肠纤维化处理剂的制作方法

肠纤维化处理剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及肠道中的细胞外基质产生细胞用的物质递送载体和利用了该载体的肠纤维化处理剂，所述载体含有类视黄醇作为靶向剂。
【专利说明】肠纤维化处理剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及以肠道中的细胞外基质产生细胞为靶的物质递送用载体、以及使用了该载体的肠纤维化处理用组合物和肠纤维化的处理方法。另外，本发明还涉及纤维化肠道来源的细胞外基质产生细胞株、其制作方法、使用了所述细胞株的肠纤维化处理药的筛选方法、包含所述细胞株的肠纤维化处理药的筛选试剂盒。
【背景技术】
[0002]肠纤维化(intestinal fibrosis)是以肠壁中的瘢痕组织的过量蓄积为特征的病理状态，继发于慢性的肠道炎症、例如慢性化的炎症性肠道疾病(IBD)、放射线照射导致的组织损伤等(非专利文献I)。炎症性肠道疾病包括克隆氏病和溃疡性结肠炎，例如克隆氏病中约25~30%的患者会发生肠纤维化。肠纤维化进展会形成肠道狭窄(stricture)，引起食物的通过困难，是损害患病对象的QOL的很大的原因。但是，现状是肠纤维化的机理还没有弄清楚，因此尚未确立根本性的治疗方法。
[0003]以往肠纤维化治疗的重点在于治疗作为其原因的炎症，使用各种抗炎药，例如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪(7 ^ ^ >)、巴柳氮等氨基水杨酸系药剂、氢化泼尼松、布地奈德等皮质类固醇药、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、环孢菌素、氨甲蝶呤等免疫抑制剂、英夫利昔等TNF α抑制剂、以及甲硝唑(metronidazole)、环丙沙星等抗生素。但是，这些抗炎药并不直接治疗纤维化，在重症肠纤维化中，还需要外科除去纤维化了的组织，这对患者是强加的巨大负担。
[0004]由于此种情况，近年来进行了直接治疗肠纤维化的一些尝试。其结果，报告了例如TGFii I疫苗(非专利文献2)、己酮可可碱及其代谢物(非专利文献3)、磷酸二酯酶4抑制剂(非专利文献4)、HMG-CoA还原酶抑制剂(非专利文献5)、大建中汤(非专利文献6)、普伐他汀(非专利文献7)、脂氧素A4类似物(专利文献I)、硫酸基转移酶抑制剂(专利文献
2)等药剂在肠纤维化动物模型等中获得了某种程度的成果。但是，这些药剂还均不能令人满意，需要开发进一步的肠纤维化治疗剂。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1:TO2008/022807
[0008]专利文献2:W02009/084232
[0009]专利文献3:W02006/068232
[0010]专利文献4:W02009/036368
[0011]专利文献5:TO2010/014117
[0012]专利文献6:W02009/116257
[0013]专利文献7:TO2010/026766
[0014]非专利文献
[0015]非专利文献1:Rieder and Fiocchi,Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2009Apr ；6(4):228-35
[0016]非专利文献2:Ma et al.，Inflamm Bowel Dis.20IOJun ；16(6):1040-50
[0017]非专利文献3:Peterson et al., Eur J Pharmacol.201 IJul 15 ;662 (1-3):47-54
[0018]非专利文献4 =Videla et al.，J Pharmacol Exp Ther.2006Feb ；316(2):940-5
[0019]非专利文献5:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/21909991
[0020]非专利文献6:Inoue et al.，Biol Pharm Bull.2011 ；34(11):1659-65
[0021]非专利文献7:Haydont et al., Clin Cancer Res.2007Sepl5 ;13(18Ptl):5331-40

【发明内容】

[0022]发明所要解决的课题
[0023]本发明的目的在于提供能够将药物等物质特异性地递送到肠道中的细胞外基质产生细胞的载体、使用了该载体的肠纤维化处理剂和肠纤维化的处理方法。
[0024]用于解决课题的手段
[0025]本
【发明者】们在探求新型的肠纤维化治疗剂的过程中成功地从纤维化了的肠道组织中分离出细胞外基质产生细胞，并进而发现，含有类视黄醇作为靶向剂的载体可将细胞外基质产生抑制剂以高效率递送到该细胞并显著抑制与细胞外基质产生相关的分子的表达，从而完成了本发明。
[0026]已知含有维生素A的载体向肝星状细胞(专利文献3、专利文献4)或肝星状细胞株(专利文献3、专利文献5)、肺(专利文献6)和骨髄(专利文献7)中的细胞外基质产生细胞递送药物、在该载体上载持有针对HSP47的siRNA的组合物可使肝纤维化(专利文献
3)、肺纤维化(专利文献6)和骨髄纤维化(专利文献7)得到改善，但是到目前为止对于其与肠道中的细胞外基质产生细胞、肠纤维化的关系还完全不清楚。
[0027]即，本发明涉及以下技术方案。
[0028](I) 一种针对肠道中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂。
[0029](2)根据上述(I)所述的载体,其中,类视黄醇包含视黄醇。
[0030](3)根据上述(I)或(2)所述的载体，其含有类视黄醇和除类视黄醇以外的载体构成要素，且类视黄醇与除类视黄醇以外的载体构成要素的摩尔比为8:1~1:4。
[0031](4) 一种肠纤维化处理用医药组合物，其含有上述(I)~(3)中任一项所述的载体、和对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物。
[0032](5) 一种用于由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的医药组合物，其含有上述(I)~(3)中任一项所述的载体、和对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物。
[0033](6)根据上述⑷或(5)所述的医药组合物，其中，对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物选自抑制细胞外基质成分的产生/分泌的物质、细胞增殖抑制物质、细胞凋亡诱导物质、TMP抑制物质以及α I抗胰蛋白酶抑制物质。
[0034](7)根据上述(6)所述的医药组合物，其中，抑制细胞外基质成分的产生/分泌的物质为HSP47的抑制剂。[0035](8)根据上述⑷~(7)中任一项所述的医药组合物，其为用时制备形态。
[0036](9)上述(4)~⑶中任一项所述的医药组合物的制备试剂盒，其包含I个或I个以上的容器，所述容器单独或组合地包含对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物、类视黄醇以及根据需要的除类视黄醇以外的载体构成物质。
[0037](10) 一种针对肠道中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体的制造方法，其包含将类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂进行配合的工序。
[0038](11) 一种肠纤维化处理用医药组合物或用于由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的医药组合物的制造方法，其包含分别将类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂、将对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物作为有效成分进行配合的工序。
[0039](12) 一种肠道中的细胞外基质产生细胞株，其来自由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织，并具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型。[0040](13) 一种分离肠道中的细胞外基质产生细胞的方法，其包含:
[0041](i)从由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织获得细胞的工序、和
[0042](ii)从⑴中获得的细胞中选择具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的细胞的工序。
[0043](14) 一种制作肠道中的细胞外基质产生细胞株的方法，其包含:
[0044](i)从由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织获得细胞的工序、和
[0045](ii)从⑴中获得的细胞中选择具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的细胞的工序、
[0046]并且包含在工序(i)或(ii)之后将细胞永生化的工序。
[0047](15) 一种筛选肠纤维化处理因子的方法，其包含:
[0048](i)使上述(12)所述的细胞株与受检因子共存的工序、和
[0049](ii)对因与受检因子共存而导致的细胞株的变化进行检测的工序。
[0050](16) 一种用于筛选肠纤维化处理因子的试剂盒，其包含上述(12)所述的细胞株。
[0051]发明效果
[0052]本发明的肠纤维化处理用组合物的准确的作用机制尚未完全弄清楚，但认为是类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂发挥功能，通过将有效成分例如对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物等递送到这些细胞，从而起到抗肠纤维化的效果。
[0053]因此，利用含有类视黄醇作为靶向剂的本发明的载体由于能够将有效成分高效地递送到作用部位、甚至靶细胞，因此使到目前为止还没有根本性治疗方法的肠纤维化的治愈、进展的抑制或发病的预防成为可能，对人类的医疗和动物的医疗具有极大的贡献。
[0054]另外，本发明的载体由于能够与任意的药剂(例如已有的肠纤维化治疗药)组合而提高其作用效率，因此还具有制剂的应用范围广、能够简便地制造有效的处理剂的优点。
[0055]此外，本发明的细胞株由于能够用于肠纤维化治疗药物的筛选、肠纤维化的机理的阐明等，因此还有助于开发肠纤维化的新型处理剂和/或处理方法。
【专利附图】

【附图说明】[0056]图1为表示SAMPl/Yit小鼠的肠纤维化部位的星状细胞样间质细胞的局部分布的照片图。(a)表示偶氮卡红(Asan)染色图像、(b)表示用抗波形蛋白抗体时的荧光免疫染色图像、(C)表示用抗a SMA抗体时的荧光免疫染色图像、(d)表示用抗GFAP抗体时的荧光免疫染色图像。箭头表示星状细胞样间质细胞的位置。另外，比例尺在(a)表示100 μ m、在
(b)~(d)表示 50 μ m。
[0057]图2为表示从SAMPl/Yit小鼠的肠纤维化部位分离的间质细胞系IC10_F2(上一行)和来自其的波形蛋白阳性、a SMA阴性、GFAP阴性细胞株IC10_F2_E9 (下一行)的波形蛋白和aSMA的表达的照片图。比例尺表不50 μ m。
[0058]图3为表示IC10_F2细胞和IC10_F2_E9细胞的波形蛋白、a SMA, ADRP, LRAT和LXRP的相对表达的图。
[0059]图4为表示将针对HSP47的siRNA载持于VA结合脂质体并导入IC10_F2_E9细胞时的HSP47的相对表达的图。
【具体实施方式】
[0060]本发明的一个方面涉及一种针对肠道中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂。本发明载体的一个方式含有用于靶向于肠道中的细胞外基质产生细胞的有效量的类视黄醇。另外，本发明载体的一个方式还涉及利用类视黄醇而靶向化于肠道中的细胞外基质产生细胞的载体。
[0061 ] 本发明中，肠道中的细胞外基质产生细胞只要是存在于肠道的具有细胞外基质产生能力的细胞则没有特别限定，例如包括存在于肠道的星状细胞样细胞、成纤维细胞、周细胞、纤维细胞和肌成纤维细胞。存在于肠道的基质产生细胞并不仅仅是存在于肠道的细胞来源的细胞，也可以包括循环血液中的纤维细胞来源的细胞、或通过内皮间质分化转化而从上皮细胞或内皮细胞转化的细胞(非专利文献I)。
[0062]作为星状细胞样细胞，可列举出例如在下文实施例中鉴定的具有波形蛋白阳性、aSMA(a平滑肌肌动蛋白)阴性且GFAP (胶质纤维酸性蛋白)阴性的表现型的细胞。所述细胞为通过使用了经可检测地标记的抗波形蛋白抗体、抗a SMA抗体和抗GFAP抗体的免疫染色等鉴定的细胞。该细胞可以表达VA (维生素A)储藏相关基因，例如ADRP (脂肪分化相关蛋白)、LRAT(卵磷脂视黄醇酰基转移酶)和/或LXRii (肝X受体β )等。肝星状细胞当在体外进行培养时活化，成为a SMA阳性且GFAP阳性，但上述星状细胞样细胞即使在体外进行培养a SMA和GFAP也不会成为阳性。肌成纤维细胞以波形蛋白和a SMA的表达为特征，成纤维细胞表达间质细胞特征性的波形蛋白但不表达a SMA,因此能够通过波形蛋白和a SMA的二重染色等来鉴定。肠道中的细胞外基质产生细胞还可以通过从由肠道组织获得的细胞中选择具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的细胞来得到。
[0063]本发明中的类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂(targeting agent)发挥功能，其是促进针对该细胞的特异性的物质递送的物质。类视黄醇促进物质递送的机理尚未完全弄清楚，但认为例如与RBP(视黄醇结合蛋白，retinolbinding protein)特异性地结合的类视黄醇通过位于肠道中的细胞外基质产生细胞的细胞表面上的某种受体而被该细胞摄入。
[0064]类视黄醇是具有4个类异戊二烯单元头对尾式地连接而成的骨架的化合物的组中的 I 员(参照 G.P.Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,，，2ndEd.Portland Press, pp.247-251 (1992))，维生素A是定性地表示视黄醇的生物学活性的类视黄醇的一般性描述因子。作为本发明中可以使用的类视黄醇，没有特别限定，可列举出例如视黄醇(包括全反式视黄醇)、视黄醛、视黄酸(包括维甲酸)、视黄醇与脂肪酸的酯、月旨肪族醇与视黄酸的酯、依曲替酯、异维甲酸、阿达帕林、阿维a、他扎罗汀、棕榈酸视黄酯等类视黄醇衍生物、以及芬维A胺(4-HPR)、蓓萨罗丁等维生素A类似物。
[0065]其中，从针对肠道中的细胞外基质产生细胞的特异性的物质递送的效率的角度出发，优选视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇与脂肪酸的酯(例如乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、硬脂酸视黄酯和月桂酸视黄酯等)以及脂肪族醇与视黄酸的酯(例如视黄酸乙酯等)。
[0066]包括类视黄醇的顺-反式在内的所有异构体都包括在本发明的范围内。类视黄醇也可以被I个或2个以上的取代基取代。本发明中的类视黄醇当然包括分离状态的类视黄醇，也包括溶解或混合于能够溶解或保持类视黄醇的介质的状态的类视黄醇。
[0067]本发明中的类视黄醇还包括包含类视黄醇作为其一部分的化合物(含有类视黄醇部分的化合物)。所述化合物可以包含I个或2个以上、例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或多于10个的类视黄醇部分。在所述化合物中，类视黄醇的RBP结合部位(例如在视黄醇的情况下为环己烯环部分)可以以能够与RBP结合的状态存在。作为所述化合物，没有限定，可列举出I个或2个以上类视黄醇与PEG或其衍生物结合而成的化合物等。在所述类视黄醇-PEG结合物中，类视黄醇的RBP非结合部位(例如视黄醇的情况下为除环己烯环部分以外的部分，例如OH基等)可以共价键合于PEG或其衍生物。PEG或其衍生物可以具有I~50个重复单元(CH2CH2O)。PEG或其衍生物的分子量可以为200~4000g/mol。PEG或其衍生物可以为线状或分支状。PEG衍生物在其末端可以具有适合与类视黄醇结合的基团，例如氨基等。PEG衍生物在链中可以具有I个或2个以上、例如I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或多于10个的酰胺基。
