治疗视神经脊髓炎的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及结合水通道蛋白4（AQP4）的抗体和将此类抗体作为单独治疗或与标准NMO治疗，如免疫抑制或血浆交换术相组合来治疗视神经脊髓炎（NMO）的方法。
【专利说明】治疗视神经脊髓炎的组合物和方法
[0001]本申请要求2011年4月11日提交的美国临时申请N0.61/477,955的优先权，其全部内容并入本文作为参考。
[0002]发明背景
[0003]本发明得到了美国国立卫生研究院授予的基金号EY13574、EB00415、DK35124、HL73856、DK86125和DK72517的政府支持而完成。政府具有本发明的一定权利。
【技术领域】
[0004]本发明大致与医学、免疫学、神经学和病理学相关。更具体来说，它与用于治疗视神经脊髓炎(neuromyelitis optica, NMO)的免疫试剂的研发有关。
【背景技术】
[0005]AQP4 (水通道蛋白-4)是遍及中枢神经系统的星形胶质细胞中表达的水通道(Lennon 等人,2005),它参与脑(Manley 等人,2000; Papadopoulos 等人,2004)和脊髓(Saadoun等人,2008)中的水平衡、感觉信号传导(Li和Verkman, 2001; Lu等人,2008)和包括癫痫发作(Binder等人，2006)和皮层扩散型抑制(Padmawar等人，2005)的神经兴奋现象，以及星形胶质细胞迁移和神经胶质细胞瘢痕(Saadoun等人，2005;Auguste等人，2007)。AQP4在星形胶质细胞中表达为两种主要的亚型:翻译起始点在Met-1处的长(Ml)亚型，翻译起始点在Met-23处的短(M23)亚型(Hasegawa等人，1994; Jung等人，1994; Yang等人，1995; Lu等人，1996)。M23AQP4在细胞膜中组装成名为颗粒的正交阵列(orthogonal arra ys of particles, 0AP)的常规阵列,其最初由冷冻断裂电子显微镜观察到(Landis 和 Reese, 1974;ffolburg, 1995)。M23 的 OAP 形成源于涉及其胞质 N 端 Met_23正下游残基的四聚体-四聚体相互作用，而M1AQP4中Met-23正上游的残基干扰了这种相互作用(Crane和Verkman, 2009)。尽管Ml自己并不形成0ΑΡ,它可与M23共同组装为异四聚体，其限制了 OAP 的大小(Neely 等人，1999; Furman 等人，2003; Crane 等人(2009) ; Tajima等人，2010)。AQP4的OAP形成的生物学重要性目前未知，推测其功能包括细胞_细胞粘附、提高的AQP4水渗透性和AQP4在星形胶质细胞突触小结的极化。
[0006]神经炎性脱髓鞘疾病视神经脊髓炎(NMO)的定义特征是存在抗AQP4的血清自身抗体(NMO-1gG)。NMO-1gG的存在是对NMO特异的，在一些报道中，血清NMO-1gG的滴度与NMO疾病活动相关(Matiello等人，2008 Jarius等人，2008)。啮齿动物中的研究表明，在NMO中NMO-1gG是致病的。在已存在实验性自身免疫脑脊髓炎(Bennett等人，2009; Bradl等人，2009)或者用弗氏完全佐剂预处理(Kinoshita等人，2010)的大鼠中，和用人的补体共注射的首次接受实验的小鼠中(Saadoun等人，2010 )，人NMO-1gG产生许多NMO疾病的特征。这些动物出现特征性的NMO损伤，如神经炎、活化补体的血管周沉积、脱髓鞘以及星形胶质细胞GFAP和AQP4免疫反应性的丧失。如今NMO症状的治疗还很受限制，还没有阻止潜在炎症事件的已知治疗措施。
【发明内容】
[0007]因此，依照本发明，提供了治疗具有视神经脊髓炎(NMO)谱系疾病的受试者的方法，包括向受试者施与包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中该试剂缺少完整抗体的效应物功能(effector function)。所述受试者可以是人类受试者。施与可以包括眼内、动脉内、皮下、静脉施与或鞘内施与途径。所述试剂可以包括缺少效应物功能的突变Fe区域，例如在Fe区域包含L234A/L235A氨基酸替换、L234A/L235A/G237A氨基酸替换和/或K322A氨基酸替换的IgGl序列。所述试剂也可以包括IgG2或IgG3序列，其在Fe区域具有消除效应物功能，如补体活化的替换。或者，所述试剂可以是IgG4抗体。所述试剂可以包含化学修饰的Fe区域。所述试剂也可以包含抗体Fab片段而缺少Fe区域，或者与非抗体蛋白片段融合的抗体Fab片段。所述试剂也可以包含单链抗体或F(ab’)2。抗体也可以通过突变抗原结合区域的某些残基来优化对AQP4的结合。
[0008]所述治疗可以包括减少视网膜神经节细胞死亡、视神经损伤、脊髓损伤或轴突横断中的一项或多项。所述治疗可以包括减少视神经脱髓鞘、脊髓脱髓鞘、星形胶质细胞死亡或少突胶质细胞死亡中的一项或多项。所述试剂可以施与一次以上，包括长期和每天。所述试剂可以在NMO发作时或之后，如NMO发作的约lh、6h、12h、24h或2天之内施与。所述方法还可以包括施与受试者治疗NMO—个或多个方面的第二种试剂。第二种试剂可以与所述试剂同时，或在所述试剂之前或之后施与。所述方法还可以包括评估患者阳性NMO-1gG(AQP4)的血清学。所述受试者可以显示阳性NMO-1gG (AQP4)的血清学。所述受试者可以显示横贯性脊髓炎、视神经炎或其他非相关的神经功能障碍(如持续的恶心或呕吐)中的一项或多项。
