生物可吸收的创伤敷料的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含生长和分化因子蛋白的新型非织造织物。所述织物被专门设计来加速哺乳动物组织的组织再生和创伤愈合过程。此外，本发明提供了包含新型非织造织物的创伤敷料、衬垫或植入物。
【专利说明】生物可吸收的创伤敷料
[0001]本发明涉及,包含生长和分化因子蛋白的新型非织造织物(non-woven fabrics)。所述织物被专门设计来加速哺乳动物组织的组织再生和创伤愈合过程。此外，本发明提供包含新型非织造织物的创伤敷料、衬垫和植入物。
[0002]⑶F-5( HotteH 等人 1994，Biochem.Biophys Res.Commun.204，646-652)是已显示在几个组织中促进细胞增殖、分化和/或组织形成的形态发生素(morphogen)。所述蛋白质也称为形态发生蛋白MP52、骨形态发生蛋白-14(BMP-14)或软骨源形态发生蛋白-1 (CDMP-1)。⑶F-5与⑶F-6和⑶F-7密切相关。这3种蛋白质形成TGF-β超家族的独特亚组，从而显示相当的生物学性质和极高程度的氨基酸序列同一性(参见，Wolfman等人1997，J.Clin.1nvest.100, 321-330)。所有家族成员最初合成为更大的前体蛋白质，所述前体蛋白质随后在离C末端约110-140个氨基酸的一簇碱性残基处经历蛋白水解切割，从而从N末端前结构域(prodomain)释放C末端成熟蛋白质部分。成熟多肽在结构上相关并且包含含有6或7个经典半胱氨酸残基的具有生物活性的保守结构域，其负责这些蛋白质的特征性三维“胱氨酸结”基序。天然GDF-5相关蛋白质是同型二聚体分子并且主要通过与包含I型和II型丝氨酸/苏氨酸受体激酶的特异性受体复合物相互作用来起作用。受体激酶随后激活Smad蛋白，所述Smad蛋白随后将信号传播进入细胞核以调节靶基因表达。
[0003]已重复地显示，⑶F-5/-6/-7亚组的成员是骨和软骨的最重要的诱导剂和调节剂(Cheng 等人 2003, J.Bone&Joint Surg.85A, 1544-1552 ；Settle 等人 2003, Developm.Biol.254，116-130)。⑶F-5是神经系统的天然生长因子(参见例如W097/03188 ；Krieglstein 等人，(1995)J.Neurosci Res.42, 724-732 ；Sullivan 等人，(1997)Neurosci Lett233, 73-76 ;Sullivan 等人(1998)，Eur.J.NeuroscilO, 3681-3688)。此外，其例如用于调节皮肤 相关组织生长(W002/076494 ；Battaglia等人2002，Trans.0rthop.Res.Soc.27, 584)，和用于诱导血管生成过程(Yamashita 等人 1997, Exp.CellRes.235, 218-26)。
[0004]在发现它们的独特组织诱导活性后，生长因子蛋白例如⑶F-5已成功地用于治疗性研究和再生手术，其中它们单独地或与特定基质材料组合地促进和帮助各种受损组织的天然愈合过程。虽然已开发了几种包含具有生物学活性的成熟⑶F-5相关蛋白的药物组合物(参见例如W096/33215)，然而GDF-5的配制和处理仍然存在问题，因为成熟蛋白质倾向于与几种固体材料相互作用，并且在生理条件下显示异常差的溶解度。成熟⑶F-5/MP52的pH依赖性溶解度特征(即EP I 462 126中显示的)显示，蛋白质在pH高于4.25的水溶液中开始沉淀，并且在PH5与pH9之间变得几乎不溶。
[0005]为了创伤愈合目的，已开发了主要被设计来在半无菌条件下确保创伤闭合的具有多种形式、尺寸和材料的洗剂样和固体外科敷料。几种此类敷料由有机材料例如胶原制造，然而其它装置包含合成的组分例如无定型热塑性聚合物。最先进一代的一些创伤敷料特征在于额外的药物递送功能；它们能够施用生物活性物质例如抗生素或细胞因子样表皮生长因子(EGF)或血小板衍生生长因子(roGF/Becaplermin)。例如，基因工程改造的I3DGF可在
商品名霞egranex?下作为局部(ο.οι%)创伤愈合凝胶商购获得，其已被批准用于治疗扩展至皮下组织或更深处的糖尿病足溃疡。
[0006]对于创伤愈合和其它组织再生目的特别期望的是，籍以将生长和分化因子蛋白递送至人体的新型织物。因而本发明的目的是，通过提供新型创伤愈合材料和装置改善GDF-5及相关蛋白的治疗可用性。
[0007]生物可降解创伤敷料描述于EP 2 042 199中。描述的创伤敷料由包含纤维原料的纤维的非织造织物制造，其中纤维包括至少一种生物学活性物质。特别地建议抗微生物物质或抗生素作为生物学活性物质。
[0008]在用于改善GDF-5及相关蛋白的治疗可用性的研究过程中，本申请的发明人令人惊讶地发现，EP2042199中描述的包含纤维原料的纤维的非织造织物特别适合于将生长和分化因子蛋白递送至人体。GDF-5与生物可吸收的非织造物(non-wovens)的组合显示了出人意料的对于应用⑶F-5的有益效果。生物可降解非织造物为⑶F-5提供基底，其显示增加的成熟蛋白的释放与良好的操作性质。该组合允许以局部的方式控制GDF-5的施用，从而使得生长因子能够在期望的药物作用部位起作用。除了该空间控制以外，还可在期望的时期例如数天内，从生物可降解非织造物洗脱增加产率的生物学活性GDF-5。由于将GDF-5包含在非织造织物中，因此克服了 PH依赖性沉淀作用，并且与固体材料的相互作用被减小至最低程度。
[0009]因此，本发明的主题是包含含有生物可吸收聚合物的纤维原料的纤维的非织造织物，所述纤维包含至少一种分布在纤维中的生物学活性物质(其为GDF-5相关蛋白)。
[0010]定义:
[0011]为了避免误解和不清楚，如下定义和举例说明了本文中一些频繁使用的术语:
[0012]如本文中所用，术语“胱氨酸结结构域”意指，存在于TGF-β超家族蛋白例如人GDF-5的成熟部分中并且形成称为胱氨酸结的三维蛋白质结构的公知的保守的富含半胱氨酸的氨基酸区域。在该结构域中，半胱氨酸残基彼此的相对位置是非常重要的，并且只允许微小变化以免丧失生物学活性。已显示，单独的胱氨酸结结构域足以发挥蛋白质的生物学功能(Schreuder 等人(2005), Biochem Biophys Res Commun.329，1076—86)。胱氨酸结结构域的共有序列在现有技术中是公知的。根据本文中的定义，蛋白质的胱氨酸结-结构域始于参与各自蛋白质的胱氨酸结的第一个半胱氨酸残基，并且终于在最后一个参与各自蛋白质的胱氨酸结的半胱氨酸之后的残基。例如人GDF-5前体蛋白(SEQ ID NO: 2)的胱氨酸结结构域由氨基酸400-501组成(也参见图1)。
