双特异性抗体的制作方法
【专利摘要】本申请提供双特异性抗体，其由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞具有特异性，该单价单元针对肿瘤细胞或微生物具有特异性。该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(scFv)且该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途和诊断用途。
【专利说明】双特异性抗体
【背景技术】
[0001] 双特异性抗体（BsAb)为具有两种不同结合特异性的抗体或抗体类分子。BsAb广 泛应用于生物医学，尤其是针对肿瘤的免疫治疗中。目前，对于免疫治疗研究的一个关注焦 点为如何利用BsAb的细胞介导的细胞毒性来杀死肿瘤细胞。BsAb可设计为同时靶向作用 于肿瘤细胞和效应细胞，同时激发效应细胞使其杀灭肿瘤细胞。
[0002] BsAb可通过例如化学工程、细胞工程以及基因工程的方法制备。基因工程的优势 在于能够容易地改造抗体，使得能够设计和生产许多不同形式的双特异性抗体片段，包括 双体，串联的（tanderm)ScFv和单链双体及其衍生物（参见Jin和Zhu,于"the design and engineering of IgG-Like bispecific antibodies，', RE Kontermann (编），Bispecific antibodies)。由于这些BsAb不具有IgG Fe结构域，因此它们的小的尺寸使得它们渗透进 入肿瘤的能力增强，但它们在体内具有相当短的半衰期并且缺乏ADCC作用，该作用与抗体 的恒定区相关联。
[0003] 为了增强稳定性和治疗能力，对重链进行重组基因改造以促进它们的异二聚化并 获得较高的含Fc的IgG类双特异性抗体的产量。已经有几种合理的设计方案用于改造抗体 CH3链用于异二聚化，即，二硫键、盐桥、件-臼（knobs-into-holes)。在并置的位置处产生 件（knob)和臼（hole)的基础在于该件和臼相互作用将有助于形成异二聚体，然而件-件 和臼-臼相互作用因有利的相互作用缺失而不利于形成同二聚体。尽管该杵-臼方案解 决了重链同二聚化问题，但这没有解决来自两种不同抗体的轻链和重链之间的错配问题。 虽然有可能对于两种不同抗体识别相同的轻链，但使用具有相同轻链的两种抗体序列构建 BsAb的可能性非常小。
[0004] 因此需要提供更好的易于制备的BsAb，并且该BsAb具有较好的临床稳定性和效 力和/或减弱的系统毒性。
【发明内容】
抟术问是页
[0005] 本申请的一个实施例提供了一种抗体，该抗体包含：(a)轻链-重链对，该轻链-重 链对针对肿瘤细胞或微生物具有特异性；和（b)融合肽，该融合肽包含单链可变片段（scFv) 和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞具有特异性。 抟术解决方案
[0006] 在某些方面，该轻链-重链对针对肿瘤抗原具有特异性。一方面，该肿瘤抗原选 自：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、 CIX、PSMA、叶酸盐结合蛋白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素（Integrin)、ανβ3、 α 5 β 1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、ΕΡΗΑ3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和肌膜蛋白 (Tenascin)。一方面，该轻链-重链对针对较对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达 的蛋白具有特异性。
[0007] 在某些方面，该轻链-重链对针对病毒或细菌具有特异性。一方面，该轻链-重链 对针对内毒素具有特异性。
[0008] 在某些方面，该免疫细胞选自T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、 树突细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞和肥大细胞。
[0009] 在某些方面，该融合肽针对以下抗原具有特异性，该抗原选自⑶3、⑶16、⑶19、 CD28 和 CD64。
[0010] 在某些方面，该轻链通过二硫键与该重链结合。在某些方面，该重链通过一个或多 个二硫键与该融合肽结合。一方面，该重链包含人或者人源化的（humanized)Fc片段。一 方面，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段。一方面，该融合肽的Fc片段包含人或者人源 化的Fc片段。一方面，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
[0011] 在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处 或多处替换，该替换在该重链和Fc片段之间形成离子键。一方面，这些替换选自表1。
[0012] 在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处 或多处替换，该替换在该重链和Fc片段之间形成杵-白结构配对。一方面，这些替换选自 表2。