[0009]其他实施方式包括长期治疗受试者以阻止或减轻受试者视神经脊髓炎(NMO)谱系疾病恶化的方法，包括向所述受试者施与包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中所述试剂缺乏完整抗体的效应物功能，以及预防或抑制受试者中视神经脊髓炎(NMO)谱系疾病发 展的方法，包括施与所述受试者包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中所述试剂缺少完整抗体具有的效应物功能。
[0010]在另一个实施方式中，提供了包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中所述试剂缺少完整抗体具有的效应物功能。所述试剂可以包括缺少效应物功能的突变Fe区域，例如包含含有L234A/L235A氨基酸替换、L234A/L235A/G237A氨基酸替换的IgGl序列和/或包含具有K322A替换的IgGl序列，或者甚至是突变的IgG2或IgG3Fc区域的一个。所述试剂可以是IgG4抗体。所述试剂可以包含化学修饰的Fe区域。所述试剂可以包括抗体Fab片段并缺少Fe区域。所述试剂可以包含与非抗体蛋白片段融合的抗体Fab片段。所述试剂可以包含单链抗体或F (ab) 2。可以预期，本文描述的任何方法或组合物均可以应用到本文描述的任何其他方法或组合物中。
[0011]前述抗体或抗体的抗原结合片段可以包括根据SEQ ID NO:6的轻链可变序列或与SEQ ID N0:6具有95%、90%、85%或80%同一性的序列，以及根据SEQ ID N0:8的重链序列或与SEQ ID NO:8具有95%、90%、85%或80%同一性的序列；或者根据SEQ IDNO: 10的轻链可变序列或与SEQ ID N0:10具有95%、90%、85%或80%同一性的序列，以及根据SEQ ID NO: 12的重链序列或与SEQ ID NO: 12具有95%、90%、85%或80%同一性的序列；或者根据SEQ IDNO: 19的轻链可变序列或与SEQ ID NO: 19具有95%、90%、85%或80%同一性的序列，以及根据SEQ ID NO: 17的重链可变序列或与SEQ IDNO: 17具有95%、90%、85%或80%同一性的序列。所述抗体的抗原结合片段可以由根据SEQ ID NO:5的轻链可变序列或与SEQ ID NO:5具有85%、80%、75%或70%同一性的序列，以及根据SEQ ID NO: 7的重链序列或与SEQ ID NO: 7 ^有85%、80%、75%或70%同一性的序列编码；或者由根据SEQ ID NO:9的轻链可变序列或与SEQ ID NO:9具有85%、80%、75%或70%同一性的序列，以及根据SEQ ID NO: 11的重链序列或与SEQ ID NO: 11具有85%、80%、75%或70%同一性的序列编码；或者由根据SEQ IDNO: 20的轻链可变序列或与SEQ ID NO: 20具有85%、80%、75%或70%同一性的序列，以及根据SEQID NO: 18的重链序列或与SEQ ID NO: 18具有85%、80%、75%或70%同一性的序列编码。所述抗体的抗原结合片段可以包括具有实验室命名rAb-53、rAb09-3-33或rAb_58抗体的抗原结合片段。
[0012]在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”共同使用的词语“a”或“an”可能意为“一”，但其也与“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的意思一致。词语“约”意为所述
数字的正负5%。
[0013]下述详细描述将阐明本发明的其他目标、特点和优点。然而，应当理解的是，尽管表明是本发明的【具体实施方式】，所述详细描述和具体实例仅是为了说明的目的，因为本发明的精神和范围内的多种改变和修饰对本领域技术人员来说将是从下述详细描述中显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]下面的附图形成本说明书的一部分，进一步阐述本发明的某些方面。参考这些附图的一个或多个，结合本文提出的【具体实施方式】的详细描述将会更好地理解本发明。
[0015]图1A-B暈化测 定NMO-1甙与AQP4亚型结合的双色比率成像方法的图示。(图1A)显示AQP4单体(圆柱体)组装成四聚体(上)或OAP (下)。NMO-1gG (绿色)结合AQP4的胞外结构域，参考AQP4抗体(红色)与胞质端结合。(图1B)参考AQP4抗体与AQP4的C端结合，与AQP4N端亚型和OAP形成无关。
[0016]图2A-D稳定转染的、表汰AQP4的U87MG细胞的表征。(图2A)共聚焦荧光图像晶示稳定表达Ml (上)或M23 (下)并以NMO-1gG (绿色)和C端抗AQP4抗体(红色)标记的U87MG细胞。(图2B)全内反射荧光图像显示表达M23的细胞中特殊的OAP (下)和表达Ml的细胞中的平滑(smooth)荧光染色模式(上)。(图2C)稳定表达AQP4的U87MG细胞裂解物的AQP4免疫印迹,之前进行蓝绿温和胶电泳(blue-native gel electrophoresis)(上)和三甲基甘氨酸SDS-PAGE (下)。(图2D)用Ml或M23AQP4稳定(灰色)或瞬时(白色)转染并用所述重组单克隆NMO-1gG标记后U87MG细胞中测定绿对红荧光比率(G/R)。
[0017]图3A-B NMO患者血清中NMO-1gG与Ml对比M23AQP4的不同结合。(图3A)用来自四名患者的5%NM0血清(绿色)和参考AQP4抗体(红色)染色的表达Ml和M23的U87MG细胞。(图3B)NM0患者血清对Ml对比M23AQP4的结合曲线(平均值土S.E.，n=5)。曲线代表单点结合模型的拟合。