[0013]如本文中所用，术语“⑶F-5相关蛋白”意指，与人生长/分化因子5 (h⑶F-5)非常密切相关的任何天然发生的或人工产生的蛋白质。所有GDF-5相关蛋白的共同特征是，与人⑶F-5的102aa的胱氨酸结结构域(SEQ ID NO: 2的氨基酸400-501)具有至少60%的氨基酸同一性的胱氨酸结-结构域的存在，所述结构域足以发挥蛋白质的生物学功能。术语〃⑶F-5相关蛋白〃包括，属于来自脊椎动物或哺乳动物物种的⑶F-5、⑶F-6和⑶F-7的组的蛋白质以及其重组变体，只要这些蛋白质显示与人GDF-5的胱氨酸结-结构域具有上述百分比同一性。60%的极限值非常适合于分离蛋白质的⑶F-5/-6/-7组的成员以及来自其它蛋白质例如关系更远的⑶F和BMP的其变体。人⑶F-5、人⑶F-6和人⑶F-7的102aa的胱氨酸结-结构域的比较(参见图2)显示，这些蛋白质之间高等级的氨基酸同一性。人⑶F-6与人⑶F-5的胱氨酸结-结构域共有87个(85%)相同残基，人⑶F-7与人⑶F-5的胱氨酸结-结构域共有83个(81%)相同残基。迄今已被鉴定的来自其它脊椎动物和哺乳动物物种的GDF-5/-6/-7分子的各自结构域，当与人GDF-5相比较时，也显示至少75%的极高的百分比同一性(在79%至99%之间)。相反地，不属于⑶F-5/-6/-7亚组的⑶F和BMP显示低于60%的低得多的同一性值(参见图3)。
[0014]相关氨基酸序列中对应氨基酸位置的确定以及百分比同一性的计算可借助于公知的比对算法和任选地使用这些算法的计算机程序来容易地进行。例如，本专利申请中的氨基酸同一性(即图2)已通过使用免费软件程序Clustaixa 81版)，利用缺省参数比对序列，以及随后手工计数相同残基来计算。用于配对比对(慢-准确)的缺省设置是:缺口开放参数:10.00 ;缺口延伸参数0.10 ;蛋白质加权矩阵:Gonnet250。ClustalX 程序详细地描述于 Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F.和 Higgins, D.G.(1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies formultiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic AcidsResearch24:4876-4882中。ClustalX是用于ClustalW多序列比对程序的窗口界面，并且可从各种来源获得，例如通过匿名 ftp 从 ftp-1gbmc.u-strasbg.fr、ftp.embl-heidelberg.de、ftp.eb1.ac.uk 获得或通过从下列网页下载获得:http://www-1gbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ο Clustalff 程序和算法也详细地描述于 Thompson, J.D., Higgins, D.G.和Gibson,T.J.(1994):CLUSTALff:1mproving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penaltiesand weight matrix choice.Nucleic Acids Research22:4673-4680 中。[0015]特别优选的⑶F-5相关蛋白显示，与人⑶F-5的102aa的胱氨酸结结构域具有至少70%、80%、90%或95%的氨基酸同一性。
[0016]脊椎动物和哺乳动物GDF-5相关蛋白的非限定性实例是:人GDF-5的前体和成熟蛋白(在W095/04819中公开为MP52以及在Kttefl等人1994，Biochem.BiophysRes.Commun.204，646-652 中公开为人 GDF-5)、重组人(rh)⑶F-5/MP52 (W096/33215)、MP52Arg(W097/06254) ；HMW 人 MP52 (W097/04095)、CDMP-1 (W096/14335)、小鼠(小家鼠(Mus musculus))GDF-5 (US5, 801，014)、兔(日本大耳白兔(Oryctolagus cuniculus))GDF-5 (Sanyal 等人 2000, Mol Biotechnol.16,203-210)、鸡(原鸡(Gallus gallus))⑶F-5(NCBI登录号NP_989669)、非洲爪蛙(光滑爪蟾(Xenopus Iaevis))⑶F_5 (NCBI登录号 AAT99303)、单体 GDF-5 (W001/11041 和 W099/61611)、人⑶F-6/BMP-13 (US5, 658，882)、小鼠⑶F-6(NCBI 登录号咿_038554)、0^-6/0)1^-2(而96/14335)、人 GDF-7/BMP-12 (US5, 658，882)、小鼠⑶F_7 (NCBI 登录号 AAP97721)、⑶F-7/CDMP-3 (W096/143335)。本发明还包括具有额外突变例如置换、添加和缺失的⑶F-5相关蛋白，只要这些额外突变不完全消除蛋白质生物学活性。一些优选变体是具有改善的生物学活性的GDF-5相关蛋白的突变体。例如，通常存在于人⑶F-5前体蛋白中的一个或多个残基(参见图1)在这些突变体中被其它氨基酸置换:人GDF-5前体的位置438上的精氨酸被甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或天冬酰胺置换；和/或丝氨酸439被天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸置换；和/或天冬酰胺445被丝氨酸或苏氨酸置换。在另一个具有高度活性的突变体中，甲硫氨酸453和/或甲硫氨酸456被丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸置换。特别有益的还有，其中亮氨酸441被脯氨酸置换的突变体。[0017]如本文中所用，术语“变体”意指任何下列多肽:
[0018]a)蛋白质的生物学活性片段，优选至少包含胱氨酸结结构域；