[0013] 在某些方面，该CH2结构域位于该SCFv片段和CH3结构域之间。一方面，该融合 肽不包含CHl结构域。
[0014] 在一个实施例中，本申请还提供一种包含上述任一实施例中的抗体的组合物。一 方面，载体为药物载体。
[0015] 另一实施例提供了一种复合体，该复合体包含与一个或多个抗原结合的上述任一 实施例中的抗体。
[0016] 本申请进一步提供了一种抗体的制备方法，该方法包括：将（a)轻链-重链对和 (b)融合肽混合，该轻链-重链对针对免疫细胞具有特异性，且该融合肽包含单链可变片段 (scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽对于肿瘤细胞具有特异 性。一方面，本申请提供一种可通过该方法获得的抗体。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1显示了本申请的双特异性抗体的一个实施例的结构；
[0018] 图2显示了图1双特异性抗体的每条链的表达载体的构造；
[0019] 图3为1 %琼脂糖凝胶电泳图：泳道M :DL2000指示物（marker);泳道1 :赫赛汀 (Here印tin) VH ;泳道2 :赫赛汀VL ;泳道3 :人IgGlCH区域（CH1+铰链+Fe);泳道4 :人 IgCL ；
[0020] 图4为1 %琼脂糖凝胶电泳图：泳道M :DL1000DNA指示物；泳道1 :人源化的 0KT3 (H0KT3) VH-接头；泳道 2 :接头-H0KT3VL ;
[0021] 图5为1 %琼脂糖凝胶电泳图：泳道M :DL10000DNA指示物；泳道I :H0KT3单链；
[0022] 图6-8为用于定点诱变的质粒的限制图谱；
[0023] 图9显示了 6%凝胶SDS-PAGE图和蛋白质印记（Western blot)图。样品为293F 细胞上清液。泳道M :蛋白指示物；泳道1 :赫赛汀mAb ;泳道2 :T366W修饰的H0KT3单链 +Y407A修饰的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道3 :T366W K392D和K409D修饰（TKK)的H0KT3 单链+D356K D399K Y407A修饰（DDY)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道4:K392D和K409D 修饰（KK)的H0KT3单链+D356K D399K修饰（DD)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道5 :T366W K392D和K409D修饰（TKK)的H0KT3单链+L368R D399K Y407A修饰（LDY)的赫赛汀重链 +赫赛汀轻链；泳道6 :T366W K392D和K409D修饰（TKK)的H0KT3单链+D399KY407A修饰 (DY)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；
[0024] 图10显示了 6% SDS-PAGE凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色结果，该图显示：泳道 M :蛋白标记物；泳道1 :纯化的MSBODY ;泳道2 :赫赛汀；泳道3 :H0KT3单链；
[0025] 图11显示了抗Her2X抗⑶3MSB0DY结合至BT474细胞（A)和外周血单核细胞 (PBMC) (B)的细胞表面结合的流式细胞分析，其中，灰线：PBS对照；黑实线=MSBODY ;黑虚 线：赫赛汀；
[0026] 图12包括四张显示细胞聚集的显微镜图片；
[0027] 图13显示抗体介导的细胞毒性；
[0028] 图15A-E显示了实施例4中检测的某些抗体的结构。A :MSB0DY ;B :SMB0DY ;C : SSBODY ;D :赫赛汀单链抗体；E :H0KT3单链抗体；
[0029] 图 16A-B 显示 了将抗 Her2x 抗 CD3MSB0DY 和 SMBODY 结合至 BT474 细胞（A)和 PBMC 细胞（B)的结合情况；
[0030] 图17显示了 MSBODY比SMBODY对BT474细胞具有更高的结合活性；
[0031] 图18显示了热挑战分析的结果；
[0032] 图19显示了抗体介导的对BT474、MCF-7和MDA-MB-231细胞的细胞毒性的结果。
【具体实施方式】
[0033] 定义
[0034] 应注意非明确数量的实体限定应指一或多个（种）该实体；例如，"双特异性抗体" 应理解为表示一或多个（种）双特异性抗体。同样地，非明确数量限定的、术语"一个或多 个"和"至少一个"本文中可互换使用。
[0035] 本文使用的术语"多肽"用于包括单数的"多肽"以及复数的"多肽"，并且也指通 过酰胺键（也称为肽键）线性连接的单体（氨基酸）组成的分子。术语"多肽"是指两个 或多个氨基酸的任一条或多条链，而不是指特定长度的该产物。因此、肽、二肽、三肽、寡肽、 "蛋白"、"氨基酸链"、或任何指两个或多个氨基酸组成的一条或多条链的其他术语都包括 在"多肽"的定义中，且术语"多肽"可代替这些术语的任何一个或与它们互换使用。术语 "多肽"也用于指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、 通过已知的保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解或通过非自然产生的氨基酸的修饰。多 肽可衍生自天然的生物源或通过重组技术生产，但不一定由指定核酸序列翻译而成。其可 以任何方式产生，包括通过化学合成方式。