[0018]图4A-B钝化的单克降NMO-1 gG对Ml对比M23AQP4的差异结合。(图4A) rAb-53和rAb-58 (绿色)和参考AQP4抗体(红色)的结合作为浓度的函数的代表性荧光显微照相像。(图4B)rAb-53 (左)、rAb_58 (中)和rAb-186 (右)对Ml对比M23AQP4的结合曲线(平均值土 S.E.，n=5)。曲线代表单点结合模型的拟合。
[0019]图5A-C NMO-1gG与Ml和M23AQP4混合物，以及与含有干扰OAP的突夺的M23突变体的结合。(图5A)以指定比率用量子点单粒子追踪(auantum dot single-particletracking)测量的Ml和M23AQP4混合物的rAb_53的结合(左)和扩散范围的累积分布(右)(平均值土S.E.，n=5)。(图5B)以指定比率测量的具有Ml突变体CCA的M23AQP4的rAb_53结合(左)和扩散范围(右)(平均值土 S.E.，n=5)。(图5C)AQP4突变体M23-F26Q(红)和M23-G28P (绿)的rAb-53结合(左)和扩散范围(右)(平均值土 S.E.，n=5)。
[0020]图6A-D NMO-1gG对阵列纟目合的AQP4增强的结合亲和件的机理。(图6A)人IgG和AQP4晶体结构(Harris等人，1998; Ho等人，2009)，显示AQP4四聚体与整个IgG中Fab结合位点之间的空间相比较的相对大小。(图6B)双价对比单价结合机理的预测。显示AQP4单体(圆柱体)组装为四聚体(Ml)或OAP (M23)。NMO-1gG (绿色)以单价或双价与OAP的(未知)胞外结构域相结合。(图6C)单克隆小鼠抗Myc抗体对表达Myc标记的Ml对比M23AQP4的细胞的结合。(图6D)固定浓度时完整IgG或小鼠抗Myc抗体的纯化Fab片段(左)、rAb_53(中)和rAb-58 (右)的相对Ml比M23的结合(平均值土S.E.，n=5)。
[0021]图7A-C用于aquaporumab (抗水通道蛋白单抗)治疗的高亲和性单克隆、重组抗AQP4抗体。(图7A)以和IgGl抗体的晶体结构同等比例显示的AQP4四聚体的晶体结构。(图7B)重组抗体与AQP4重构的蛋白脂质体 结合的表面等离子体共振测定，显示rAb-53 (左)在不同浓度和不同NMO rAb (右)在固定浓度的结合/解离动力学。(图7θΑ?3-53(25μ8/ml)对表达AQ P4的U87MG细胞的结合和解离动力学。通过与rAb-53孵育特定时间，然后漂洗、固定以及加入荧光二级抗体来测定结合。用rAb-53孵育60分钟，然后用不含抗体的缓冲溶液洗脱特定时间来测定洗脱。上部:显示细胞表面rAb-53染色的代表性显微照相(红色)。底部:平均结合数据(平均值土S.E.，n=4)。
[0022]图8A~D突变白勺、与巨至女病十牛rAb-53 (aquaporumab) PIL丨h了至女病十牛NMQ-1gG与AQP4的结合。(图8A)rAb-53图解，显示重链(VH)和轻链(VL)可变区域、轻链恒定区(CL)和IgGl重链恒定区(CH1-CH3)。引入CH2结构域以降低CDC(K322A)、ADCC(K326W/E333S)或二者(L234A/L235A)的氨基酸突变的位置。(图8B)突变的rAb-53 (L234A/L235A)对AQP4重构的蛋白脂质体的结合与洗脱的表面等离子体共振测定。(图8C)突变的rAb-53阻止Cy3标记的(非突变)rAb-53对表达AQP4的细胞的结合。无AQP4 (最左边的板)或表达AQP4的细胞(其他板)与20g/ml Cy3-rAb-53在所示(未标记的)100 μ g/ml抗体存在或不存在时孵育Ih的Cy3荧光图。(图8D)不相关的单克隆NMO抗体和人NMO血清阻止AQP4与Cy3标记的rAb-53的结合。与20 μ g/ml Cy3_rAb_53在10%对照(非ΝΜ0)或NMO患者血清，或100 μ g/ml重组NMO单克隆抗体rAb-186存在或不存在时孵育Ih的细胞中的Cy3荧光图像。
[0023]图 9A-D 突变白勺与巨至女病 rAb-53aquaporumabNMQ-1gGAQP4 白勺3ft中防丨hCDC和ADCC。(图9A)表达AQP4的CHO细胞暴露于人补体以及对照(非NM0)mAb或rAb-53 (2.5 μ g/ml，未突变的或突变的)90分钟后的活/死细胞测试。死细胞百分比总结在右侧(平均值土 S.E.，n=4-6,与单独的rAb-53相比*P〈0.001)。(图9B)如A中的测试，用补体+rAb-53,在12.5 μ g/ml的所示aquaporumab存在时完成。(图9C)在不存在或存在所示aquaporumab时,暴露于对照(非-ΝΜ0)血清或NMO患者血清60min后的活/死细胞测试。(图9D)用表达AQP4的CHO细胞与NK细胞以及对照(非NMCOmAb或rAb-53或aquaporumab(单独地)或rAb-53和aquaporumab —起孵育完成ADCC测试。
[0024]图10A-C Aquaporumab在体内降4氏由脑内注身寸NMQ-1gG矛口人丰卜体而引走己的小鼠脑中的NMO样损伤。(图10A)脑内注射之后24h的小鼠脑切片的板，用苏木紫和曙红(H&E)和罗克沙尔固蓝(Luxol fast blue)(髓磷脂)染色，将AQP4(AQP4)和C5b_9 (活化的补体)免疫染色为棕色。脑内注射是用NMO-1gG(从NMO血清中纯化的IgG)和人补体，加入或不加入aquaporumab (Aqmab),以及对照(对照IgG、AQP4敲除小鼠、Aqmab单独)来完成的。粉线代表无罗克沙尔固蓝染色或AQP4免疫反应性的区域。黑线标示了注射的半球并显示针的轨迹。箭号，中性粒细胞；箭头，血管周C5b-9免疫反应性；V，血管。短线，50μπι。(图10Β)AQP4和髓磷脂损失的量化为粉色标示的面积/黑色标示的面积的％ (S.Ε.Μ.，每组5只小鼠，*Ρ〈0.01)。(图10C) 5对小鼠的髓磷脂和AQP4损失％，每对小鼠用来自不同NMO患者的NMO-1gG和人补体,没有或有aquaporumab来注射。