[0019]b)除了蛋白质的原始序列外还包含额外序列(增加或未增加生物学功能)的生物学活性蛋白质构建体或包含氨基酸置换的构建体；
[0020]c) a)和b)的任意组合。
[0021]术语“生物学活性”表示，化合物(包括例如⑶F-5相关蛋白)的活性，如通过常用的体外碱性磷酸酶测定(ALP)(例如，实施例8中或Takuwa等人(1989)，Am.J.Physiol.257，E797-E803中描述的)所测量的。可用于此类ALP测定的适当的细胞系是例如ATDC-5或MCHTI/26细胞。
[0022]本发明的非织造织物可具有不同的形式、形状、样式或设计。例如，非织造织物可以是创伤敷料、创伤衬垫、植入物或填塞物。
[0023]本发明的主题是包含含有生物可吸收和/或生物相容性聚合物的纤维原料的纤维的非织造织物，所述纤维包含至少一种生物学活性物质，其中生物学活性物质是⑶F-5相关蛋白。GDF-5相关蛋白分布在纤维中。任选地，纤维上可存在另外的GDF-5相关蛋白。
[0024]本发明人令人惊讶地发现，GDF-5相关蛋白可掺入纤维内，尽管它们具有相对高的疏水性。甚至非糖基化GDF-5相关蛋白可令人惊讶地、良好地被掺入包含生物可吸收和/或生物相容性聚合物的纤维原料的纤维。 [0025]通过将GDF-5相关蛋白掺入纤维的内部部分，蛋白质的稳定性得以增强。如果随后将纤维经历无菌处理(例如使用Y-辐照)，则蛋白质尤其得以保护。由于其位于纤维内部部分，因此蛋白质也得到保护而免受蛋白酶降解。此外，长期贮存能力得到增强。尤其在更高的温度例如室温下，蛋白质的贮存能力相较于在纤维的表面上包含GDF-5相关蛋白的纤维得到提高。此外，通过选择用于原料的适当聚合物，可控制GDF-5相关蛋白从纤维内部部分的释放，例如以快速释放活性物质或更慢地释放活性物质。
[0026]根据本发明，纤维原料优选选自天然聚合物、合成聚合物和来源于化石原料的聚合物。这些材料各自可以是经修饰的或未经修饰的。
[0027]根据本发明的"天然聚合物"是来源于生物来源(例如基于植物、动物、真菌或细菌的材料)的聚合物。该术语包括处理后的和化学修饰的聚合物。根据本发明的优选实施方案，天然聚合物选自多肽、多糖、多羟基酯和多核苷酸。
[0028]特别适合的是天然聚合物，例如多肽如胶原、明胶、血纤蛋白、酪蛋白，或多糖葡聚糖、纤维素、淀粉、壳多糖、壳聚糖、透明质酸和藻酸盐或酯，以及合成聚合物如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)，以及其任意组合。
[0029]根据本发明的优选实施方案，非织造织物是“生物可吸收的”。这表示，非织造织物在身体中或身体上被降解。此类材料优选在完成吸收后不必除去，且通常与身体特别良好地相容。
[0030]根据本发明的“生物相容性”材料是，能够在特定的应用中进行且具有适当的宿主应答的材料。此类材料优选不引发或几乎不引发给定生物体中的免疫应答，或能够与特定细胞类型或组织整合。
[0031]在其它优选实施方案中，非织造织物是生物可吸收的和/或生物相容性的。
[0032]生物可降解或生物可吸收的聚合物是例如，来自藻类的藻酸盐/酯、天然多糖如葡聚糖、来自植物的聚合物淀粉和纤维素、动物聚合物如胶原、明胶、壳多糖、酪蛋白、聚缩酚酸肽(polyd印sip印tides)、细菌聚合物如多羟基酯、特别地多羟基丁酸酯和-戊酸酯、基于植物油的合成聚合物例如聚乳酸、聚乙二醇酸、聚酰胺和聚氨基甲酸酯，以及化石原料的聚合物如聚-ε -己内酯、聚乙烯醇、聚酯、聚乙烯琥珀酸盐/酯和-草酸盐/酯、聚酯酰胺和聚二恶烷酮。
[0033]此外，可将不溶性物质分散入聚合物基质。特别地，无机物例如羟基磷灰石和/或b-磷酸三钙颗粒经显示适合于该目的。
[0034]根据本发明的织物是非织造材料。这些材料优选不被压缩。
[0035]可通过EP2042199中描述的旋转纺丝法(rotational spin method)将纤维的直径确立在狭窄分布内。可产生具有平均0.1-500 μ m，优选3-300 μ m，更优选5-100 μ m的直径的纤维，所述纤维相互形成部分网络。纤维直径的狭窄分布允许形成非织造织物的均匀稳定的结构，而无需昂贵的额外粘合手段，同时允许生物学活性物质如GDF-5(其均匀地分布在纤维上或纤维内)的受控释放。
[0036]一些纤维可被扭曲或彼此交织或可具有扭曲的结构。扭曲或交织额外地增强非织造织物的强度和拉伸行为。
[0037]一些纤维可彼此交织并且可形成一个或多个纤维束。通过单独的纤维的交织，可将这些纤维组合成纤维束，并且这些纤维可相对彼此可逆地移位。因此，可拉伸非织造织物而无破坏。由于拉伸的原因，单独的纤维事实上被拉扯并且相对于其它纤维被移位。扭曲和交织甚至促进纤维返回至它们在拉伸前的位置。因此，非织造织物即使在潮湿状态下亦显示高的维度稳定性(dimensional stability)。
[0038]可以通过化学方法、辐射或物理处理例如去氢热处理(DHT)来修饰织物，以改变织物特征。此类修 饰可包括纤维或聚合物的交联，以控制织物特征例如稳定性、降解或生物吸收性。
[0039]可将⑶F-5相关蛋白均匀地分布在纤维中。因此，可建立具有长效作用的⑶F-5相关蛋白的逐渐释放。
[0040]GDF-5相关蛋白可以以纳米级水平存在于纤维中。纳米级结构被理解为意指，具有在纳米范围内的尺寸(至少在一个空间方向上)的任何形态学的区域。因此，GDF-5相关蛋白获得高流动性。以纳米级水平存在的GDF-5相关蛋白显示特别高的反应性。此外，非织造织物非常容易地将⑶F-5蛋白释放至与其接触的介质。因此，非织造织物的特征在于，对于GDF-5相关蛋白的高释放能力。
[0041]根据本发明的另一个实施方案，可将额外的GDF-5相关蛋白分布在纤维上。这允许用⑶F-5相关蛋白喷射非织造织物以确保快速释放至人体。特别优选地，⑶F-5相关蛋白存在于纤维中和纤维上。
[0042]在本发明的优选实施方案中，将GDF-5相关蛋白与适当的载体、稳定剂或下文中描述的其它补充剂组合地掺入非织造织物。
[0043]至少一部分纤维可以以纳米纤维的形式存在。该形式的非织造织物可制造得特别轻薄。
[0044]非织造织物可具有拥有0.01至1001/min x cm2的透气性(该参数是根据DIN9237确定的)的开孔结构。此类非织造织物特别适合用作敷料，因为其使得皮肤能够释放湿气和呼吸。
[0045]本发明的非织造织物的生产优选按照例如EP2042199中描述的旋转纺丝法来实现。为了执行旋转纺丝法，优选如德国专利申请DE102005048939中所述使用装置或容器。