[0036] 本文使用的关于细胞、核酸（如DNA或RNA)的术语"分离的"，是指分别从其他的 以天然来源的大分子存在的DNA或RNA分离的分子。本文使用的术语"分离的"也指通过 重组DNA技术生产时基本不含细胞材料，病毒材料或培养基的核酸或肽，或经化学合成制 备时基本不含化学前体或其他化学品。此外，"分离的核酸"是指包括非自然产生为片段的 核酸片段，且这些片段自然状态下不存在。本文中术语"分离的"也用于指从其他细胞蛋白 或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽是指包括纯化的和重组的多肽。
[0037] 本文使用的术语"重组"，在涉及多肽或多核苷酸时指自然状态下不存在的多肽或 多核苷酸的形式，其中一个非限制性的例子，可以通过将通常不会一起出现的多核苷酸或 多肽组合在一起来实现。
[0038] "同源性"或"同一性"或"相似性"是指两个肽链分子之间或两个核酸分子之间的 序列相似程度。同源性可通过比较每个序列中的位置来测定，可通过比对来进行比较。当 在被比较的序列中的位置上有相同的碱基或氨基酸时，在该位置上的分子为同源的。多个 序列之间的同源度为这些序列共有的配对或同源位点数量的函数。"无关的"或"非同源的" 序列与本申请的序列之一之间具有少于40%的同源性，但优选小于25%的同源性。
[0039] 多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一序列具有一定的百分比 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)的"序列同一性"是指， 在比对时，在这两个序列比较时该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。此种比对和百分 比同源性或序列同一性，可使用本领域中已知的软件程序测定，例如，通过Ausubel等人编 的（2007) Current Protocols in Molecular Biology描述的那些软件。优选地，使用默认 参数用于比对。BLAST是一种比对程序，使用默认参数。具体地，程序为BLASTN和BLASTP， 使用如下I犬认参数：Genetic code = standard ;fiIter = none ;strand = both ;cutoff = 60 ;expect = 10 ;Matrix = BL0SUM62 !Descriptions = 50sequences ;sort by = HIGH SCORE ；Databases = non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translation s+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息，可于以下互联网地址获得：http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. cgi，2008 年 5 月 21 日最后一次访问。生物学等效的 多核苷酸是具有上面提到的特定百分比的同源性，并编码具有相同或相似的生物活性多肽 的多核苷酸。
[0040] 术语"等效核酸或多核苷酸"是指与该核酸的核苷酸序列或其互补序列具有一定 程度的同源性，或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物是指包含特定核苷 酸序列的核酸，该特定核苷酸序列具有与另一核酸或其互补序列具有一定程度的同源性。 一方面，某核酸的同系物（homologs)能够与该核酸或其互补序列杂交。同样地，"等效的多 肽"是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定程度的同源性，或序列同一性的多肽。在一些方 面，该序列同一性至少为约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在某些方面， 该等效序列保留了参考序列的活性（例如，抗原表位结合）或结构（例如，盐桥）。
[0041] 杂交反应可以在不同的"严格"条件下进行。通常，低严格杂交反应于约40°C在约 10XSSC或同等离子强度/温度的溶液中进行。中等严格杂交通常在约50°C于约6X SSC 中进行，高度严格杂交反应通常在约60°C于约I X SSC中进行。杂交反应也可在本【技术领域】 的技术人员熟知的"生理条件"下进行。生理条件的一个非限制性例子是细胞中通常存在 的温度，离子强度，pH值和Mg 2+浓度。
[0042] 多核苷酸由4个核苷酸碱基组成的特定序列组成：腺嘌呤（A)，胞嘧啶（C)，鸟嘌呤 (G)，胸腺嘧啶（T)，在该多核苷酸为RNA时尿嘧啶（U)替换胸腺嘧啶。因此，术语"多核苷 酸序列"是多核苷酸分子按字母顺序排列的表示。该字母顺序表示可以被输入到计算机的 数据库中，该计算机中有中央处理单元，并且用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源 性检索。术语"多态性"是指共存有多于一种形式的基因或其一部分。基因的一部分具有 至少两种不同的形式，g卩，两种不同的核苷酸序列时，该基因的该部分被称为"基因的多态 区域"。多态区域可以是单核苷酸，其同一性在不同的等位基因中不同。
