1-(5,6-二氯-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-1h-吡唑-4-羧酸的葡甲胺盐制剂的制作方法
【专利摘要】本发明描述了1-(5，6-二氯-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-羧酸(化合物(1))的葡甲胺盐及其可药用制剂。此类化合物可用于药物组合物和由脯氨酰羟化酶活性介导的疾病状态、障碍和病症的治疗方法。
【专利说明】1 - (5，6-二氯-1 Η-苯并[D]咪唑-2-基）-1 Η-吡唑-4-羧 酸的葡甲胺盐制剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年10月25日提交的美国临时专利申请序列号61/551，395的权 Μ〇
【技术领域】
[0003] 本发明涉及1-(5,6_二氯-1H-苯并[d]咪唑-2-基）-1Η-吡唑-4-羧酸的葡甲 胺盐及相关制备方法。
【背景技术】
[0004] 高度保守的氧、铁和2-氧代戊二酸依赖性脯氨酰羟化酶（PHD)通过低氧诱导因子 (HIF)的翻译后修饰来介导细胞对低氧的响应（Ivan等人，2001年，Science《科学》，第292 卷，第464-468页；Jaakkola等人，2001年,Science《科学》，第292卷，第468-472页）。在 常氧条件下，PHD催化HIF中2个保守的脯氨酸残基的羟基化。由于PHD对氧的亲和力在 氧的生理范围内，并且氧是修饰羟化HIF的必需辅助因子，因此当氧张力降低时PHD失活。 这样，HIF在常氧条件下快速分解，但在低氧条件下或当PHD被抑制时在细胞中积累。
[0005] 已描述了四种 PHD 同型：PHD1、PHD2、PHD3 和 PHD4 (Epstein 等人，2001 年，Cell 《细胞》，第107卷，第43-54页；Kaelin，2005年，Annu Rev Biochem.《生物化学年评》，第 74卷，第115-128页；Schmid等人，2004年，J Cell Mol Med.《细胞与分子医学期刊》，第8 卷，第423-431页。不同的同型都广泛表达，但却受到差异调控，并且在细胞对低氧的响应 中具有独特的生理作用。有证据证明各种同型对三种不同的HIF-o亚型具有不同的选择性 (Epstein等人，出处同上）。就细胞定位而言，PHD1主要定位在细胞核，PHD2主要定位在细 胞质，而PHD3似乎在细胞质和细胞核中都存在（Metzen E等人，2003年，J Cell Sci.《细胞 科学杂志》，第116卷第7期，第1319-1326页）。在常氧条件下，PHD2似乎是主要的HIF-o 脯氨酰羟化酶（Ivan等人，2002年，Proc Natl AcadSci. USA《美国国家科学院院刊》，第99 卷第21期，第13459-13464页；Berra等人，2003年，ΕΜΒ0 J.《欧洲分子生物学组织杂志》， 第22卷，第4082-4090页）。这三种同型具有高度的氨基酸同源性，并且酶的活性位点高度 保守。
[0006] 通过小分子对PHD酶活性的靶向破坏在氧感受和氧分布障碍的治疗中具有潜在 实用性。例子包括但不限于：贫血；镰状细胞性贫血；周围血管性疾病；冠状动脉疾病；心力 衰竭；保护组织免于在诸如心肌缺血、心肌梗塞和中风的病症中局部缺血；保存用于移植 的器官；通过调节和/或恢复血流、氧输送和/或能量利用来治疗组织的局部缺血；加速创 伤愈合，尤其是糖尿病和年老患者的创伤愈合；烧伤治疗；感染治疗；骨愈合和骨生长。另 夕卜，预期PHD的靶向破坏可用于治疗诸如糖尿病、肥胖症、溃疡性结肠炎、炎性肠疾病的代 谢障碍以及诸如克罗恩病的相关障碍。（Recent Patents on Inflammation&Allergy Drug Discovery最新炎症与过敏症药物发现专利》，2009年，第3卷，第1-16页））。