[0046]包含GDF-5相关蛋白的本发明的非织造织物特别适合用于医疗部门，因为它们在织物结构和材料组成方面可非常容易地进行改变。因此，本发明的另一个实施方案是非织造织物，优选创伤敷料、创伤衬垫或包含根据本发明的非织造织物的植入物。
[0047]一般而言，本发明的织物可用于所有此类情形，在所述情形中，与由包含含有生物可吸收聚合物的纤维原料的纤维的非织造织物制造的装置组合的上述重组和野生型GDF-5形式的贮存和/或递送是有用的。因此，本发明可用于促进各种组织和器官的再生。例如，⑶F-5被认为是骨和软骨形成以及结缔组织形成(参见例如W095/04819，Hotten等人 1996, Growth Factorsl3, 65-74 ；Storm 等人 1994, Nature368, 639-643 ；Chang 等人1994，J.Biol.Chem.269，28227-28234)和结缔组织连接的形成(EP0831884)的非常有效的促进剂。在该背景中，GDF-5对于涉及骨元件之间的关节的应用是特别有用的(参见例如 Storm&Kingsleyl996, Developmentl22, 3969-3979)。结缔组织的一个实例是腱和韧带(Wolfman 等人 1997, J.Clin.1nvest.100, 321-330 ；Aspenberg&Forslundl999, ActaOrthop Scand70, 51-54 ;W095/16035)。该蛋白质有助于半月板和脊柱/椎间盘修复(Walsh 等人 2004，Spine29, 156-63)以及脊柱融合应用(Spiro 等人 2000，Biochem SocTrans.28，362-368)。⑶F_5可有益地用于牙齿(牙和牙周)应用(参见例如W095/04819 ；W093/16099 ;Morotome 等人 1998，Biochem Biophys Res Comm244, 85-90),例如牙本质或牙周韧带的再生。⑶F-5也可用于任何类型的创伤修复。其还有益地促进神经元系统的组织生长以及例如多巴胺能神经元的存活。在此背景中，⑶F-5可用于治疗神经变性障碍如帕金森疾病和阿尔茨海默病或亨廷顿舞蹈症组织(参见例如W097/03188 ；Krieglstein 等人，(1995) J.Neurosci Res.42，724-732 ;Sullivan 等人，(1997)NeurosciLett233, 73-76 ;Sul`livan 等人(1998)，Eur.J.NeuroscilO, 3681-3688)。GDF-5 允许维持神经功能或保持已损伤的组织的神经功能。⑶F-5从而被认为是普遍适用性神经营养因子。其还可用于眼疾病，特别地视网膜、角膜和视神经疾病(参见例如W097/03188 ;You等人(1999)，Invest Opthalmol V is Sci40，296-311)，用于毛发生长以及治疗和诊断皮肤相关障碍(W002/076494 ；Battaglia 等人 2002，Trans.0rthop.Res.Soc.27，584)，以及用于诱导血管生成(Yamashita 等人 1997，Exp.Cell Res.235，218-26)。
[0048]因此，其中可应用本发明的优选适应症是创伤愈合。本发明特别适合于促进烧伤、皮肤病损、皮肤损伤或皮肤移植、糖尿病性创伤和糖尿病性溃疡例如糖尿病性足溃疡的治疗。
[0049]其中可应用本发明的其它非限定性实例是，预防或治疗与骨和/或软骨损伤相关的疾病，或影响骨和/或软骨的疾病，或通常地其中期望软骨和/或骨形成的状况，或用于脊柱融合术，预防或治疗与下列相关的损伤或患病组织:结缔组织包括腱和/或韧带、牙周或牙齿组织包括牙植入物、神经组织包括CNS组织和神经病理学状况、感觉系统的组织、肝、胰腺、心脏、血管、肾、子宫和甲状腺组织、黏膜、内皮、上皮，用于促进或诱导神经生长、组织再生、血管生成，祖细胞和/或骨髓细胞的增殖的诱导，用于维持增殖或分化状态以治疗或保持用于器官或组织移植的组织或细胞，用于胃肠衬里的完整性，用于治疗能育性、避孕或怀孕的干扰。关于感觉器官如眼的疾病也包括在根据本发明的药物组合物的优选适应症中。作为神经元疾病，再次地以帕金森病和阿尔茨海默病作为实例。
[0050]⑶F-5相关蛋白的生物学活性可借助于已建立的测试系统来容易地测定。最有用和优选的是称为碱性磷酸酶(ALP)测定的常用体外测试(Takuwa等人1989，Am.J.Physiol.257，E797-E803)。已证明，⑶F-5 相关蛋白在 R0B-C26 细胞(Yamaguchi 等人1991，Calcif.Tissue Int.49，221-225)(如 W095/04819 中描述的)、胚胎ATDC5 细胞(RikenGene Bank, R0B0565)、小鼠间质 MCHT-1/26 细胞以及 HPDL 细胞(如 Nakamura 等人 2003，J.Periodontal Res.38，597-605中显示的)中增加碱性磷酸酶活性。
[0051]应当依赖于施用模式和时间选择本发明的组合物中的GDF-5相关蛋白浓度。基本上，GDF-5相关蛋白是能够甚至以稀少的量引发效应的高效力细胞因子。由于可借助于不同的生物学测定系统例如本文中描述的碱性磷酸酶测定来容易地确定，因此，0.1pg⑶F-5/ml各自溶液的浓度足以引起生物学作用。因此，如果重复施用本发明的组合物，则低浓度(即范围为0.lpg/ml至lng/ml或更少)是优选的。然而，利用l-100ng/ml的更高生长因子浓度，可获得最大作用。利用宽范围的连续稀释物(0.3-80ng/ml，Farkas等人1997，Neurosc1.Lett.236，120-122)进行的⑶F-5作用的独立剂量响应分析在20ngGDF_5/ml的浓度上产生最佳结果。体内皮肤模型通常使用l-ΙΟμ g/ml的高剂量。因此，在本发明的优选实施方案中，本发明的组合物以0.lpg/ml至10 μ g/ml的浓度包含GDF-5相关蛋白。在单次施用的情况下，⑶F- 5相关蛋白的优选总剂量为IOng至10 μ g。
[0052]本发明的其它方面涉及本文中公开的另外的成分和组分。
[0053]此外，织物可包含天然及合成脂质。可使用所有类型的天然及合成油/脂质，只要它们是生物相容性的，例如合成油或饱和酯例如棕榈酸乙酯、棕榈酸异丙酯、肉豆蘧酸烷酯例如异丙酯、丁酯和鲸蜡酯、硬脂酸己酯、甘油三酯(例如辛酸或癸酸的甘油三酯、中链甘
油三酯例如Miglyol? 812)、蓖麻油酸十六酯、硬脂酰辛酸酯(purcelllin油)和氢化聚