[0068]本发明的载体可以由这些类视黄醇本身构成，也可以通过使类视黄醇结合或包含于另外的载体构成成分来构成。因此，本发明的载体可以含有除类视黄醇以外的载体构成成分。作为该成分，没有特别限定，可以使用医药和药学领域中已知的任意成分，优选可包含类视黄醇或可与类视黄醇结合的成分。
[0069]作为这种成分，可列举出脂质、例如甘油磷脂等磷脂、鞘磷脂等鞘脂、胆固醇等甾醇、大豆油、罂粟油等植物油、矿物油、蛋黄卵磷脂等卵磷脂类、聚合物等，但并不限定于这些。其中，优选可构成脂质体的物质，例如卵磷脂等天然磷脂、二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等半合成磷脂、二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)、二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)、胆固醇等。
[0070]作为特别优选的成分，可列举出可避免被网状内皮系统捕获的成分、例如Ν-(α-三甲基胺基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰氯(TMAG)、N，N’，N’’，N’’ ’ -四甲基-N，N’，N’ ’，N’ ’ ’ -四棕榈基精胺(TMTPS)、2，3- 二油烯氧基_N_[2 (精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烯胺三氟乙酸酯(DOSPA)、Ν-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二(十八烷基)二甲基氯化铵(DODAC)、二(十二烷基)溴化铵(DDAB)、1，2-二油烯氧基-3-三甲基胺基丙烷(DOTAP)、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、1，2_二肉豆蘧酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)、O，O’ - 二(十四烷基)-Ν-(α-三甲基胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)等阳离子性脂质。
[0071] 本发明中的载体可以具有特定的三维结构。作为所述结构，没有特别限定，可列举出直链状或分支状的线状结构、膜状结构、球状结构等。因此，载体没有特别限定可具有树形分子(dendrimer)、dendron、胶束、脂质体、乳液、微球、毫微球等任意的三维形态。另外，本发明中的载体的一个方式为可通过靶向剂(包含靶向分子、靶向部分等)进行主动靶向的载体。具有三维形态的载体、可主动靶向的载体在本【技术领域】中是熟知的(例如参照Marcucci and Lefoulon, Drug Discov Today.2004Marl；9(5):219_28、Torchilin, Eur JPharm Sc1.20000ct ；llSuppl2:S81_91 等)。
[0072]本发明的类视黄醇与载体的结合或包含也可以通过下述方法实现:利用化学和/或物理方法将类视黄醇结合或包含在载体的其他构成成分上。或者，本发明的类视黄醇与载体的结合或包含也可以通过下述方法实现:在该载体的制作时，将类视黄醇与除类视黄醇以外的载体构成成分混合。本发明的载体上的类视黄醇的量可以设定为:例如0.01~1000nmol/ μ 1、优选0.1~IOOnmol/μ I。另外,在含有类视黄醇与除类视黄醇以外的载体构成成分的本发明的载体中，类视黄醇与除类视黄醇以外的载体构成成分的摩尔比没有限定，例如可以为8:1~1:4或4:1~1:2。类视黄醇与载体的结合或包含也可以在使递送物载持于该载体之前进行，也可以通过将载体、类视黄醇和递送物等同时混合等来进行，或者通过将处于已载持有递送物的状态的载体与类视黄醇混合等来进行。因此，本发明还涉及一种肠道中的细胞外基质产生细胞特异性的制剂的制造方法，其包括将类视黄醇与已知的任意的药物结合载体或药物封入载体例如DaunoXome?、Doxil、Caelyx?、Myocet?等脂质体制剂结合的工序。
[0073]本发明的载体的形态只要能够将所希望的物质或物体搬运到作为靶的肠道中的细胞外基质产生细胞，则任何形态均可以，例如，并非是进行限定，可以采用聚合物、树形分子、dendron、高分子胶束、脂质体、乳胶、微球、毫微球等中的任意形态。在本发明中，从递送效率高低、能够递送的物质的选择范围的宽窄和制剂的容易性等观点出发，这些载体中优选脂质体形态，其中特别优选含有阳离子性脂质的阳离子性脂质体。当载体为脂质体形态时，类视黄醇与除类视黄醇以外的脂质体构成脂质的摩尔比为:当考虑类视黄醇与载体的结合或包含的效率性时，优选为8:1~1:4、更优选为4:1~1:2。
[0074]本发明的载体中所含的类视黄醇只要以作为靶向剂发挥功能的形态存在，则可以在本发明的载体的内部含有搬运物，也可以附着地存在于搬运物的外部，另外，还可以与搬运物混合。这里，作为靶向剂发挥功能是指含有类视黄醇的载体比不含类视黄醇的载体更为迅速和/或大量地到达和/或被摄入到作为靶细胞的肠道中的细胞外基质产生细胞中，这可通过例如将带有标记或含有标记的载体添加至靶细胞的培养物中，在规定时间后对标记的存在部位进行分析来容易地确认。从结构上来说，只要例如类视黄醇最晚在到达靶细胞之前、至少部分地露出在载体(例如载体具有三维结构时等)或含有载体的制剂的外部，则可满足上述要件。这里，“制剂”是包括后述的本发明的组合物、并进一步具有形态的概念。类视黄醇是否露出至制剂的外部可以通过使制剂与特异性结合类视黄醇的物质、例如视黄醇结合蛋白(RBP)等相接触、研究在制剂上的结合来进行评价。
[0075]使类视黄醇最晚在到达靶细胞之前至少部分地露出在载体或制剂的外部，例如可以通过调节类视黄醇与除类视黄醇以外的载体构成成分的配比等来实现。另外，载体具有脂质体等脂质结构体的形态时，例如在对除类视黄醇以外的载体构成成分和类视黄醇进行复合物化时，使用首先将由除类视黄醇以外的载体构成成分构成的脂质结构体稀释在水性溶液中、接着使其与类视黄醇相接触、混合等的方法。此时，类视黄醇还可是溶解在溶剂、例如DMSO等有机溶剂中的状态。这里，脂质结构体是指具有任意的三维结构例如线状、膜状、球状等形状的含有脂质作为构成成分的结构体，没有限定，包含脂质体、胶束、脂质微小球、脂质纳米小球、脂质乳液等。例如在Zhao and Lee, Adv Drug Deliv Rev.2004 ；56 (8):1193-204>Temming et al.,Drug Resist Updat.2005 ；8 (6):381-402等中记载了也可将与将脂质体靶向化而成的载体相同的靶向剂适用于其他药物载体。
[0076]脂质结构体可通过使用例如盐、或蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等糖类、甘油、丙二醇等多元醇等、优选使用蔗糖或葡萄糖等渗透压调节剂来调节渗透压而稳定化。另外，可通过加入适度的盐或缓冲液等PH调节剂来调节pH。因此，可在含有这些物质的介质中进行脂质结构体的制造、保存等。此时，渗透压调节剂的浓度优选调节到与血液等张。例如蔗糖的情况下，介质中的浓度没有限定，可以为3~15重量％、优选为5~12重量％、更优选为8~10重量％、特别优选为9重量％ ;葡萄糖的情况下，介质中的浓度没有限定，可以为I~10重量％、优选为3~8重量％、更优选为4~6重量％、特别优选为5重量％。
[0077]本发明还涉及一种针对肠道中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体的制造方法，其包含将类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂进行配合的工序。关于类视黄醇的配合方法，只要类视黄醇在所配合的载体中能够作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂发挥功能，则没有特别限定，例如可以采用本说明书中记载的各种方法。因此，关于类视黄醇的配合，可通过利用化学和/或物理方法将类视黄醇结合或包含于载体的其他构成成分，或在制作载体时通过将类视黄醇与除类视黄醇以外的载体构成成分混合等来进行。类视黄醇的配合量等已在有关本发明的载体的内容中叙述。