[0025]图1lA-B Aquaporumab在离体脊髓切片培养物中减轻由NMO-1gG和人补体导致的NMO样损伤。(图11A)离体脊髓切片培养物模型，其中将切片培养7天，之后在存在NMO-1gG(来自NMO血清的纯化IgG)和人补体,不加入或加入aquaporumab (Aqmab)下培养3天。显示对AQP4、GFAP和髓磷脂的免疫染色。对照包括非-NMOIgG、仅有NMO-1gG或Aqmab、Aqmab与补体，以及来自无AQP4的小鼠的切片培养物。(图11B) NMO损伤的得分(见方法)(S.Ε.Μ., n=4-5, P<0.001)。
【具体实施方式】
[0026]发明人以前显示NMO患者的血清和重组单克隆NMO-1gG都可以与AQP4的M23和Ml亚型结合(Crane等人，2009)，该发现与更早些的、报告检测不到与从一位NMO患者血清的M1AQP4结合的研究相矛盾(Nicchia等人，2009)。先前的分析单个NMO血清样本的报告得出结论，OAP是NMO-1gG仅有的靶标(Nicchia等人，2009)。然而，这项结论不是正确的，因为对血清抗AQP4自身抗体 的临床血清分析使用M1AQP4 (Wingerchuk等人，2006)，而发明人(Bennett等人,2009;Crane等人,2009)和其他人(Hinson等人,2007)都报道过一些NMO自身抗体对仅表达M1AQP4的细胞的强烈结合。虽然最近的研究显示匪O-1gG结合测试的临床灵敏度可以通过使用表达M23的细胞得到提高(Mader等人，2010)，然而却从来没有进行过NMO-1gG AQP4特异性的量化研究，也没有测定过NMO-1gG对AQP4亚型的结合亲和性。
[0027]发明人使用定量比率成像来测定NMO自身抗体与AQP4的结合，其中如用荧光二级抗体所揭示的，NMO-1gG结合用抗AQP4C端的抗体归一化为总AQP4蛋白。在这些研究中，发明人鉴定了起源于人星形胶质细胞的、转染后以细胞膜形式表达AQP4的细胞系。独立地评估AQP4亚型和OAP对NMO-1gG结合特异性的策略是以不同比率表达Ml和M23AQP4，或者包含干扰OAP的、在其N端具有单氨基酸替换的M23突变体。测量是在来自NMO患者的血清样本，以及由重组技术根据从NMO患者脑脊髓液的血浆细胞起源的克隆序列得到的纯化的单克隆抗体上完成的。使用单克隆NMO抗体的研究首次使NMO-1gG对AQP4的绝对结合亲和性的研究成为可能。使用M23AQP4的OAP缺陷型突变体和多种形成异四聚体的混合AQP4亚型的研究显示了在OAP中NMO-1gG对AQP4结合的增强。比较完整NMO-1gG与纯化的Fab片段的研究揭示了 NMO-1gG对阵列组装的AQP4的增强结合的分子基础。[0028]另外，发明人制备了非致病性的、称之为“抗水通道蛋白单抗”(aquaporumab)的人重组单克隆抗AQP4抗体，其选择性地阻断NMO-1gG与AQP4的结合，阻止NMO-1gG引起的细胞杀伤和损伤形成。Aquaporumab包括紧密结合的抗AQP4Fab和突变的、缺少补体介导的细胞毒性和细胞介导的细胞毒性的Fe。在表达AQP4的细胞的培养物中，aquaporumab阻断了人血清中NMO-1gG的结合，将补体介导的细胞毒性和细胞介导的细胞毒性降到接近零。Aquaporumab在NMO的离体脊髓切片模型和将NMO-1gG和补体经大脑内注射产生的体内小鼠模型中防止了 NMO样损伤的发展。单独的aquaporumab并不致病。aquaporumab抑制的广泛效力可能是由于其与AQP4胞外结构域相比巨大的物理体积造成的空间竞争。这些结果为NMO的aquaporumab治疗提供了支持。
[0029]本发明的这些方面和其他方面在下文详述。
[0030]1.视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica, NMO)
[0031]视神经脊髓炎(ΝΜ0)，也称为Devic氏病或Devic氏综合征，是一种自身免疫、炎症疾病，其中人的自身免疫系统攻击视神经和脊髓。该病导致视神经(视神经炎)和脊髓(脊髓炎)的炎症。虽然炎症也可能影响大脑，但其损伤与相关的病症多发性硬化(MS)中观察到的损伤不同。脊髓损伤引起不同程度的腿部或胳膊衰弱或麻痹、感觉丧失(包括失明)和/或膀胱和肠机能障碍。
[0032]NMO是一种与MS在几个方面类似的罕见疾病，但获得理想结果需要不同的治疗途径。NMO也被视为是一种不同形式的急性感染期脑脊髓炎。至少某些NMO患者的自免疫攻击对象已经被确认-它是一种称为水通道蛋白4或AQP4的神经系统细胞的蛋白。
[0033]NMO的主要症状是视力和脊髓功能的丧失。就其他视神经炎的病因学而言，视力损伤通常表现为视敏度的降低 ，尽管视野缺损或色觉丧失可能单独发生或在敏度正式丧失之前发生。脊髓机能障碍可导致肌肉衰弱、感觉减弱或膀胱和肠失控。典型患者具有腿部(下身轻瘫)或全部四肢(四肢轻瘫)的急性和严重的痉挛性衰弱和感觉征兆，常伴有膀胱的失控。
[0034]NMO与MS类似，因为都存在免疫介导的神经细胞周围髓磷脂的破坏。与标准MS不同的是，所述攻击并不靶向于产生髓磷脂的细胞(少突胶质细胞)或者主要由免疫系统的T细胞介导，而是由称为NMO-1gG的抗体(或简单地称为NMO抗体)介导。这些抗体靶向于位于星形胶质细胞的细胞膜上、作为跨膜转运水的通道的AQP4。发现AQP4参与包围血脑屏障的星形胶质细胞的活动，血脑屏障是阻止物质从血液进入大脑的系统。在NMO中，血脑屏障被削弱，但现在对于NMO-1gG的免疫反应如何导致少突胶质细胞死亡和脱髓鞘还是未知数。
[0035]大多数对NMO病理学的研究都聚焦在脊髓。脊髓损伤可以从炎症性的脱髓鞘到白质和灰质的坏死性损伤。NMO中的炎症损伤被分类为II型损伤(补体介导的脱髓鞘)，但它们在显著的血管周围分布上与MS II型损伤不同。因此，炎症模式经常与MS见到的截然不同。