异丁烯，或天然油例如棉籽油、大豆油、芝麻油、向日葵油、红花油、橄榄油、鳄梨油、花生油、核桃油、杏仁油和榛子油。
[0054]织物还可包含乳化剂例如磷脂例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺、蒸馏甘油单酯、甘油单酯和二酯、甘油单酯的醋酸酯、甘油单酯的有机酯、脂肪酸的脱水山梨糖醇酯、脂肪酸的丙二醇酯和脂肪酸聚甘油酯。
[0055]除了 GDF-5相关蛋白以外，其它生物学活性蛋白质也可以是本发明的织物的部分。已显示TGF-β增加再生真皮的尺寸并且稳定真皮上皮连接(dermoepithelialjunction)(Fitzpatrick and Rosen, J.Cosmet.Laser Ther, 5:25-34(2003))。在多中心研究中测试了包含7种来源于新生儿包皮成纤维细胞的细胞因子(VEGF、IL-6和-8、HGF、PDGF-a、GCSF 和 TGF-β I)的混合物(TNS Recovery Complex, SkinMedica, Inc.Carlsbad, CA, USA)。评价结果显示，皮肤纹理的改善，和减少的皱纹(Rokhsar, C.K.等人，Dermatol.Surg.31:1166-1178(2005))。重组表皮生长因子(ReVive Skincare);和N-糠基腺嘌呤(激动素)植物生长因子也在市场上销售。可将所有这些蛋白质与本发明的GDF-5相关蛋白一起使用。当与GDF-5相关蛋白组合时可协同作用的其它蛋白质公开于文献/专利中，例如W099/15191中。优选的是神经营养因子、刺猬蛋白和转化生长因子家族的蛋白质，包括但不限于TGF-α ,TGF-β、激活素、BMP和⑶F。尤其优选的是与EGF、TGF_ β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、NGF和/或⑶NF之任一的组合。
[0056]织物中其它可接受的组分是:
[0057]-类视黄醇(维生素A衍生物)，其保持黏膜/上皮表面的完整性；
[0058]-羟酸(有机羧酸进一步分类成α羟酸(AHA)和β羟酸(BHA))，其增强表皮脱落，例如乙醇酸、乳酸、柠檬酸、扁桃酸、苹果酸和酒石酸；
[0059]-抵消自由基的有害作用的抗氧化剂，例如维生素C、维生素Ε、泛醇、硫辛酸、泛醌、烟酰胺、二甲基氨基乙醇、自旋肼(spin trap)、褪黑激素、过氧化氢酶、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、吡喃葡萄糖苷、多酚、半胱氨酸、尿囊素、糠基腺嘌呤、尿酸和肌肽；
[0060]-减缓色素沉着过度的脱色剂，例如N-乙酰基-4-S-半胱胺基酚(N-acetyl-4-S-cysteanimylphenol)、曲酸、熊果苷、杜醇花酸(azaleic acid)、构树(paper-mulberry)化合物、化学剥脱剂(间苯二酹、水杨酸)、Kligman制剂、Pathak制剂和Westerhof制剂；
[0061]-植物性药，例如春黄菊、人参、二叶银杏、姜黄素、甘草皂苷、辣椒辣素和芦荟；
[0062]-糖胺聚糖，其支持表皮再生，例如透明质酸；
[0063]-抗蜂窝组织药(Anticellulites)，其介导脂解，例如β-肾上腺素能刺激剂例如可可碱、茶碱、氨茶碱、咖啡因、肾上腺素和α 1-肾上腺素能刺激剂例如育亨宾、哌氧环烷和酚妥拉明；
[0064]-激素，例如雌激素、孕酮、睾酮和生长激素；
[0065]-抗微生物剂，例如三氯生、氯己定、聚维酮碘、过氧化氢、抗头皮屑制剂(Antidandruff preparations)、批硫锋(zinc pyrithione)；
[0066]-化学UV滤器，例如3-苯亚甲基樟脑(3-BC)或4_甲基苯亚甲基樟脑(4-MBC);
[0067]-此外缓冲剂、稳定剂、防腐剂、还原剂、抗氧化螯合剂、改变等渗性的试剂、除臭剂、麻醉剂、佐剂和增溶添加剂。
[0068]这些仅是可能的添加剂的非限定性实例，本领域技术人员可容易地添加目前使用的、通常被认为是安全的其它赋形剂。关于用于配制药物组合物和选择药学上可接受的物质的方法的更多信息，请参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences (luth ed.；Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990), Wang 等人(1980)，J.Parent.Drug Assn.34(6):452-462(1980) ;Wang 等人(1988), J.Parent.Sc1.and Tech.42:4-26 ；Lachman 等人(1968), Drug and Cosmetic Industryl02(I):36-38，40 和 146-148;和Akers (1988)J.Parent.Sc1.and Tech.36 (5):222-228。
[0069]优选在与体液、血浆、介质或缓冲液接触的3至7天期间，从非织造织物洗脱1%至100%的生物学活性物质。最优选在生理条件下(PBS缓冲液，10%胎牛血清，37°C)下释放10%至100%的生物学活性物质。
[0070]下列附图、实施例和序列方案用于进一步举例说明本发明。
[0071]SEQ ID NO:1显示人⑶F-5前体的DNA序列，SEQ ID N0:2显示其蛋白质序列。
[0072]SEQ ID NO:3显示人成熟单体⑶F-5的DNA序列，SEQ ID N0:4显示其蛋白质序列。
[0073]附图
[0074]图1显示根据SEQ ID NO: 2的人⑶F_5前体蛋白质的其它特性:[0075]aaOOl-381 前原结构域(pre-prodomain)(粗体字母)
[0076]aa001-027信号肽(粗体和加以下划线的)
[0077]aa382_501成熟蛋白质部分
[0078]aa400-501胱氨酸结-结构域(加以下划线的)
[0079]图2显示人⑶F-5 (SEQ ID NO: 2)、人⑶F-6 (来自美国专利N0.5，658，882的序列26)和人⑶F-7(来自美国专利N0.5，658，882的序列2)的102aa的胱氨酸结结构域的比较。在所有3个分子中相同的氨基酸残基加以边框突出显示。
[0080]图3显示了表，所述表显示几个已知的BMP和⑶F的胱氨酸结结构域与人⑶F_5的胱氨酸结-结构域的序列同一性。