[0078]本载体的递送物并无特殊限制，优选为能够从给药部位向着靶细胞存在的病变部位在生物体内物理移动的大小。因此，本发明的载体除了可以搬运原子、分子、化合物、蛋白质、核酸等物质外，还可以搬运载体、病毒颗粒、细胞、由I个以上要素构成的药物释放系统、微型设备(micromachine)等物体。上述递送物优选具有对祀细胞产生某些影响的性质，包括例如对靶细胞进行标记，或对靶细胞的活性或增殖(例如增强或抑制其活性或增殖)进行控制。
[0079]因此，在本发明的一个实施方式中，载体的递送物是“对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物”。这里，肠道中的细胞外基质产生细胞的活性是指肠道中的细胞外基质产生细胞所表现出的分泌、摄入、游走等各种活性，在本发明中，典型地，其中特别是指与肠纤维化的发病、发展和/或复发等相关的活性。作为所述活性，例如，没有限定，可列举出例如胶原、蛋白聚糖、细胞粘合素、纤连蛋白、血小板反应蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、弹性蛋白等细胞外基质成分等的产生、分泌以及这些细胞外基质成分的分解活性的抑制等。
[0080]因此，本说明书中，对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物可以是直接或间接地抑制与肠纤维化的发病、发展和/或复发相关的所述细胞的物理、化学和/或生理作用等的任何药物，并不是进行限定，包括抑制上述细胞外基质成分等的产生/分泌的物质、细胞增殖抑制物质、细胞凋亡诱导物质、TIMP(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase)抑制物质、α I抗胰蛋白酶抑制物质等。
[0081]作为抑制细胞外基质成分等的产生/分泌的物质，没有限定，可列举出例如抑制胶原、蛋白聚糖、细胞粘合素、纤连蛋白、血小板反应蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、弹性蛋白等细胞外基质成分的表达的RNAi分子、核酶、反义核酸等物质、或显性失活突变体等具有显性失活效果的物质、表达它们的载体、和用它们进行形质转化而得到的细胞等。上述细胞外基质成分中，作为抑制胶原的产生/分泌的药物，进一步可列举出，并不是进行限定，例如针对作为各种类型的胶原的合成过程中共通的细胞内输送和分子成熟化所必须的胶原特异性分子伴侣的HSP(热休克蛋白，heat shockprotein)47的抑制物质、例如HSP47的RNAi分子、核酶、反义核酸等HSP47表达抑制物质、或HSP47的显性失活突变体等具有显性失活效果的物质、表达它们的载体、和用它们进行形质转化而得到的细胞等等。[0082]作为细胞增殖抑制物质，没有限定，可列举出例如异环磷酰胺、尼莫司汀(例如盐酸尼莫司汀)、环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、雷莫司汀等烷化剂，吉西他滨(例如盐酸吉西他滨)、依诺他滨、阿糖胞苷?十八烷基磷酸钠、阿糖胞苷制剂、替加氟?尿嘧啶、替加氟.吉莫斯特.氧嗪酸钾配合剂(例如TS-1)、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巯基嘌呤等抗代谢剂，依达比星(例如盐酸依达比星)、表柔比星(例如盐酸表柔比星)、柔红霉素(例如盐酸柔红霉素、柠檬酸柔红霉素)、阿霉素(例如盐酸阿霉素)、吡柔比星(例如盐酸吡柔比星)、博来霉素(例如盐酸博来霉素)、培洛霉素(例如硫酸培洛霉素)、米托蒽醌(例如盐酸米托蒽醌)、丝裂霉素C等抗肿瘤性抗生素，依托泊甙、伊立替康(例如盐酸伊立替康)、长春瑞滨(例如酒石酸长春瑞滨)、多西他赛(例如多西他赛水合物)、紫杉醇、长春新碱(例如硫酸长春新碱)、长春地辛(例如硫酸长春地辛)、长春碱(硫酸长春碱)等生物碱，阿那曲唑、他莫昔芬(例如柠檬酸他莫昔芬)、托瑞米芬(例如柠檬酸托瑞米芬)、比卡鲁胺、氟他胺、雌莫司汀(例如磷酸雌莫司汀)等激素疗法剂，钼尔定、顺钼(CDDP)、奈达钼等钼络合物，沙利度胺、新伐司他、贝伐单抗等新生血管抑制剂，L -门冬酰胺酶等。
[0083]作为细胞凋亡诱导物质，并不是进行限定，可列举出例如COmpOUnd861、胶霉毒素(gliotoxin)、阿托伐他汀等。
[0084]作为--ΜΡ (例如--ΜΡ1、--ΜΡ2、--ΜΡ3等)的抑制物质，并不是进行限定，可列举出例如抗TIMP的抗体等TIMP活性抑制物质、针对TIMP的RNAi分子、核酸、反义核酸等TIMP产生抑制物质、表达它们的载体、和用它们进行形质转化而得到的细胞等。
[0085]作为α I抗胰蛋白酶抑制物质，并不是进行限定，可列举出例如抗α I抗胰蛋白酶的抗体等α I抗胰蛋白酶活性抑制物质、针对α I抗胰蛋白酶的RNAi分子、核酸、反义核酸等α I抗胰蛋白酶产生抑制物质、表达它们的载体、和用它们进行形质转化而得到的细胞
坐寸ο
[0086]另外，本发明中的“对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物”可以是直接或间接地促进与肠纤维化的发病、发展和/或复发的抑制直接或间接地相关的肠道中的细胞外基质产生细胞的物理、化学和/或生理作用等的任意药物。
[0087]本发明的载体能够递送上述药物中的I种或2种以上。
[0088]本发明中的RNAi 分子包括 siRNA(小干扰 RNA, small interfering RNA)、miRNA (微小 RNA, micro RNA)、shRNA (短发夹 RNA, short hairpin RNA)、piRNA (Piwi 蛋白相作用的 RNA, Piw1-1nteracting RNA)、rasiRNA (重复相关 siRNA, repeat associatedsiRNA)等双链RNA和它们的变体。RNAi分子和表达RNAi的载体可以按照例如普通的教科书(例如実験医学别冊改訂R N A i実験口卜-一> 2004年羊土社、RN A i実験々^这t' Q & A 2006年羊土社等)的教导使用。
[0089]关于这些RNAi的设计，本领域技术人员可以通过参照作为靶的基因的信使RNA序列和已知的RNAi的序列，按照普通的教科书(実験医学别冊改訂RN A i実験Y π卜-一^ 2004年羊土社、RNAi実験々6 (? t Q & A 2006年羊土社)的教导适当进行。
[0090]另外，本发明中的核酸包括RNA、DNA、PNA或它们的复合物。
[0091]作为本发明的载体的递送物，没有限定，可以是抑制肠纤维化的发病、进展和/或复发的除上述药物以外的药物，例如，并不是进行限定，可列举出TGFii I抑制剂(包括TGF β I疫苗)、己酮可可碱及其代谢物、磷酸二酯酶4抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、大建中汤、普伐他汀、脂氧素A4类似物、硫酸基转移酶抑制剂、纤维化促进因子(例如EGF、bFGF、FGF2、PDGF、IGF-1、IGF-11、CTGF、IL-1β、IL-4、IL-13、MCP_1、MIP_1α ,MIP-1β、ΜΙΡ_3α、NODl配体、TLR2、4和5的配体、半乳糖凝集素3、透明质酸、层粘连蛋白、胶原等)的抑制剂、抑制作为肠纤维化发病的原因的炎症的药物、例如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奥沙拉嗪、巴柳氮等氨基水杨酸系药剂、氢化泼尼松、布地奈德等皮质类固醇药、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、环孢菌素、氨甲蝶呤等免疫抑制剂、英夫利昔等TNF α抑制剂、以及甲硝唑(metronidazole)、环丙沙星等抗生素等。这些药物还可以与后述的本发明的组合物并用。这里，“并用”是指将本发明的组合物与上述药物实质上同时给药、和在相同的处理期间内在时间上隔开间隔地给药。在前者的情况下，本发明的组合物可以与上述药物混合后给药、也可以不混合而连续地给药；在后者的情况下，本发明的组合物可以在上述药物之前给药，也可以在上述药物之后给药。
[0092]本发明的一个方式中，作为对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物，可列举出HSP47的抑制剂，例如针对HSP47的siRNA等。