[0007] 已示出HIF是导致低氧条件下促红细胞生成素产生量增加的主要转录因子（Wang 等人，1993年，出处同上）。虽然已证明用重组人促红细胞生成素治疗是治疗贫血的有效方 法，但可预期小分子介导的PHD抑制可比用促红细胞生成素治疗有优势。具体地讲，其他 HIF基因产物的功能为造血所必需的，对这些因子的调节能提高造血效率。对造血重要的 HIF靶基因产物的例子包括：转铁蛋白（Rolfs等人，1997年，JBiol Chem.《生物化学杂志》， 第272卷第32期，第20055-20062页）、转铁蛋白受体（Lok等人，1999年，J Biol Chem.《生 物化学杂志》，第274卷第34期，第24147-24152页；Tacchini等人，1999年，J Biol Chem. 《生物化学杂志》，第274卷第34期，第24142-24146页）和血浆铜蓝蛋白（Mukhopadhyay等 人，2000年，J Biol Chem.《生物化学杂志》，第275卷第28期，第21048-21054页）。铁调素 表达也被HIF所抑制（Peyssonnaux等人，2007年，J Clin Invest.《临床研究杂志》，第117 卷第7期，第1926-1932页），已示出PHD的小分子抑制剂能减少铁调素产生量（Braliou等 人，2008年，J Η印atol.《肝脏病学杂志》，第48卷，第801-810页）。铁调素是造血所必需 的铁的利用度的负调控因子，因此预期铁调素产生量的下降对贫血症的治疗有益。PHD抑制 在与其他贫血症治疗法（包括补铁和/或外源促红细胞生成素）联合使用时也是有用的。 对人群中自然发生的PHD2基因的突变的研究，为PHD抑制剂治疗贫血症的用途提供了进一 步的证据。最近两份报告已示出，在PHD2基因中存在功能异常突变的患者表现出红血球增 多现象增加和血液血红蛋白升高（Percy等人，2007年，PNAS《美国科学院院报》，第103卷 第3期，第654-659页；Al-Sheikh等人，2008年，Blood Cells Mol Dis.《血细胞、分子和疾 病》，第40卷，第160-165页）。另外，已在健康志愿者和慢性肾病患者中评估了小分子PHD 抑制剂（美国专利申请No. US2006/0276477, 2006年12月7日）。血浆促红细胞生成素以 剂量依赖性方式增加，而慢性肾病患者中血液血红蛋白浓度增加。
[0008] HIF在低氧条件下的总积累支配着糖酵解作用的适应性上调，氧化磷酸化的下 降导致过氧化氢和超氧化氢产生量下降，氧化磷酸化的最适化能保护细胞免受局部缺血 损伤。因此，预期PHD抑制剂可用于器官和组织移植物的保存（Bernhardt等人，2007年， MethodsEnzymol.《酶学方法》，第435卷，第221-245页）。虽然该有益效果可通过在收获 器官以供移植之前先施用PHD抑制剂来实现，但在收获之后在储存（例如停搏液）中或在 移植后将抑制剂施用给器官/组织也会有治疗效果。
[0009] 预期PHD抑制剂能有效保存组织，使其免受局部缺血和/或低氧影响。这包括与 特别是心绞痛、心肌局部缺血、中风、骨骼肌局部缺血有关的局部缺血/低氧。最近，已证明 局部缺血预适应是一种依赖于HIF的现象（Cai等人，2008年，Cardiovasc Res.《心血管 研究》，第77卷第3期，第463-470页）。虽然预适应的想法最为人所知的是预适应在心脏 中的保护作用，但这个想法也可适用于其他组织，包括但不限于：肝脏、骨骼肌、肝脏、肺、肾 脏、肠和大脑（Pasupathy等人，2005年，Endovasc Surg.《欧洲血管与血管内外科杂志》，第 29卷，第106-115页；Mallick等人，2004年，Dig Dis Sci.《消化疾病与科学》，第49卷第9 期，第1359-1377页）。在多个动物模型中已获得了 PHD抑制和HIF升高对组织的保护作用 的实验证据，包括：PHD1的种系敲除赋予了对骨骼肌免受局部缺血伤害的保护（Arag 〇n6s 等人，2008年，Nat Genet.