[0036]梅奥诊所(Mayo Clinic)在2006年提出了 NMO诊断标准的修改版本。新的诊断指南要求以下两种绝对标准加上三种辅助性标准中的至少两种:
[0037]1.绝对标准:
[0038]视神经炎[0039]急性脊髓炎
[0040]2.辅助性标准:
[0041]疾病发作时脑部MRI不符合MS的标准
[0042]脊髓MRI连续T2-加权信号持续异常3个或更多脊椎段，指示相对较大的脊髓损伤NMO-1gG血清阳性状态。NMO-1gG测试检查抗水通道蛋白4抗原的抗体的存在
[0043]在开发了匪O-1gG测试之后，包括NMO在内的疾病谱系得到了扩展。现在据信NMO谱系包括:
[0044]?标准ΝΜ0,根据上述诊断标准
[0045].ΝΜ0限制型，例如单次或复发的纵向、广泛性脊髓炎，以及双边同时的或复发的视神经炎
[0046].亚洲视神经-脊髓MS，该变种可表现为类似MS的CNS牵连
[0047].与系统性自身免疫疾病相关的纵向、广泛性脊髓炎或视神经炎
[0048].与特定脑部区域，如下丘脑、室周核和脑干损伤相关的视神经炎或脊髓炎
[0049]对于NMO是一种独立的疾病还是广谱的多发性硬化中的一部分存在争论。通常，现在将NMO视为独立的神经炎症疾病。NMO不同之处在于，它在急性期之后通常比MS具有更严重的后遗症，MS很少表现为横贯性脊髓炎，且CSF中的寡克隆条带以及脑部MRI的白质损伤在Devic氏病中不常 见，但却在90%以上的MS患者中出现。近来发现，抗病毒免疫反应将多发性硬化和视神经脊髓炎区分开来。
[0050]基于某些患有共病状况(comorbid condition)的NMO患者的轶事证据(anecdoctal evidence)，NMO与许多系统性疾病相关。这些状况包括:胶原血管疾病、自身抗体综合征、带状疱疹病毒、EB病毒和HIV感染，以及暴露于氯碘羟喹和抗结核药物。
[0051]目前，NMO还不能治愈，但是其症状可以治疗。一些患者康复，但是许多患者遗留了可能是严重的视力和肢体损伤。用短期高剂量的静脉类固醇，例如甲泼尼龙IV治疗疾病的侵袭。当侵袭继续发展或者对类固醇治疗没有反应时，血浆交换术可能是有效的治疗。这些治疗的临床试验数目很少，而且多数没有设置对照。
[0052]没有一项设置了对照的试验能建立阻止侵袭的有效治疗。许多临床医生同意，为了降低侵袭的频率和严重程度，需要长期的免疫抑制，而其他则认为完全相反。常用的免疫抑制剂治疗包括硫唑嘌呤(Imuran)加强的松，麦考酚酸莫酯加强的松，利妥昔单抗，米托蒽醌，静脉内免疫球蛋白(IVIG)以及环磷酰胺。2007年，报道称NMO对格拉替雷乙酸酯和低剂量的类固醇有反应。通常，在几周内有一些提高的表现，但是残留的征兆和失能可能持续，有时甚至是严重的。
[0053]这种疾病可能是单相的，即单一发作后永久性缓解。但是，至少85%的患者有疾病复发形式，出现反复的横贯性脊髓炎和/或视神经炎侵袭。在单相形式的患者中，横贯性脊髓炎和视神经炎同时或彼此在几天之内出现。另一方面，复发形式的患者更可能在开始的侵袭之后几周或几月，并且在初始的横贯性脊髓炎事件后具有更好的运动功能恢复。约55%的患者通常在第一年的早期复发，而90%的在第一个5年内复发。与多发性硬化不同，NMO很少有继发性进展阶段，在该阶段，患者在侵袭之间有增强的神经衰退而没有缓解。相反地，急性侵袭后失能增加了。
[0054]大约20%的单相NMO患者有永久性视力丧失，而30%有一条或多条腿永久性麻痹。在复发性NMO的患者中，5年内有50%的患者患有麻痹或失明。在一些患者中(在一项研究中是33%)，颈部脊髓的横贯性脊髓炎导致呼吸衰竭和随后的死亡。然而，NMO的谱系由于诊断标准的改进已经变宽了，同时治疗的选择也增加了 ；因此，研究者们相信这些估计量将会变低。
[0055]NMO的流行和发生率还未建立起来，部分原因是该病没有得到很好的认识并且经常与MS混淆。NMO在女性中比在男性中普遍，女性占患者数的2/3多，而她们中超过80%有该病的复发。根据英国的Walton Centre, “NMO似乎出现在全球,不像MS那样在温带气候和白人中发病率高。非洲人和特别是远东地区的亚洲人可能有更高的NMO风险，虽然这种病的确切发病率还是未知数，这使得出具体的结论变得困难。”虽然许多患有NMO的人最初误诊为MS，35%的非洲裔美国人经常在他们确实患有NMO时被误诊为MS。NMO在亚洲人中比在高加索人中更普遍。事实上，亚洲的视神经-脊髓MS (在日本其构成了 30%的MS病例)被认为与NMO等同(在日本患者中视神经-脊髓和典型MS的不同)。在热带和亚热带地区的本土人口中，MS很少见，但是当它出现时它经常是视神经-脊髓MS的形式。大多数NMO患者没有被影响的亲属，因此通常认为它是非家族性疾病。
[0056]I1.产生单克隆抗体
[0057]A.常规方法
[0058]可以理解，与AQP4结合的单克隆抗体将在几个应用中具有用途。这些应用包括在检测和诊断NMO以及治疗NMO时使用的诊断试剂盒的生产。在这些情况中，可以将这些抗体与检测或治疗试剂相连，在竞争性试验中将它们用作捕获试剂或竞争剂，或者，独立使用它们而不添加与其相连的额外试剂。所述抗体可以如下所述进行突变或修饰。制备和鉴定抗体的方法是本领域公知的(参见如Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, 1988 ;美 国专利 4，196，265)。