[0093]本发明的载体所递送的物质或物体可以被标记也可以未被标记。通过进行标记，能够监测向靶细胞的递送是否成功、靶细胞的增减等，不仅仅在试验、研究水平特别有用，特别是在临床水平也是有用的。标记可以选自本领域技术人员公知的任意标记，例如任意的放射性同位素、磁性体、在气体或生理条件下产生气体的物质、产生核磁共振的元素(例如氢、磷、钠、氟等)、对产生核磁共振的元素的弛豫时间产生影响的物质(例如金属原子或含有其的化合物)、与标记化物质结合的物质(例如抗体等)、荧光物质、荧光团、化学发光物质、生物素或其衍生物、抗生物素蛋白或其衍生物和酶等。标记还可以附着于载体构成成分，也可以作为独立的递送物载持在载体上。
[0094]本发明中，“肠道中的细胞外基质产生细胞用”或“肠道中的细胞外基质产生细胞递送用”是指适于将肠道中的细胞外基质产生细胞作为靶细胞使用，其包括例如能够向所述细胞比向其他细胞例如正常细胞更迅速、高效和/或大量地递送物。例如，与向其他细胞相比，本发明的载体能够以1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、进而3倍以上的速度和/或效率向肠道中的细胞外基质产生细胞递送物质。
[0095]本发明还涉及含有所述载体和所述对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物的、用于对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的、用于对肠纤 维化进行处理的或用于由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的组合物以及所述载体在这些组合物的制造中的用途。本发明组合物的一个方式含有用于靶向于肠道中的细胞外基质产生细胞的有效量的类视黄醇。另外，本发明组合物的一个方式为利用类视黄醇靶向于肠道中的细胞外基质产生细胞。
[0096]本发明中的肠纤维化是指以肠壁中的瘢痕组织的过量蓄积为特征的病理状态，包括继发于慢性的肠道炎症、例如慢性化的炎症性肠道疾病(药剂性肠炎、感染性肠炎等原因确定的特异性炎症性肠道疾病、和克隆氏病、溃疡性结肠炎等原因不明的非特异性炎症性肠道疾病)、放射线照射导致的组织损伤、伴随着手术或外伤的肠道粘连等的肠纤维化。
[0097]本发明中，“由纤维化肠道组织再生正常肠道组织”是指使因纤维化而变质的肠道组织回复到至少纤维化较为轻度的状态。即，随着肠道纤维化的进展，肠道组织被替换成以细胞外基质为代表的纤维组织，将该趋势逆转，使增生的纤维组织替换为原来的正常组织即本发明中的由纤维化肠道组织再生正常肠道组织。因此，本发明中的由纤维化肠道组织再生正常肠道组织不仅仅包括使纤维化肠道组织完全回复到原来的状态，还包括使纤维化肠道组织部分地回复到原来的状态。正常肠道组织再生的程度可采用试样活检等组织学检查并基于组织结构的正常化、纤维组织所占的区域的缩小、正常组织所占的区域的扩大等来进行评价，当在利用本组合物进行处理之前可见纤维化所引起的生化学指标等的异常的情况下，也可通过该指标等的改善等来进行评价。
[0098]本发明的组合物中，只要载体中所含的类视黄醇以作为靶向剂发挥功能的状态存在，则载体可以在其内部含有递送物，也可以附着存在于递送物的外部，或者也可以与递送物混合。因此，根据给药途径和药物释放模式等的不同，可以将上述组合物用适当的材料例如肠溶性包衣剂或定时崩解性材料包覆，也可以组合到适当的药物释放系统中。此外，本发明的组合物也可以是结合有类视黄醇的脂质体与有效成分的复合物、即lipoplex的形态。另外，在载体仅由类视黄醇构成的情况下，本发明的组合物也可以是对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物与类视黄醇的复合物的形态。
[0099]本发明的组合物可以作为医药使用(即医药组合物)，可以通过包括经口和非经口这两种在内的各种途径，例如，并不是进行限定，可以通过经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肺内、气道内、气管内、支气管内、经鼻、经胃、经肠、直肠内、动脉内、门静脉内、心室内、骨髓内、淋巴结内、淋巴管内、脑内、脑脊液腔、脑室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内和子宫内等途径给药，也可以制成适于各给药途径的剂型。所述剂型和制剂方法可以适当采用任意公知的剂型和制剂方法(例如参照標準薬剤学、渡边喜照6編、南江堂、2003年等)。
[0100]例如，作为适于经口给药的剂型，并不是进行限定，可列举出散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体制剂、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外，作为适于非经口给药的剂型，可列举出溶液性注射剂、悬浮性注射剂、乳液性注射剂、用时制备型注射剂等注射剂。非经口给药用制剂可以为水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态。
[0101]本发明还涉及一种肠纤维化处理用医药组合物或用于由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的组合物的制造方法，其包含分别将类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂、将对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物作为有效成分进行配合的工序。关于类视黄醇的配合方法，只要在所配合的组合物中类视黄醇能够作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂发挥功能，则没有特别限定，例如可采用本说明书中记载的各种方法。另外，关于有效成分的配合方法，只要有效成分能够发挥规定的效果，则没有特别限定，可以采用任意公知的方法。有效成分的配合可以与类视黄醇同时进行，也可以在配合类视黄醇前、或在配合类视黄醇后进行。例如在组合物含有除类视黄醇以外的载体构成成分的情况下，有效成分的配合可以通过将已配合有类视黄醇作为靶向剂的载体与有效成分混合等来进行，也可以将类视黄醇、除类视黄醇以外的载体构成成分和有效成分同时混合等来进行，或者也可以通过在将有效成分配合到除类视黄醇以外的载体构成成分后，将其与类视黄醇混合等来进行。
[0102]类视黄醇的配合量等如在关于本发明的载体中已经叙述的。此外，关于有效成分的配合量，在以组合物形式给药的情况下，可以是能够抑制肠纤维化的发病或复发、改善病理状态、减轻症状、或者延缓或使其停止进展的量，优选是能够预防肠纤维化的发病和复发或使其治愈的量，或者是可由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的量。另外，优选是不会产生超过给药所带来的好处的不良影响的量。所述量是公知的，也可以通过使用了培养细胞等的体外试验或者通过小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型的试验来适当确定，这样的试验方法对于本领域技术人员来说是熟知的。作为肠纤维化的动物模型，可列举出例如Pizarro etal.,Trends Mol Med.2003May ；9(5):218-22 中记载的动物模型(例如 TNBS 诱导模型、DSS诱导模型、噁唑酮诱导模型、⑶4+⑶45RBhigh SCID transfer模型、tg ε 26骨髄嵌合体小鼠、IL-10K0 小鼠、Τ,ΛΑΚΕ 模型、C3H-HeJBir 小鼠、SAMPl/Yit 小鼠、SAMPl/YitFc 小鼠等)。其中，SAMPl/Yit小鼠作为人的克隆氏病的肠纤维化的动物模型是有用的。有效成分的配合量可根据组合物的给药方式的不同而变化。例如在I次给药中使用多个单位的组合物的情况下，I单位组合物中配合的有效成分的量可以设定为I次给药所需要的有效成分的量的几分之一。该配合量的调整是本领域技术人员能够适当进行的。