[0081]图4显示具有rh⑶F-5的Y灭菌的明胶/透明质酸非织造物的显微图像(标尺200 μ m)。
[0082]图5显示Y灭菌的明胶/透明质酸非织造物的显微图像(标尺200 μ m)。
[0083]图6显示从快速释放非织造材料明胶、明胶/透明质酸和明胶/I型胶原释放的GDF-5的生物学活性。如实施例1所述，使用碱性磷酸酶活性测定利用小鼠间质MCHT1/26细胞测量⑶F-5的生物学活性。用4.8-1200ng/ml的溶解于IOmM HCl的⑶F-5刺激MCHT1/26细胞(标准曲线)。
[0084]通过将非织造物直接置于MCHT1/26细胞上，并且平行地使用条件培养基(通过在37°C于细胞培养基中释放⑶`F-53天产生的)分析来自非织造材料的⑶F-5释放。将ALP活性测量为在405nM处的对硝基酚磷酸至对硝基苯酚盐的转化。数据为3个独立测量的平均值。
[0085]附表显示计算的从对应非织造物释放的⑶F-5的浓度(ng/ml)以及以百分比显示的⑶F-5回收。为了进行计算，假定2yg涂覆在非织造物上的⑶F-5完全释放在160 μ I细胞培养基中，这对应于12500ng/ml的⑶F_5浓度(直接在细胞上测试的利用非织造物的测定的100%释放值)。在细胞上定量条件培养基的情况下，40 μ I释放细胞培养基对应于2500ng/ml的GDF-5浓度(在细胞上测试的利用条件细胞培养基的测定的100%释放值)。
[0086]图7显示从缓释非织造材料聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯和明胶/羟基磷灰石释放的GDF-5的生物学活性。如实施例1中所述，在小鼠间质MCHT1/26细胞上使用碱性磷酸酶活性测定测量⑶F-5的生物学活性。利用4.8-1200ng/ml的溶解于IOmM HCl中的⑶F-5刺激MCHT1/26细胞(标准曲线)。
[0087]通过将非织造物直接置于MCHT1/26细胞上，以及平行地利用条件培养基(通过在37°C于细胞培养基中释放⑶F-53天产生的)分析来自非织造材料的⑶F-5释放。将ALP活性测量为在405nM处的对硝基酚磷酸至对硝基苯酚盐的转化。数据为3个独立测量的平均值。
[0088]附表显示计算的从对应非织造物释放的⑶F-5的浓度(ng/ml)以及以百分比显示的⑶F-5回收。为了进行计算，假定2 μ g⑶F-5完全从非织造物释放在160 μ I细胞培养基中，这对应于12500ng/ml的⑶F_5浓度(直接在细胞上测试的利用非织造物的测定的100%释放值)。在细胞上定量条件培养基的情况下，40 μ I释放细胞培养基对应于2500ng/ml的GDF-5浓度(在细胞上测试的利用条件细胞培养基的测定的100%释放值)。
[0089]图8显示在利用Y辐照灭菌之前和之后从非织造材料释放的⑶F-5的生物学活性和回收。在小鼠间质MCHT1/26细胞上使用碱性磷酸酶活性测定测量生物学活性。利用⑶F-5特异性夹心ELISA定量从非织造物释放的⑶F-5的回收。通过在37°C将非织造物置于细胞培养基中24小时来分析来自非织造材料的GDF-5释放。将等量的无非织造材料的GDF-5在相同条件下于细胞培养基中温育，并用作阳性对照。将ALP活性测量为在405nm处的对硝基酚磷酸至对硝基苯酚盐的转化。数据为3个独立测量的平均值。对于ELISAJfGDF-5的回收定量为结合至生物素化第二抗体的链霉亲和素-辣根-过氧化物酶的量。通过底物四甲基联苯胺二盐酸盐的酶促转化，随后在450nm进行光度测定法来进行检测。
[0090]表格显示通过ALP活性测定测量的、以百分比显示的计算的生物学活性(将阳性对照的OD值设置为100%)。对于ELISA数据，该表显示以百分比给出的来自非织造材料的⑶F-5的回收。为了进行计算，假定200ng掺入非织造材料的⑶F-5完全释放在200 μ I细胞培养基中，这对应于1000ng/ml的⑶F-5浓度(100%值)。
[0091]图9显示于室温、4°C和-80°C贮存I天至3个月的时期的、掺入非织造物的灭菌的GDF-5的稳定性研究的结果。第O天是稳定性研究的起始点。通过利用GDF-5特异性夹心ELISA测量从灭菌的非织造物释放的⑶F-5的回收来研究⑶F-5的稳定性。通过在37°C将非织造物置于细胞培养基中24小时来分析来自非织造材料的GDF-5释放。将确定量的释放培养基转移至ELSIA系统，其中将GDF-5的回收定量为结合至生物素化第二抗体的链霉亲和素-辣根-过氧化物酶的量。通过底物四甲基联苯胺二盐酸盐的酶促转化，随后在450nm进行光度测定法来进行检测。该表显示根据释放的GDF-5计算的、以百分比显示的来自非织造材料的⑶F-5回收。
实施例
[0092]实施例1:显示 快速⑶F-5释放特征的非织造物
[0093]如下产生显示快速⑶F-5释放的非织造物(其由纯明胶、明胶和透明质酸或明胶和I型胶原组成):
[0094]通过将明胶与水混合来制备22.5%(w/w)的A型PIGSKIN明胶(GelitaAG, Eberbach, Germany)水溶液。将该混合物在室温保持I小时以膨胀。随后，在60°C用超声处理明胶溶液I小时，加热至80°C。将溶液在80°C维持2小时，再次冷却至60°C。取决于期望的非织造物组成，将12.5%(重量/重量明胶)透明质酸(cristalhyal, Soliance, France)或 I 型胶原凝胶(DM04, Devro Medical, Australia)混合至溶液中，用软膏刀搅拌I分钟以溶解或分散。通过注射泵将基于明胶的溶液注入DE102005048939A中描述的纺丝装置。
[0095]在将生长因子掺入纤丝的情况下，在进入纺丝装置的容器之前，直接将⑶F-5溶液(1200 μ g/ml5mM柠檬酸钠缓冲液)混合入溶液。将容器加热至50°C，以3500rpm旋转。由于离心力的作用，液体材料作为液体射流从孔口射出，并形成纤维。通过纺丝装置的容器下的抽吸式机械装置拉伸这些纤维，并将其收集为非织造物。收集非织造物，将其冲压成终样品尺寸(3X3mm)。获得了显示快速⑶F_5释放的非织造物样品，随后对其进行Y灭菌(辐射剂量25kGy)。
[0096]在小鼠间质MCHT1/26 细胞(Hoechst Japan Ltd., Kawagoe, Japan)上使用⑶F_5敏感碱性磷酸酶(ALP)活性测定来测量来自非织造物样品的GDF-5释放。非织造材料的释放性质和细胞相容性a)直接在细胞上和b)利用条件培养基进行测试。为了产生条件培养基，将非织造物样品于200 μ I无细胞的细胞培养基(补充以2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的α -MEM)中在37°C，5%C02下温育3天。在温育期后，在MCHT1/26细胞上分析条件培养基和非织造物样品。