《自然遗传学》，第40卷第2期，第170-180页），通过使用siRNA 使PHD2沉默保护了心脏免受局部缺血伤害（Natarajan等人，2006年，Circ Res.《循环研 究》，第98卷第1期，第133-140页），通过施用一氧化碳抑制PHD保护了心肌免受局部缺血 损伤（Chin等人，2007年，Proc NatlAcad Sci. U. S. A.《美国国家科学院院刊》，第104卷第 12期，第5109-5114页），大脑中低氧增加了对局部缺血的耐受（Bernaudin等人，2002年， J Cereb Blood FlowMetab.《脑血流与代谢杂志》，第22卷第4期，第393-403页）。另外， PHD的小分子抑制剂在实验性中风模型中能保护大脑（Siddiq等人，2005年，J Biol Chem. 《生物化学杂志》，第280卷第50期，第41732-41743页）。此外，已证明HIF上调能保护糖 尿病小鼠（在这种小鼠中结局通常较差）的心脏（Natarajan等人，2008年，JCardiovasc Pharmacol.《心血管药理杂志》，第51卷第2期，第178-187页）。这些组织保护作用在伯 格病、雷诺病和手足发绀中也可观察到。
[0010] 对通过线粒体中Kreb循环进行的有氧代谢依赖性下降，和对通过PHD抑制来产生 的厌氧糖酵解的依赖性提高，这在常氧组织中可具有有益作用。要着重指出的是，还示出 PHD抑制在常氧条件下能升高HIF。因此，PHD抑制会产生假低氧现象，相关情形是通过HIF 引发低氧响应，但组织氧结合仍保持正常。预期由PHD抑制所产生的代谢变化还可为糖尿 病、肥胖症和相关障碍（包括并存疾病）提供治疗范例。
[0011] 总体而言，由PHD抑制所产生的一批基因表达变化减少了每单位葡萄糖所产生的 能量数量，并且会刺激身体燃烧更多的脂肪以保持能量平衡。糖酵解增加的机理在上文已 有讨论。其他的观察结果将低氧响应与预期对糖尿病和肥胖症治疗有益的作用关联起来。 已示出低氧和低氧模拟物如去铁胺能防止脂肪细胞分化（Lin等人，2006年，JBiolChem. 《生物化学杂志》，第281卷第41期，第30678-30683页；CarriSre等人，2004年，JBiol Chem.《生物化学杂志》，第279卷第39期，第40462-40469页）。在脂肪生成的初始阶段 中抑制PHD活性，抑制了新的脂肪细胞的形成（Floyd等人，2007年，J Cell Biochem.《细 胞生物化学杂志》，第101卷，第1545-1557页）。低氧、氯化钴和去铁胺升高了 HIF并抑制 了 PPARY 2核激素受体转录（Yun等人，2002年，Dev Cell.《发育细胞》，第2卷，第331-341 页）。由于PPARY 2是脂肪细胞分化的重要信号，预期PHD抑制可抑制脂肪细胞分化。这些 作用被示出是通过HIF调控的基因 DEC1/Stral3介导的（Yun等人，出处同上）。
[0012] 已证明PHD的小分子抑制剂在糖尿病和肥胖症的动物模型中具有有益作用（国际 专利申请公开 No. TO2004/052284, 2004 年 6 月 24 日；TO2004/052285, 2004 年 6 月 24 日）。 在小鼠膳食诱导肥胖症、db/db小鼠和Zuckerfa/fa大鼠模型中证明的PHD抑制剂的作用 有：血糖浓度下降、腹部脂肪垫和内脏脂肪垫中的脂肪量下降、血红蛋白Ale下降、血浆甘 油三酯下降、体重下降，以及确立的疾病生物标记的变化，例如肾上腺髓质素和瘦素水平增 力口。瘦素是已知的HIF靶基因产物（Grosfeld等人，2002年，J Biol Chem.《生物化学杂志》， 第277卷第45期，第42953-42957页）。参与脂肪细胞中的代谢的基因产物被证明是通过 PHD抑制以HIF依赖性方式调控的（国际专利申请公开NO.W02004/052285,出处同上）。这 些产物包括载脂蛋白A-IV、酰基CoA硫酯酶、肉毒碱乙酰转移酶和胰岛素样生长因子结合 蛋白（IGFBP)-l。