[0103]本发明的载体或组合物可以以任何形态供给，但从保存稳定性的观点出发，优选为能够用时制备的形态，例如以在医疗现场或其附近能够由医生和/或药剂师、护士或者其他辅助医务人员等制备的形态提供。在此情况下，本发明的载体或组合物以包含这些所必需的构成要素中的至少I个的I个或2个以上的容器的形式提供，在使用前，例如使用前24小时以内、优选为使用前3小时以内，更优选在即将使用前制备。制备时，可以适当使用在进行制备的场所通常能够获得的试剂、溶剂、调剂器具等。
[0104]因此，本发明还涉及所述载体或者所述组合物的制备试剂盒，其包括I个或2个以上的容器，所述容器单独或组合地含有类视黄醇、和/或递送物、和/或除类视黄醇以外的载体构成物质；以及涉及以这种试剂盒的形式提供的所述载体或所述组合物的必要构成要素。本发明的试剂盒，除上述以外，还可以包含有关本发明的载体和组合物的制备方法和给药方法等的指示、例如说明书或CD、DVD等电子记录介质等。另外，本发明的试剂盒可以包括用于完成本发明的载体或组合物的全部构成要素，但也可以不必包括全部的构成要素。因此，本发明的试剂盒可以不包括在医疗现场、实验设施等通常能够获得的试剂或溶剂，例如无菌水、生理盐水或葡萄糖溶液等。
[0105]本发明进一步涉及用于对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的、用于对肠纤维化进行处理的、或用于由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的方法，其包含将有效量的上述组合物向需要该组合物的对象进行给药。这里，关于有效量，例如对于后者，是指抑制肠纤维化的发病和复发、改善病理状态、减轻症状或者延迟或使其停止发展的量，优选是可预防肠纤维化的发病和复发、或使肠纤维化治愈的量，或者是可由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的量。另外，优选为不会产生超过给药所带来的好处的不良影响的量。所述量可以通过使用了培养细胞等的体外试验或者通过小鼠、大鼠、狗或猪等动物模型的试验来适当确定，这样的试验方法对于本领域技术人员来说是熟知的。另外，载体中所含的类视黄醇以及本发明的方法中使用的药物的用量对于本领域技术人员也是公知的，或者可以通过上述试验等来适当确定。作为肠纤维化的动物模型，如上文所述。
[0106]在本发明的方法中，进行给药的组合物的具体用量可以考虑与需要处理的对象相关的各种条件，例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给药途径、给药的时期和频率、并用的医药、对治疗的反应性以及对治疗的依从性等来确定。
[0107]作为给药途径，包括经口和非经口这两种在内的各种途径，例如经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肺内、气道内、气管内、支气管内、经鼻、经胃、经肠、直肠内、动脉内、门静脉内、心室内、骨髓内、淋巴结内、淋巴管内、脑内、脑脊液腔、脑室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内和子宫内等途径。
[0108]给药频率根据所用组合物的性状和上述那些对象的条件的不同而不同，例如可以I日多次(即I日2、3、4次或5次以上)、1日I次、每几日(即每2、3、4、5、6、7日等)、1周几次(例如I周2、3、4次等)、每周、每几周(即每2、3、4周等)。
[0109]在本发明的方法中，词语“对象”是指任意的生物个体，优选为动物、更优选为哺乳动物、进一步优选为人的个体。在本发明中，对象可以是健康的，也可以患有某种疾病，但在希望对肠纤维化进行处理的情况下，典型地是指患有肠纤维化或有患病危险的对象。例如当希望预防肠纤维化时，并不是进行限定，典型的例子是患有炎症性肠道疾病、伴随着手术或外伤等的肠道粘连等作为肠纤维化的原因的疾病的对象。
[0110]另外，词语“处理”定义为包括以疾病的治愈、暂时缓解或预防等为目的的医学上可容许的所有种类的预防性和/或治疗性干预。例如，词语“处理”的含义包括肠纤维化的进展的延缓或停止、病变的萎缩或消失、肠纤维化发病的预防或复发的防止等各种目的的医学上可容许的干预。
[0111]本发明还涉及利用了上述载体的、针对肠道中的细胞外基质产生细胞的药物递送方法。该方法，并不是进行限定，包括例如使递送物载持于上述载体的工序、和将载持了递送物的载体给予或添加到含有肠道中的细胞外基质产生细胞的生物或介质、例如培养用培养基等的工序。这些工序可以按照公知的任意方法或本说明书中记载的方法等来适当完成。上述递送方法还可以与其他的递送方法、例如以肠道为靶的其他递送方法等组合。另外，上述方法还包括在体外进行的方式、以及以体内的肠道中的细胞外基质产生细胞为靶的方式。关于本发明的可通过载体输送的物质，如上所述。
[0112]本发明还涉及一种肠道中的细胞外基质产生细胞株，其来自由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织、并具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型。
[0113] 作为肠纤维化患病对象，没有限定，可列举出例如被诊断为肠纤维化的对象、肠纤维化的动物模型。肠纤维化的診断可通过病历、利用钡造影等进行的肠道狭窄的确认、试样活检的病理组织检查等来进行。纤维化肠组织的采集可通过外科手术、或使用了内窥镜等的活检等任意可能的方法来进行。表现型没有限定，例如可通过利用抗波形蛋白抗体、抗α SM抗体和抗GFAP抗体的免疫染色、或波形蛋白、a SMA和GFAP基因的表达分析等来确认。上述各抗体可以使用市售品，也可以通过用各蛋白对动物进行免疫等已知的方法来新制作。上述细胞株可以表达HSP47或其同源物(例如gp46)、胶原、VA储藏相关基因、例如ADRP、LRAT和/或LXR β等。另外，上述细胞株即使在体外进行培养，a SMA和GFAP也不会变为阳性。上述细胞株还可以通过导入永生化基因(例如SV40T、端粒酶基因等)来进行永生化。
[0114]上述细胞株可以在用于间质细胞的通常的培养条件下进行培养。作为所述条件，没有限定，可列举出例如用含有10% FBS的DMEM、在5% C02、37°C下的培养。
[0115]本发明还涉及一种分离肠道中的细胞外基质产生细胞的方法，其包含:
[0116](i)从由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织获得细胞的工序、和
[0117](ii)从(i)中获得的细胞中选择具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的细胞的工序。[0118]从纤维化肠组织获得细胞没有限定，例如可以对任意地切细了的组织进行培养，从其中获得游走细胞，用蛋白分解酶(例如胶原酶、蛋白酶等)对组织进行处置，从其中获得分离的细胞。
[0119]细胞的选择没有限定，例如通过有限稀释法等将细胞分离成单细胞，然后通过免疫染色或基因表达分析等确认各克隆的表现型来进行，也可以用细胞仪对用抗波形蛋白抗体、抗a SMA抗体和/或抗GFAP抗体进行了标记的单细胞悬浮液进行处置来进行。
[0120]本发明还涉及一种制作肠道中的细胞外基质产生细胞株的方法，其包含:
[0121](i)从由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织获得细胞的工序、和
[0122](ii)从(i)中获得的细胞中选择具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的细胞的工序，
[0123]并且包含在工序(i)或(ii)之后使细胞永生化的工序。
[0124]细胞的永生化可通过导入永生化基因(例如SV40T、端粒酶基因等)等来进行。永生化可以在选择所希望的表现型的细胞之前进行，也可以在选择后进行。关于除使细胞永生化的工序以外的构成，关于分离肠道中的细胞外基质产生细胞的方法，如上所述。
[0125]本发明还涉及一种筛选肠纤维化处理因子的方法，其包含:
[0126](i)使来自由上述的肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织、并具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的肠道中的细胞外基质产生细胞株与受检因子共存的工序，和
[0127](ii)对与受检因子共存所导致的细胞株的变化进行检测的工序。
