性核素标记的方法如下将氯化锡和99mTcCM 加入到标记了二乙烯三胺五乙酸二酐的纳米微球的浓度为O. I mol/L、pH=7. 4的PBS溶液中，在室温下搅拌30 min，然后，将99mTc-DTPA-纳米粒子通过O. 2 μ m注滤头过滤，来纯化得到的99mTc标记的载药纳米微球； 方法二 将偶联剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-NHS)溶解在DMSO中，DOTA与表面修饰的氧化铁纳米微粒摩尔比为5:1，避光反应过夜，然后将上述溶液通过ro-io色谱柱，并分散在PH 7. 4的PBS缓冲溶液中，将64CuCl2 (2 mCi)盐酸溶液加入到标记了DOTA的纳米微球的浓度为O. I mol/L、pH=7. 4的PBS溶液中，在室温下搅拌30 min，然后，将64Cu-DOTA-纳米粒子通过O. 2 μ m注滤头过滤,来纯化得到的64Cu标记的载药纳米微球； 步骤5.标记有核素分子和近红外荧光分子的复合纳米微粒的药物负载在双标记的复合纳米微球溶液中加入计算量的I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)进行交联反应，在室温的条件下搅拌10 h后，将溶液放入截留分子量为12 kDa的透析袋中用蒸馏水透析24 h以除去未反应的交联剂，然后将计算量的顺钼加入到交联后的复合纳米微球溶液中，使药物浓度为I mg/mL，并将其放入37°C摇床中搅拌2天，然后根据kataoka课题组的方法来除去没有负载上的游离的顺钼，得到具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒。
8.权利要求I所述的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
一种具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒，粒径为80-250nm，它是由大分子单体和丙烯酸的共聚物包裹的氧化铁磁流体的复合纳米微粒表面标记有近红外荧光染料和核素分子，然后进行交联，最后进行载药的具核素成像、荧光成像与磁共振成像功能的载药纳米粒，所述的大分子单体是壳聚糖、明胶、纤维素或酪蛋白。本发明与单模态成像相比，多模态成像可以同时使用核素、光学标记和磁共振成像的探针同时探测生物体的不同分子，对在体研究生物体内的分子一分子相互作用具有重要意义，也可以使用核素和光学标记的探针同时探测生物体的同一分子，从不同侧面研究生物体的同一种分子，充分发挥磁共振成像、PET成像和荧光成像的优势。本发明公开了其制法。
文档编号A61K49/14GK102921022SQ20121048424
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者丁寅, 陈洪渊, 徐静 申请人:南京大学