[0013] PHD抑制剂预期在治疗上可作为血管发生、血管新生和动脉生成的刺激剂使用。 这些过程在局部缺血和/或低氧条件下建立或恢复对组织的血流和氧合（Semenza等人， 2007年，J ChllBiochem.《细胞生物化学杂志》，第102卷，第840-847页；Semenza，2007年， Exp Physiol.《实验生理学》，第92卷第6期，第988-991页）。在实验动物模型中和在人 类中已示出身体锻炼能增加 HIF-1和血管内皮生长因子（Gustafsson等人，2001年，Front Biosci.《生物科学前沿》，第6卷，第D75-89页），从而增加骨骼肌中的血管数量。VEGF是 众所周知的HIF靶基因产物，其是血管新生的主要驱动因子（Liu等人，出处同上）。PHD抑 制比其他血管生成疗法具有潜在的优势，因为它能以HIF依赖性方式刺激多种血管生长因 子的控制表达，包括但不限于：胎盘生长因子（PLGF)、促血管生成素-l(ANGPTl)、促血管生 成素-2(ANGPT2)、血小板衍生的生长因子 β (PDGFB) (Carmeliet，2004 年，J InternMed. 《内科学杂志》，第255卷，第538-561页；Kelly等人，2003年，Circ Res.《循环研究》，第93 卷，第1074-10781页）和基质细胞衍生因子l(SDF-l) (Ceradini等人，2004年，NatMed. 《自然医学》，第10卷第8期，第858-864页）。相比于单独施用VEGF所产生的血管，在血管 新生过程中促血管生成素-1的表达产生了抗渗漏血管（Thurston等人，1999年，Science 《科学》，第286卷，第2511-2514页；Thurston等人，2000年，Nat Med.《自然医学》，第6卷 第4期，第460-463页；Elson等人，2001年，Genes Dev.《基因和发育》，第15卷第19期， 第2520-2532页）。已示出基质细胞衍生因子1 (SDF-1)对于内皮祖细胞募集到组织损伤部 位的过程是重要的。SDF-1表达增加了循环的CXCR4阳性祖细胞向局部缺血组织的黏附、迁 移和归巢。此外，对局部缺血组织中SDF-1的抑制或者对循环的细胞上CXCR4的阻断防止 了祖细胞向损伤部位的募集（Ceradini等人，2004年，出处同上；Ceradini等人，2005年， Trends Cardiovasc Med.《心血管医学趋势》，第15卷第2期，第57-63页）。重要的是，在 老龄小鼠中内皮祖细胞向损伤部位的募集减少，而通过在伤口部位增加 HIF进行干预可以 对此进行矫正（Chang等人，2007年，Circulation《循环》，第116卷第24期，第2818-2829 页）。PHD抑制所提供的优势不仅在于增加多种血管发生因子的表达，而且对这些因子在整 个血管新生过程中的表达和内皮祖细胞向局部缺血组织的募集进行协调。
[0014] PHD抑制剂还可用于促血管发生疗法。已证明在成体动物的非局部缺血组织中腺 病毒介导的HIF过量表达能诱导血管新生（Kelly等人，2003年，Circ Res.《循环研究》，第 93卷第11期，第1074-1081页），这提供了证据证明能升高HIF的疗法（如PHD抑制）会 诱导血管新生。胎盘生长因子（PLGF)也是HIF靶基因，已示出它在局部缺血组织中的血管 新生中起到关键作用（Carmeliet，2004年，J Intern Med.《国际医学杂志》，第255卷第5 期，第538-561页；Luttun等人，2002年，Ann NYAcad Sci.《纽约科学院年志》，第979卷， 第80-93页）。在骨骼肌中（Pajusola等人，2005年，FASEBJ.《美国实验生物学联合会会 刊》，第19卷第10期，第1365-1367页；Vincent等人，2000年，Circulanon《循环》，第102 卷，第2255-2261页）和在心肌中（Shyu等人，2002年，Cardiovasc Res.