[0128]本发明中，受检因子除了化合物等物质外，还包括热、电磁波(例如电波、光线、X射线、Y射线等)、压力、PH等各种因子。使细胞株与受检因子“共存”是指将细胞株与受检因子置于同一介质中，但并不一定需要使二者相互接触。细胞株与受检因子的共存例如，没有限定，包括将细胞株和受检因子放入同一容器等。细胞株与受检因子的共存可以在体内进行，也可以在体外进行。
[0129]作为与受检因子共存所导致的细胞株的变化，没有限定，可列举出例如细胞株的活性的抑制或亢进(例如基因表达或物质产生的抑制或亢进)、细胞株增殖的抑制或增强等。因此，例如因与受检因子的共存细胞株的增殖受到抑制或细胞株的活性受到抑制表示该受检因子为肠纤维化处理因子。
[0130]本发明还涉及一种用于筛选肠纤维化处理因子的试剂盒，其包含来自由上述的肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织并具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的肠道中的细胞外基质产生细胞株。本试剂盒中除了所述细胞株外，还可以包含用于检测细胞株的变化的试剂、有关使用本试剂盒筛选肠纤维化处理因子的方法的指示、例如说明书或⑶、DVD等电子记录介质等。
[0131]实施例
[0132]用以下例子进一步详细地对本发明进行说明，但这些例子仅仅是示例，并不是对本发明进行限定。
[0133]MA克隆氏病小鼠模型SAMPl/Yit的肠道中的星状细胞样细胞的鉴定
[0134]为了研究克隆氏病的纤维化中相当于肝星状细胞的细胞是否参与，使用了作为克隆氏病小鼠模型的SAMPl/Yit。SAMPl/Yit小鼠如下:使AKR/J小鼠的一母所生的小鼠交配24代制作SAMPl小鼠，使SAMPl小鼠中皮肤具有溃疡的小鼠进一步在近亲间交配20代以上得到自然发病小鼠模型，使该自然发病小鼠模型到20周龄为止自发地发生回肠炎(Matsumoto et.al.，Gut.1998Jul ；43 (I):71_8),其在病理组织上具有可观察到(i)与克隆氏病类似的炎症好发于回肠末端、(ii)病变非连续且全层性分布、(iii)肌层肥厚、隐窝过度形成、绒毛萎缩、炎症细胞向粘膜固有层和粘膜下层浸润、潘氏细胞和杯细胞过度形成、肉芽肿、隐窝脓肿等特征(Kosiewicz et al., J Clin Invest.2001Mar ；107 (6):695-702)。几乎所有的IBD小鼠模型都是发生结肠炎的模型，但认为具有上述特征的SAMPl/Yit小鼠是现有的动物疾病模型中最接近克隆氏病的病理状态的小鼠模型(Pizanx)et al.，Trends Mol Med.2003May ；9 (5):218-22)。
[0135]为了在SAMPl/Yit小鼠的肠道组织中进行星状细胞样细胞的鉴定，通过组织免疫染色法对回肠纤维化部位进行了研究。首先，采集SAMPl/Yit小鼠(29周龄、由Yakult中央研究所提供)的回肠组织。将组织用30%中性福尔马林固定24小时后，石蜡包埋，制作成薄切切片，作为样品切片。对样品切片进行偶氮卡红染色，观察纤维化的状态，结果可见肥厚的肌层细胞间有胶原纤维的蓄积(图1(a))。此外，对连续切片进行使用了针对肝星状细胞标记物的抗体的免疫组化分析。作为抗体，使用了抗波形蛋白抗体(Ant1-Vimentin, Abeam, clone RV202, cat.N0.ab8978、标记:Alexa Fluor488)、抗 a SMA抗体(Ant1-Glial Fibrillary Acidic Protein,Dako,Polyclonal Rabbit,Code N0.Z0334、标记:DyLight633)和抗 GFAP 抗体(Ant1-a-Smooth Muscle Actin, SIGMA, clonelA4,cat.N0.A2547、标记:Cy3)。按照常规进行突光免疫染色后，用激光共聚焦显微镜进行观察，结果在回肠肌层的纤维化病变部位沿着蓄积的胶原纤维可见大量具有波形蛋白(+)/aSMA( —)/GFAP( —)表现型的细胞的局部分布(参照图1(b)~(山、箭头)。另一方面，在作为背景小鼠的AKR/J小鼠的回肠肌层部位未见所述细胞的存在。该结果启示静止型肝星状细胞样的具有波形蛋白(+)/a SMA( — )/GFAP( 一 )表现型的细胞参与纤维化。
[0136]Ml从SAMPl/Yit小鼠的纤维化小肠组织建立星状细胞样细胞株
[0137]为了将例I中观察到的细胞在体外进行功能分析并进而利用其进行肠纤维化治疗法的研究等，从SAMPl/Yit小 鼠的纤维化小肠组织分离、培养了具有波形蛋白(+)/a SMA ( — )/GFAP( 一 )表现型的星状细胞样细胞，建立了星状细胞样细胞株。[0138]首先，采集SAMPl/Yit小鼠(21周龄)的回肠组织，用剪刀细切至Imm长左右后，浸入到EDTA溶液(HBSS (pH为7.5)中的4.5mM EDTA溶液、以下相同)20mL中，轻轻振荡。在4°C下静置15分钟后，除去上清，再悬浮到新鲜的EDTA溶液中。将EDTA溶液交换5次后，将回肠组织片悬浮到含有10% FBS的DMEM中，播种到6孔培养皿中，在5% CO2中、37°C下进行培养。在培养开始后的第5日，表现间质细胞样形态的细胞群附着在培养皿上并开始增殖。此时，通过逆转录病毒载体 pMFG-tsT-1RES-neo (Kawano et al.,Blood.2003Janl5 ；101(2):532-40)导入永生化基因SV40T，得到IC10_F2细胞系(图2上一行)。之后，通过有限稀释法和利用上述抗α SM抗体、抗GFAP抗体和抗波形蛋白抗体的免疫染色法对IC10_F2细胞系尝试克隆具有波形蛋白(+) / a SMA ( —)/GFAP ( 一 )表现型的细胞，结果建立了具有所述表现型的肠道来源的星状细胞样细胞株IC10_F2_E9(图2下一行)。
[0139]用实时PCR研究建立的IC10_F2_E9是否表达作为星状细胞特征的VA储藏相关基因群。首先，使用 RNeasy Mini Kit (QIAGEN, 74104)由 IC10_F2 细胞和 IC10_F2_E9 细胞分别制备全 RNA,使其与逆转录酶(High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix, AppliedBiosystems, 4390713)反应，制作 cDNA。使用得到的 cDNA、用 LightCycler(K)480 系统(RocheApplied Science)中的实时PCR测定维生素A储藏相关基因群(ADRP、LRAT和LXR β )的表达量。PCR试剂使用 LightCycler(R)480Probes Master (Roche Applied Science, 4707494)。探针使用 Universal ProbeLibrary Probes (Roche Applied Science)中所含的探针(波形蛋白:Probe#79，4689020、a SMA:Probe#lI，4685105、ADRP:Probe#79，4689020、LRAT:Probe#79，4689020、LXRβ:Probe#106,4692250)。
[0140]另外，使用的引物如下(下文，“F”表示正向引物、“R”表示反向引物)。
[0141]波形蛋白:
[0142]F5’TGCGCCAGCAGTATGAAA3’(序列号 I)
[0143]R5’GCCTCAGAGAGGTCAGCAAA3’(序列号 2)
[0144]aSMA:
[0145]F5’TCACCATTGGAAACGAACG3’(序列号 3)
[0146]R5，ATAGGTGGTTTCGTGGATGC3’(序列号 4)
[0147]ADRP:
[0148]F5，CCTCAGCTCTCCTGTTAGGC3’(序列号 5)
[0149]R5，CACTACTGCTGCTGCCATTT3’(序列号 6)
[0150]LRAT:
[0151]F5’GAAGGTGGTCTCCAACAAGC3’(序列号 7)
[0152]R5，TACTGTGTCCACACGGATGC3’(序列号 8)
[0153]LXR β:
[0154]F5’GCTCTGCCTACATCGTGGTC3’(序列号 9)
[0155]R5，CTCATGGCCCAGCATCTT3，(序列号 10)