[0059]生产单克隆抗体(MAb)的方法通常在开始时与制备多克隆抗体的方法相同。这两种方法的第一步是免疫合适的宿主或鉴定因之前的自然感染而免疫的受试者。本领域公知的是，用于免疫的给定组合物在其免疫原性方面可能不同。因此增强宿主的免疫系统常常是必须的，其可以通过将肽或多肽免疫原偶联在载体上而获得。范例的和优选的载体是钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白，如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。将多肽与载体蛋白连接的方法是本领域公知的，包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥拍酰亚胺酯、碳二亚胺(carbodiimyde)和双二氮化联苯胺(bis biazotized benzidine)。本领域同样公知的是,特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用称为佐剂的非特异性免疫反应诱发剂来增强。范例的和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包括灭活结核分枝杆菌的非特异性免疫反应诱发剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
[0060]生产多克隆抗体时使用的免疫原组合物的量根据免疫原的性质和用来免疫的动物而不同。多种途径可以用来施与免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的产生可以通过在免疫后的不同时点检测被免疫动物的血样来监测。也可进行第二次的、增强剂的注射。增强和滴度测定的过程可反复进行，直到达到合适的滴度。当达到要求的免疫原性水平时，从被免疫动物取血、分离和储存血清，和/或用该动物生产MAb。
[0061]本发明的重组抗体使用从受影响个体的CSF分离的单独的成浆细胞或b细胞生产。血液也可使用，虽然成浆细胞在该液体中不太多见。抗体重链和轻链序列通过RT-PCR鉴定。鉴定出的重链和轻链对然后用标准克隆技术重新工程化入表达载体并转染入哺乳动物细胞系来生产抗体。
[0062]通过上述方法之一生产的MAb都可以进一步被纯化，如果需要的话，通过使用过滤、离心和多种色谱法，例如FPLC或亲和层析法。本发明的单克隆抗体的片段可以从纯化的单克隆抗体得到，所用方法包括用酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，和/或通过化学还原断裂二硫键。或者，本发明涵盖的单克隆抗体片段可以用自动肽合成仪来合成。
[0063]也可以理解，分子克隆方法可用于生产单克隆抗体。对于这个方法，可以从杂交瘤细胞系分离RNA，通过RT-PCR获得抗体基因并克隆入免疫球蛋白表达载体。或者，用从细胞系分离的RNA制备组合免疫球蛋白噬菌粒库，并且表达合适抗体的噬菌体通过用病毒抗原淘选来筛选。与传统的杂交瘤技术相比，该方法的优点是在一轮中能够生产和筛选约104倍多的抗体，并且通过H和L链重组产生的新特异性进一步增加了找到合适抗体的机会。
[0064]其他教授本发明有用的抗体的生产方法的美国专利包括美国专利5，565，332，其描述了用组合方法生产嵌合抗体；美国专利4，816，567，其描述了重组免疫球蛋白制备；以及美国专利4，867，973，其描述了抗体治疗剂偶联物，其每一个均通过引用并入本文。
[0065]B.本发明的抗体
[0066]本发明的抗体首先可以通过其结合特异性，本发明中是AQP4来定义。本领域技术人员通过使用本领域技术人员公知的技术来评估给定抗体的结合特异性/亲和性，可以确定所述抗体是否落入本发明权利要求的范围。
[0067]一方面，提供了与AQP4结合的单克隆抗体。一种特定类型的抗体是缺少Fe相关的效应物功能的抗体。事实 上，由于抗APQ4的抗体是致病的，必须修饰这样的AQP4抗体以不但赋予其安全性，还赋予其保护性。这类抗体可以通过突变显示这样的功能的抗体的Fe区域(如IgGl或IgG2或IgG3),通过使用天然缺乏此类功能的抗体(IgG4),或通过化学修饰任何此类抗体来生产，以此使其在补体活化和免疫细胞募集中失效。
[0068]第二方面，可以通过抗体结合的结构区域来定义抗体。例如，AQP4的胞外表面和正交阵列为抗体结合提供了独特的平台。
[0069]第三方面，可以通过决定其结合特异性的可变序列来定义抗体。示例如下:
[0070]rAb53重链序列(可变区域)的核酸(SEQ ID N0:7):
[0071]CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCGCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTGGTCACTACTGGAACTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTACATCCATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTGGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCAGAGGGGAGAGGATGGAGTGCTTTCTACTACTACTACATGGAAGTCTGGGGCAAAGGGTCCACGGTCTCCGTCTCCTCA
[0072]rAb53重链序列(可变区域)蛋白质(SEQ ID NO:8):
[0073]QVQLQESGAGLVKPSETLSLTCTVSGGSISGHYWNWIRQPPGKGLEWIGYIHYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAEGRGWSAFYYYYMEVWGKGSTVSVSS
[0074]rAb53轻链序列(可变区域+IgK恒定区)核酸(SEQ ID NO: 5):
[0075]GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGACTGTTCGCACCAACTACTTAGCCTGGTTCCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCA
CCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGTGGACGTTCGGC
CAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT
GAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGG
ATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC
AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAG
TTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
[0076]rAb53轻链序列(可变区域+IgK恒定区)蛋白质(SEQ ID NO:6):
[0077]EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVRTNYLAWFQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPffTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0078]下述称为“突变体”的序列就是用在Fe突变体构建物中的序列。rAb-53的起源是IgG2分子，而用于构建突变体IgGlFc区域的克隆步骤保留了 5’IgG2Fc序列的某部分。在氨基酸水平，所述序列与IgGl在开始的35个氨基酸残基有4个氨基酸不同。在IgGl序列的末端，发明人加上了 FLAG标签(LEDYKDDDDK;SEQ ID N0:16)。因此，所述序列在技术上并不是人的IgGl ;它有14/340残基或者4%的不同。最终产物是突变的人IgGl。
[0079]突变体人IgGlFc K322 突夺核酸(SEQ ID N0:3): [0080]GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACTCGAGGACTACAAGGACGATGACGATAAGTGA
[0081]突变体人IgGlFc K322 突夺蛋白质(SEQ ID N0:4):
[0082]ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLEDYKDDDDK*
[0083]突变体人IgGlFc L234A/L235A 突夺核酸(SEQ ID NO:1):
[0084]GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCG
【权利要求】
1.一种治疗患有视神经脊髓炎谱系疾病的受试者的方法，其包括对所述受试者施与包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中所述试剂缺少完整抗体的效应物功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
3.根据权利要求1所述的方法，其中施与包括眼内、动脉内、皮下、静脉内施与或鞘内施与途径。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包括缺少效应物功能的突变Fe区域。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述突变的Fe区域包含具有L234A/L235A替换的IgGl序列ο
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述突变的Fe区域包含具有K322A替换的IgGl序列。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述突变的Fe区域包含具有G237A氨基酸替换的IgGl序列。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述突变的Fe区域包含具有L234A/L235A/G237A替换的IgGl序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂是IgG4抗体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包含化学修饰的Fe区域。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包含抗体Fab片段并缺少Fe区域。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包含与非抗体蛋白质片段融合的抗体Fab片段。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂包含单链抗体或F(ab’)2。
14.根据权利要求1所述的方法，其中治疗包括减少视网膜神经节细胞死亡、视神经损伤、脊髓损伤或轴突横断中的一项或多项。
15.根据权利要求1所述的方法，其中治疗包括减少视神经脱髓鞘、脊髓脱髓鞘、星形胶质细胞死亡或少突胶质细胞死亡中的一项或多项。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂施与一次以上，包括长期和每天。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂是在NMO发作时或之后施与。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述试剂在NMO发作的约lh、6h、12h、24h或两天内施与。