《心血管研究》，第 54卷，第576-583页），通过HIF过量表达，已证明了能升高HIF的疗法的强效促血管新生 作用。内皮祖细胞被HIF靶基因 SDF-1募集到局部缺血心肌，这也已得到证明（Abbott等 人，2004年，Circulation《循环》，第110卷第21期，第3300-3305页）。因此，PHD抑制剂 在组织局部缺血特别是肌肉局部缺血的情况中将很可能有效地刺激血管新生。由PHD抑制 剂所产生的治疗性血管新生将很可能引起恢复流向组织的血流，从而改善诸如但不限于以 下的疾病：心绞痛、心肌缺血和心肌梗塞、外周缺血疾病、跛行、胃溃疡和十二指肠溃疡、溃 疡性结肠炎以及炎性肠疾病。
[0015] PHD和HIF在组织修复和再生（包括伤口和溃疡的愈合）中起到核心作用。最近 的研究已证明，在老龄小鼠中的伤口部位所有三种PHD表达增加，导致HIF积累下降（Chang 等人，出处同上）。因此，通过施用去铁胺升高老龄小鼠中的HIF，结果使伤口愈合程度提升 恢复到了幼龄小鼠中观察到的水平。类似地，与非糖尿病的同胎仔鼠相比，在糖尿病小鼠模 型中HIF升高受到了抑制（Mace等人，2007年，Wound Repair Regen.《创伤修复与再生》，第 15卷第5期，第636-645页）。氯化钴（一种低氧模拟物）的局部施用或者缺乏氧依赖性降 解结构域从而提供组成型活性形式的HIF的鼠 HIF的过量表达，导致了伤口部位HIF增加， HIF靶基因如VEGF、Nos2和Hmoxl的表达增加，以及伤口愈合加速。PHD抑制的有益效果并 不限于皮肤，最近已证明PHD的小分子抑制剂在结肠炎的小鼠模型中提供益处（Robinson 等人，2008年，Gastroenterology《肠胃病学》，第134卷第1期，第145-155页）。
[0016] 总的来说，PHD抑制导致HIF积累很可能通过以下至少四种机制起作用，从而促使 伤口的加速且更完全的愈合：1)保护受低氧和/或局部缺血危害的组织，2)刺激血管发生 以建立或恢复流向伤口部位的适当血流，3)募集内皮祖细胞到伤口部位，4)刺激能特异性 刺激愈合和再生的生长因子的释放。
[0017] 由于 FOGF 是 HIF 基因革巴标（Schultz 等人，2006 年，Am J Physiol Heart Circ Physiol.《美国生理学杂志：心脏与循环生理学》，第290卷第6期，第H2528-2534页； Yoshida等人，2006年，J Neurooncol.《神经肿瘤学杂志》，第76卷第1期，第13-21页）， PHD抑制很可能增加内源T0GF的表达，并且所产生的有益效果与单独用TOGF所产生的有益 效果相似或更好。在动物中进行的研究已证明，局部施用TOGF导致伤口 DNA、蛋白质和羟脯 氨酸含量增加；形成更厚的肉芽和表皮组织；以及伤口部位的细胞再增殖增加。TOGF可对 新结缔组织形成的增强发挥局部作用。由于HIF介导的额外的组织保护作用和促血管发生 作用，PHD抑制的有效性很可能大于TOGF所产生的有效性。
[0018] PHD抑制的有益效果不仅延伸到皮肤和结肠中的加速伤口愈合，而且延伸到包括 但不限于胃肠溃疡、皮肤移植物置换、烧伤、慢性伤口和冻伤在内的其他组织损伤的愈合。
[0019] 在体内低氧小生境中发现存在干细胞和祖细胞，低氧调控它们的分化和细胞命运 (Simon等人，2008年，Nat Rev Mol Cell Biol.《自然综述：分子细胞生物学》，第9卷，第 285-296页）。因此，PHD抑制剂可用于维持干细胞和祖细胞处于多能状态和用于驱动分化 成为所需的细胞类型。干细胞可用于培养和扩增干细胞群体，并可保持细胞处于多能状态， 同时将激素和其他因子施用给细胞可影响分化和细胞命运。
[0020] PHD抑制剂在干细胞和祖细胞治疗领域的又一个用途，涉及将PHD抑制剂用于调 理这些细胞以使其能经受住向体内的植入过程和产生对身体的适当响应，从而使干细胞和 祖细胞植入可行（Hu等人，2008年，J ThoraC Cardiovasc Surg.《美国心胸外科杂志》，第 135卷第4期，第799-808页）。更具体地讲，PHD抑制剂可促进干细胞的整合，并且一旦干 细胞整合时吸引适当的血液供应以维持干细胞。该血管形成也会起到将这些细胞释放的激 素和其他因子携带到身体其他部位的作用。