[0156]其中，ADRP为局部分布于脂滴膜上且与脂滴的生物合成、代谢相关的ΡΑΤ(脂肪包被蛋白?脂肪分化相关蛋白.ΤΙΡ47,Perilipin ^adipophilin.ΤΙΡ47)蛋白中的一种(Leeet al., J Cell Physiol.2010Jun ；223(3):648-57)，LRAT 为视黄醇酯化酶，在肝星状细胞中局部分布于内质网膜上，并与VA的储藏相关(Nagatsuma et al., Liver Int.2009Jan ；29(1):47-54),LXR^为与脂质代谢、抗炎症相关的核内受体，在肝星状细胞中可见mRNA水平的表达(Beaven Sff.et al., Gastroenterology.201 IMar ； 140 (3): 1052-62)。其结果，与母株IC10_F2相比，IC10_F2_E9显示ADRP为2.4倍、LRAT为27倍、LXRP为2.4倍的基因表达(图3)。其结果显示IC10_F2_E9具有星状细胞的特征。
[0157]M3 含有SiRNA的VA结合脂质体的制备
[0158](l)siRNA
[0159]以胶原(I~IV型)的共通分子伴侣HSP477 (小鼠、GenBank AccessionN0.X60676)的碱基序列为靶的siRNA使用下述siRNA。
[0160]A:GGACAGGCCUGUACAACUA(从小鼠HSP47的碱基序列上的第969个碱基开始的有义链siRNA序列，序列号11)
[0161 ] B:UAGUUGUACAGGCCUGUCC (反义链 siRNA 序列，序列号 12)
[0162]作为对照的si RNArandom(有时也称为siRNAscramble (简写:scr))使用下述siRNArandom。
[0163]C:CCUCCAAACCAAUUGGAGG(有义链 siRNA，序列号 13)
[0164]D:CCUCCAAUUGGUUUGGAGG(反义链 siRNA，序列号 14)
[0165](2) VA-lip-siRNA 的制备
[0166]作为阳离子性脂质，从北海道System Science (Sapporo, Japan)购得以4:3:3的摩尔比含有0，O’ - 二(十四烷基)_ N -(α-三甲基胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)、胆固醇和二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)的阳离子性脂质体(LipoTrust)。使用前通过在搅拌条件下在经冷冻干燥的脂质混合物中添加再蒸留水(DDW)，从而以lmM(DC-6-14)的浓度制备脂质体。为了制备VA结合脂质体，将溶解于DMSO的20nmol的维生素A (视黄醇、Sigma，USA)与脂质体悬浮液(以DC-6-14计为20nmol)在1.5ml试管中一边搅拌一边在25°C下混合。为了制备载持有siRNA HSP47的VA结合脂质体(VA-lip-siRNA HSP47)，将siRNA HSP47溶液(DDW中为3nmol/ml) —边搅拌一边在室温下添加到视黄醇结合脂质体溶液中。siRNA与DC-6-14的摩尔比为1:400。为了获得适于体外使用的用量，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)对VA-lip-siRNA进行再构成。
[0167]Mi:向IC_F2_E9细胞导入siRNA和HSP47表达的抑制
[0168]在含有10 % FBS的DMEM中以I X IO4个/孔含有IC_F2_E9细胞的6孔MULTIDISH(N140675, Nunc?)中添加100 μ I例3中得到的含有siRNA的VA结合脂质体，在37°C、C025%下孵育I小时后，更换培养基，进一步在37°C、C025%下孵育48小时。之后，回收细胞，采用与例2同样的方法制备全RNA。使得到的全RNA与逆转录酶反应，制作cDNA，然后用实时PCR对HSP47的表达抑制进行评价。所用的引物如下所述。
[0169]F:5，GAAGGCTGTCGCCATCTC3，(序列号 15)
[0170]R:5，CCCAGTCCTGCCAGATGT3’ (序列号 16)
[0171]由图4所示的结果可知，IC10_F2_E9细胞中HSP47基因得到表达和该基因的表达仅被含有siRNA的VA结合脂质体抑制。鉴于siRNA在细胞内发挥作用，该结果表示IC10_F2_E9细胞具有胶原产生能力，并且类视黄醇作为强烈地促进物质向肠道中的细胞外基质产生细胞即IC10_F2_E9细胞的摄入的靶向剂发挥作用。
【权利要求】
1.一种针对肠道中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂。
2.根据权利要求1所述的载体,其中,类视黄醇包含视黄醇。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其含有类视黄醇和除类视黄醇以外的载体构成要素，且类视黄醇与除类视黄醇以外的载体构成要素的摩尔比为8:1~1:4。
4.一种肠纤维化处理用医药组合物，其含有上述权利要求1~3中任一项所述的载体、和对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物。
5.一种用于由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的医药组合物，其含有上述权利要求1~3中任一项所述的载体、和对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物。
6.根据权利要求4或5所述的医药组合物，其中，对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物选自抑制细胞外基质成分的产生/分泌的物质、细胞增殖抑制物质、细胞凋亡诱导物质、--ΜΡ抑制物质以及α 1抗胰蛋白酶抑制物质。
7.根据权利要求6所述的医药组合物，其中，抑制细胞外基质成分的产生/分泌的物质为HSP47的抑制剂。
8.根据权利要求4~7中任一项所述的医药组合物，其为用时制备形态。
9.权利要求4~8中任一项所述的医药组合物的制备试剂盒，其包含I个或I个以上的容器，所述容器单独或组合地包含对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物、类视黄醇以及根据需要的除类视黄醇以外的载体构成物质。
10.一种针对肠道中的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体的制造方法，其包含将类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂进行配合的工序。
11.一种肠纤维化处理用医药组合物或用于由纤维化肠道组织再生正常肠道组织的医药组合物的制造方法，其包含分别将类视黄醇作为针对肠道中的细胞外基质产生细胞的靶向剂、将对肠道中的细胞外基质产生细胞的活性或增殖进行控制的药物作为有效成分进行配合的工序。
12.一种肠道中的细胞外基质产生细胞株，其来自由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织，并具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型。
13.一种分离肠道中的细胞外基质产生细胞的方法，其包含: (i)从由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织获得细胞的工序、和(?)从⑴中获得的细胞中选择具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的细胞的工序。
14.一种制作肠道中的细胞外基质产生细胞株的方法，其包含: (i)从由肠纤维化患病对象采集的纤维化肠组织获得细胞的工序、和(?)从⑴中获得的细胞中选择具有波形蛋白阳性、a SMA阴性且GFAP阴性的表现型的细胞的工序、 并且包含在工序(i)或(ii)之后将细胞永生化的工序。
15.一种筛选肠纤维化处理因子的方法，其包含: (i)使权利要求12所述的细胞株与受检因子共存的工序、和 (?)对因与受检因子共存而导致的细胞株的变化进行检测的工序。
16.一种用于筛选肠纤维化处理因子的试剂盒，其包含权利要求12所述的细胞株。
【文档编号】A61K31/713GK103917248SQ201280054464
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2011年11月18日
【发明者】绫部时芳, 中村公则, 味吞宪二郎, 田中康进 申请人:日东电工株式会社