[0097]将MCHT1/26细胞以4.5xl03个细胞/孔于细胞培养基(补充以2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)和 10% 月台牛血清(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)的a -MEM(Sigma, Taufkirchen, Germany))中涂板在96孔板上。24小时后，用补充有120 μ I新鲜细胞培养基的40 μ I条件释放培养基温育细胞。平行地，将非织造物样品于160 μ I细胞培养基中直接置于细胞上。72h后，利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞，利用含有 l%Nonidet P40, 0.1M 甘氨酸 pH9.6 (Sigma, Taufkirchen, Germany), ImM MgC12 和 ImMZnCl2(Merck, Darmstadt, Germany)的碱性磷酸盐缓冲液I进行提取。为了获得充分的细胞裂解，将细胞在37°C温育15-18小时。利用IOmM的于0.1M甘氨酸pH9.6，ImM MgCl2和ImM ZnCl2中的对-硝基苯磷酸(Pierce, Bonn, Germany)作为底物测定碱性磷酸酶活性。在37°C温育30分钟后，利用自动化微量板读数器(Tecan Spectra Rainbow, TECAN, Crailsheim, Germany)在考虑空白试验值扣除的情况下在405nM处测量吸光度。结果示于图6中。
[0098]所有非织造物样品都被标志细胞系MCHT1/26良好耐受。对于明胶材料，具有GDF-5的非织造物显示22%(当将非织造物样品直接置于细胞上时)和10%(对于条件培养基)的快速释放。对于非织造物组合明胶/透明质酸，当直接在细胞上时GDF-5释放为36%，对于条件培养基，释放为32%。对于非织造物组合明胶/I型胶原，当直接在细胞上时GDF-5释放为54%，对于条件培养基释放为55%。
[0099]可将显示快速⑶F-5释放的此类样品用于创伤愈合、神经保护和血管生成，因为高剂量的活性生长因子在前3天中被释放入创伤环境。 [0100]实施例2:显示缓慢⑶F-5释放特征的非织造物
[0101]如下产生由聚乙烯吡咯烷酮(A.)、聚氧乙烯(B.)或明胶和羟基磷灰石(C.)组成的、显示缓慢⑶F-5释放的非织造物。
[0102]首先，制备液体前体溶液。
[0103]A.)将40g聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon F90, BASF AG.，Germany)注入搅拌机，添加磁力搅拌器和160g水。随后,在室温搅拌混合物24h,加热至80°C。最后用超声处理溶液I小时，随后将其冷却回60°C。
[0104]B.)将15g聚氧乙烯(分子量1000kDa, BASF AG.，Germany)于室温溶解在185g水中，加热至60°C。
[0105]C.)通过将明胶与水混合制备22.5% (w/w)的A型PIGSKIN明胶水溶液。将该混合物在室温保持I小时，以进行膨胀。随后，在60°C超声处理明胶溶液I小时。使用软膏刀将
2.5% 的羟基憐灰石纳米颗粒(产品号 677418，Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany)(重量/重量明胶)混合入溶液。随后，将混合物加热至80°C，在该温度下保持2小时，随后再次将其冷却至60°C。
[0106]利用注射泵将溶液或分散体注入DE102005048939A中描述的纺丝装置。在将生长因子掺入纤丝的情况下，在进入纺丝装置的容器之前，直接将⑶F-5溶液(1200 μ g/ml5mM醋酸钠缓冲液)混合入溶液。将容器加热至60°C，以4500rpm旋转。由于离心力的作用，液体材料作为液体射流从孔口射出，并形成纤维。通过纺丝装置的容器下的抽吸式机械装置拉伸这些纤维，并将其收集为非织造物。收集非织造物，将其冲压成3X3mm的尺寸。获得了显示缓慢⑶F-5释放的非织造物样品，随后对其进行Y灭菌(辐射剂量25kGy)。
[0107]如实施例1中所述进行具有GDF-5的非织造物样品的测量。在小鼠间质MCHT1/26细胞上使用碱性磷酸酶活性测定来测量来自非织造物样品的GDF-5释放。非织造物原型的释放性质和细胞相容性a)直接在细胞上和b)利用条件培养基进行测试。缓慢释放非织造物样品聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯和明胶/羟基磷灰石的结果示于图7中。
[0108]对于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，具有⑶F-5的非织造物显示1%(当将非织造物样品直接置于细胞上时)和12%(对于条件培养基)的缓慢释放。对于非织造物材料聚氧乙烯(PEO)，直接在细胞上时⑶F-5释放为1%，对于条件培养基，释放为6%。对于非织造物组合明胶/羟基磷灰石，直接在细胞上时GDF-5释放为5%，对于条件培养基，释放为19%。
[0109]显示缓慢⑶F-5释放的此类样品可用于骨或软骨再生，因为仅少量的活性生长因子在前3天被释放。
[0110]实施例3:非织造物技术保护掺入的GDF-5免受去稳定灭菌条件的破坏
[0111]研究了灭菌对掺入至非织造物材料的⑶F-5的稳定性的影响。因此，在灭菌过程之前和之后测试掺入非织造物的⑶F-5的回收和生物学活性。为此目的，如实施例1中所述产生掺入了⑶F-5的非织造物。简而言之，将200μ g/ml5mM醋酸钠缓冲液中的⑶F-5溶液混合入明胶/I型胶原混合物，产生200ng⑶F-5/3x3mm的非织造物。将非织造物冲压成3x3mm的样品尺寸，并对其进行Y灭菌(福射剂量25kGy)。
[0112]利用ELISA定量从非织造物释放的⑶F-5的回收，并且通过碱性磷酸酶的诱导(ALP活性测定)测量⑶F-5的生物学活性。