[0021] PHD 抑制剂还可用于治疗感染（Peyssonnaux 等人，2005 年，J Invest Dermatol. 《研究性皮肤病学杂志》，第115卷第7期，第1806-1815页；Peyssonnaux等人，2008年，J Invest Dermatol.《研究性皮肤病学杂志》，2008年8月，第128卷第8期，第1964-1968 页）。已证明HIF升高能增加吞噬细胞中和角质细胞中对感染的先天免疫应答。其中HIF 升高的吞噬细胞显示出杀细菌活性提高、氧化氮产生量增加和导管素（cathelicidin)这 种抗细菌肽的表达增加。这些效果也可用于治疗烧伤感染。
[0022] HIF也已被证明参与骨生长和愈合（Pfander D等人，2003年，J Cell Sci.《细胞 科学期刊》，第116卷第Pt9期，第1819-1826页）；Wang等人，2007年，J Clin Invest.《临 床研究杂志》，第17卷第6期，第1616-1626页），因此可用于愈合或防止骨折。HIF刺激糖 酵解以提供能量，以允许在低氧环境下合成骺软骨细胞的胞外基质。HIF还在驱动骨愈合过 程中的VEGF的释放和血管新生中起作用。血管向生长中或愈合中的骨头内的生长可能是 该过程中的限速步骤。
[0023] PHD的小分子抑制剂在文献中已有描述，这些小分子抑制剂包括但不限于咪唑并 [1，2_a]批陡衍生物（Warshakoon等人，2006年，Bioorg Med Chem Lett.《生物有机化学与 医药化学通讯》，第16卷第21期，第5598-5601页））、取代的批陡衍生物（Warshakoon等 人，2006年，Bioorg Med Chem Lett.《生物有机化学与医药化学通讯》，第16卷第21期，第 5616-5620 页））、吡唑并吡啶（Warshakoon 等人，2006 年，Bioorg Med Chem Lett.《生物有 机化学与医药化学通讯》，第16卷第21期，第5687-5690页））、二环杂芳族N取代甘氨酸衍 生物（国际专利申请公开No. W02007/103905, 2007年9月13日）、基于喹啉的化合物（国 际专利申请公开No. W02007/070359, 2007年6月21日）、嘧啶三酮N取代的甘氨酸衍生物 (国际专利申请公开此.102007/150011，2007年12月27日）、取代的芳基或杂芳基酰胺 化合物（美国专利申请公开No. US2007/0299086, 2007年12月27日）和取代的4-羟基嘧 啶-5-甲酰胺（国际专利申请公开No. W02009/117269, 2009年9月24日）。
【发明内容】
[0024] 本发明涉及如本文所述定义的通用和优选实施例。根据下面的【具体实施方式】并结 合附图，本发明的优选和示例性特征将显而易见。
[0025] 在其许多实施例中，本发明涉及脯氨酰羟化酶（PHD)的抑制剂的新型盐，并且提 供了治疗、预防、抑制或改善与PHD酶相关的一种或多种疾病障碍的方法。
[0026] 更具体地讲，本发明涉及下式的化合物的葡甲胺盐：
【权利要求】
3. -种药物组合物，包含根据权利要求2所述的化合物和可药用赋形剂。
4. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述葡甲胺盐为二水合物的形式。
5. -种局部用膏剂，包含根据权利要求1所述的制剂。
【文档编号】A61P3/10GK104053439SQ201280052789
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2012年10月25日 优先权日:2011年10月25日
【发明者】K.塞帕斯, M.C.里兹佐里奧 申请人:詹森药业有限公司