19.根据权利要求1所述的方法，其还包括施与所述受试者治疗NMO—个或多个方面的第二种试剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中第二种试剂与所述试剂同时施与。
21.根据权利要求19所述的方法，其中第二种试剂是在所述试剂之前或之后施与。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括根据SEQID N0:6的轻链可变序列或与SEQ ID NO:6具有80%同一性的序列，和根据SEQ ID N0:8的重链可变序列或与SEQ ID NO:8具有80%同一性的序列。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括根据SEQIDNO: 10的轻链可变序列或与SEQ ID NO: 10具有80%同一性的序列，和根据SEQ ID NO: 12的重链可变序列或与SEQ ID NO: 12具有80%同一性的序列。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括根据SEQIDNO: 19的轻链可变序列或与SEQ ID NO: 19具有80%同一性的序列，和根据SEQ ID NO: 17的重链可变序列或与SEQ ID NO: 17具有80%同一性的序列。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述轻链可变序列包括SEQID NO:5或与SEQIDNO: 5具有70%同一性的序列；所述重链可变序列包括SEQ ID NO: 7，或与SEQ ID NO: 7具有70%同一性的序列。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述轻链可变序列包括SEQID NO:9或与SEQIDNO: 9具有70%同一性的序列；所述重链可变序列包括SEQ ID ΝΟ:11，或与SEQ ID ΝΟ:11具有70%同一性的序列。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述轻链可变序列包括SEQID N0:20或与SEQID N0:20具有70%同一性的序列；所述重链可变序列包括SEQ ID NO:18，或与SEQIDNO: 18具有70%同一性的序列。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括实验室命名为rAb-53或rAb-58的抗体的抗原结合部分。
29.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含评估所述患者是否为阳性NMO-1gG(AQP4)的血清学。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者表现为阳性NMO-1gG(AQP4)血清学。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者表现为横贯性脊髓炎、视神经炎或其它非相关的神经功能障碍中的一项或多项。
32.根据权利要求29所述的方法，其中非相关的神经功能障碍包括持续的恶心或呕吐。
33.一种长期治疗受试者以阻止或减轻受试者视神经脊髓炎(NMO)谱系疾病的恶化的方法，其包括向所述受试者施与包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中所述试剂缺少完整抗体的效应物功能。
34.一种防止或抑制受试者中视神经脊髓炎(NMO)谱系疾病发展的方法，包括施与所述受试者包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中所述试剂缺少完整抗体的效应物功能。
35.一种包含抗水通道蛋白-4 (AQP4)抗体或其抗原结合片段的试剂，其中所述试剂缺少完整抗体的效应物功能。
36.根据权利要求35所述的试剂，其中所述试剂包含缺少效应物功能的突变Fe区域。
37.根据权利要求36所述的试剂，其中所述突变Fe区域包括具有L234A/L235A替换的IgGl序列ο
38.根据权利要求36所述的试剂，其中所述突变Fe区域包括具有K322A替换的IgGl序列。
39.根据权利要求36所述的试剂，其中所述突变Fe区域包括具有G237A替换的IgGl序列。
40.根据权利要求36所述的试剂，其中所述突变Fe区域包括具有L234A/L235A/G237A替换的IgGl序列。
41.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂是IgG4抗体。
42.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂包含化学修饰的Fe区域。
43.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂包含抗体Fab片段并缺少Fe区域。
44.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂包含与非抗体蛋白质片段融合的抗体Fab片段。
45.根据权利要求1所述的试剂，其中所述试剂包含单链抗体或F(ab’)2。
46.根据权利要求36所述的试剂，其中所述试剂是IgG2或IgG3抗体或其抗原结合片段。
【文档编号】A61K39/00GK103702682SQ201280030353
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年4月23日 优先权日:2011年4月21日
【发明者】杰弗里·L·班尼特, 格雷戈里·P·欧文斯, 艾伦·S·韦尔克曼 申请人:科罗拉多州立大学董事会法人团体, 加利福尼亚州立大学董事会法人团体