`[0113]使用ALP测定进行的未灭菌的和灭菌的非织造物的GDF-5生物学活性的测量描述于实施例1中。如下进行灭菌前和灭菌后从非织造物释放的GDF-5的量:将掺入有GDF-5的非织造物在37°C，5%C02下于200 μ I细胞培养基(补充以2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的α-ΜΕΜ)中温育24小时。作为阳性对照，在相同条件下温育无非织造物材料的200ng⑶F-5。在温育期后，将释放培养基和阳性对照以1:2500和1:4000稀释，随后转移至⑶F-5特异性夹心ELISA (Biopharm, Heidelberg, Germany)。ELISA基于两种针对GDF-5的单克隆抗体。将酶链霉亲和素-辣根-过氧化物酶结合至生物素化的第二抗体。通过底物四甲基联苯胺二盐酸盐的酶促转化，随后在450nm通过光度测定法测定所述酶促转化来进行检测。通过使用⑶F-5标准品的测试系列(范围在50至500pg/mL内)来定量具有⑶F-5的释放样品和阳性对照。结果示于图8。
[0114]在掺入了⑶F-5的非织造物的Y灭菌(辐射剂量25kGy)后，超过95%的⑶F-5具有生物学活性，如通过ALP活性测定在MCHT1/26细胞上显示的。此外，灭菌后来自非织造物材料的掺入的⑶F-5的回收为95%(如通过⑶F-5特异性ELISA法定量的)。
[0115]实施例4:掺入非织造物的⑶F-5在低和高贮存温度下显示长期稳定性
[0116]研究贮存持续时间和贮存温度对掺入非织造物材料的⑶F-5的稳定性的影响。在室温、4°C和_80°C贮存掺入了⑶F-5的非织造物，进行多至3个月的时期。
[0117]为了测定掺入非织造物的⑶F-5的稳定性，在第O天制备非织造物样品，并贮存在室温、4°C和_80°C。在I天、3天、2周、4周和3个月的贮存期后，利用ELISA法分析各温度条件下的样品的稳定性。
[0118]如实施例1中所述产生掺入有⑶F-5的非织造物。简而言之，将200 μ g/ml5mM醋酸钠缓冲液中的⑶F-5溶液混合入明胶/I型胶原混合物，产生200ng⑶F-5/3x3mm的非织造物。将非织造物冲压成3x3mm的样品尺寸，对其进行Y灭菌(辐射剂量25kGy)。通过测量从非织造物释放进入细胞培养基的活性GDF-5的回收来分析GDF-5的稳定性。将掺入有⑶F-5的非织造物在37°C，5%C02下于200 μ I细胞培养基(补充以2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的α -MEM)中温育24小时。在温育期后，将释放培养基以1:2500和1:4000稀释，随后转移至GDF-5特异性夹心ELISA (Biopharm, Heidelberg, Germany)。通过使用GDF-5标准品的测试系列(范围在50至500pg/mL内)来定量具有⑶F-5的释放样品。ELISA的结果示于图9。
[0119]在第O天(稳定性研究的起始点)来自灭菌的非织造物的GDF-5的回收超过90%。对于研究的温度条件(室温、4°C和-80°C )，掺入非织造物的⑶F-5的稳定性几乎相同。在于室温进行3个月的贮存期后，未观察到稳定性的丢失。
【权利要求】
1.一种非织造织物，其包含: 含有生物可吸收和/或生物相容性聚合物的纤维原料的纤维，所述纤维包含至少一种分布在纤维中的生物学活性物质，其中所述生物学活性物质是GDF-5相关蛋白。
2.权利要求1的非织造织物，其中将所述生物学活性蛋白额外地分布在所述纤维上。
3.权利要求1或2的非织造织物，其中所述GDF-5相关蛋白是包含胱氨酸结-结构域的蛋白质，所述胱氨酸结-结构域与根据SEQ ID勵:2的氨基酸400-501的人0^-5的102&3的胱氨酸结-结构域具有至少60%的氨基酸同一性。
4.权利要求3的非织造织物，其中所述⑶F-5相关蛋白包含与人⑶F-5的102aa的胱氨酸结-结构域具有至少70%、80%、90%或95%的氨基酸同一性的胱氨酸结-结构域。
5.权利要求1-4的任一项的非织造织物，其中所述纤维原料选自天然聚合物、合成聚合物和来源于化石原料的聚合物，以及其组合，所述聚合物各自可以是经修饰的或未经修饰的。
6.权利要求5的非织造织物，其中所述天然聚合物选自多肽如胶原、明胶、血纤蛋白、酪蛋白，或多糖如葡聚糖、纤维素、淀粉、壳多糖、壳聚糖、藻酸盐或酯和透明质酸，或多核苷酸，以及合成聚合物如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、聚羟基酯或其组合。
7.权利要求1至6的任一项的非织造织物，其中将物质分散入纤丝。
8.权利要求7的非织造织物，其中所述分散的物质选自无机物质如羟基磷灰石和/或β-磷酸三钙。
9.权利要求1至8的任一项的非`织造织物，其中所述非织造织物可由旋转纺丝法产生或由所述方法产生。
10.权利要求1至9的任一项的非织造织物，其中至少一些所述纤维是彼此扭曲，彼此交织的纤维，并且具有扭曲的结构，优选其中至少一些所述纤维彼此交织并且形成至少一个纤维束。
11.权利要求1至10的任一项的非织造织物，其中至少一些所述纤维是纳米纤维。
12.权利要求1至11的任一项的非织造织物，其中所述织物包括开孔结构，其具有0.01 至 1001/min x cm2 的透气性。
13.权利要求1至12的任一项的非织造织物，其中在生理条件(PBS缓冲液，10%胎牛血清，370C )下在3至7天内洗脱至少10%的所述生物学活性物质。
14.权利要求1至13的任一项的非织造织物，用于创伤包括糖尿病性溃疡和其它溃疡、烧伤、皮肤损伤和/或皮肤移植的改善的愈合、用于诱导神经生长或预防神经元死亡，用于促进血管生成，用于诱导祖细胞和/或骨髓细胞的增殖；用于维持增殖或分化状态以治疗或保持用于器官或组织移植的组织或细胞；用于治疗涉及骨元件之间的关节的变性障碍和/或用于半月板和/或脊柱/椎间盘修复。
15.权利要求1至14的任一项的非织造织物，其用于促进组织再生，所述组织选自皮肤组织、结缔组织、骨、软骨、结缔组织附件、腱、韧带、脊柱/椎间盘、半月板、牙组织、牙本质、牙周韧带、毛发、感觉系统的组织、肝、胰腺、心脏、血管、肾、子宫和甲状腺组织、黏膜，内皮、上皮或神经组织。
16.一种创伤敷料、创伤衬垫或植入物，其包含根据权利要求1至15的任一项的非织造织物。
【文档编号】A61F13/00GK103874516SQ201280037651
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2011年6月22日
【发明者】F·普勒格, D·赖布尔, D·格拉法伦德, D·诺伊米勒 申请人:生物医药技术发展有限公司, 卡尔·弗罗伊登伯格公司