[0043] 术语"多核苷酸"和"寡核苷酸"可以互换使用，并涉及任何长度的核苷酸的聚合物 形式，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以有任何三维结构，并 且可以具有任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段 (例如，探针，引物，EST或SAGE标签），外显子，内含子，信使RNA (mRNA)，转移RNA，核糖体 RNA，核酶，cDNA，dsRNA，siRNA，miRNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，单独的任 意序列的DNA，单独的任意序列的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸， 如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则在多核苷酸的装配之前或之后对碱基结 构进行修饰。该核苷酸序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰， 如用标记成分结合。该术语也指双链和单链分子。除非另外指出或要求，否则本申请的多 核苷酸的任一实施例既包括双链形式也包括已知的两条互补单链形式或预计成为双链形 式的情况。
[0044] 术语"编码"在其应用于多核苷酸时指被认为"编码"某一多肽的多核苷酸，以其 天然的状态或由本领域技术人员熟知的方法操作时，它可以被转录和/或翻译以产生该多 肽的mRNA和/或其片段。反义链是此种核酸的互补物，该编码序列可以由其推导出。
[0045] 本文使用的术语"可检测的标签"指可直接或间接检测的化合物或组合物，该化合 物或组合物直接或间接地结合至待检测的组合物（例如，多核苷酸或蛋白质，该蛋白如抗体） 以获得"有标签的"组合物。该术语还包括，结合至该多核苷酸的序列，其通过插入序列的表 达提供信号，如绿色荧光蛋白（GFP)等。该标签自身可被检测（例如放射性同位素标签或荧 光标签）或者，在酶标签情况下，可催化底物化合物或组合物的化学改变，该改变可被检测。 该标签可用于小规模检测或更适于高通量筛选。同样地，合适的标签包括但不限于放射性同 位素、荧光染料、化学发光化合物、染料、和蛋白（包括酶）。该标签可仅被检测，也可被定量。 仅被检测的反应通常包括仅能证实其存在的反应，其中可被定量的反应通常包括具有可定量 的（例如可通过数字报告的）值例如强度、极化和/或其他性质的反应。在发光或荧光分析 中，可检测的反应可直接使用与分析成分相关的实际上涉及结合的发光体或荧光基团，或间 接使用与另一（例如报告分子或指示剂）成分连接的发光体或荧光基团。
[0046] 本文使用的，"抗体"或者"抗原结合多肽"指特定识别并结合抗原的多肽或多肽复 合体。抗体可为整个抗体也可为任何抗原结合片段或者其单链。因此术语"抗体"包括含 有特定分子的任何蛋白或肽，该特定分子含有至少一部分的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋 白分子具有结合至抗原的生物活性。此种情况的实例包括但不限于，重链或轻链或其配体 结合部分的互补决定区（CDR)，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架（FR)区或其任 何部分，或结合蛋白的至少一部分。
[0047] 本文使用的术语"抗体片段"或"抗原结合片段"为抗体的一部分，该抗体例如 F(ab'）2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管结构如何，与相同的抗原结合的抗体片段 被认为是完整抗体。术语"抗体片段"包括适配体、适配体对映体（spiegelmers)和双体 (diabodies)。术语"抗体片段"也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它们与抗体一样可 结合至特定的抗原以形成复合体。
[0048] "单链可变片段"或"scFv"指免疫球蛋白的重链（Vh)和轻链（VJ的可变区域的融 合蛋白。在某些方面，这些区域用10至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头可富含甘 氨酸以具有柔性，也含有丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且能将Vh的N-末端连接至 '的C 末端，反过来也一样。该蛋白质保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定区并引入 了接头。ScFv分子为本领域已知的，且描述于美国专利5, 892, 019中。
[0049] 术语抗体包括多种宽泛类别的多肽，这些多肽可被生化识别。本领域技术人员应 理解重链分为8&1111]^、1]111、3]^1^、(16]^、及6口8；[1011(，，，，）并具有一些亚类（例如，1-4)。该链的性质决定了抗体的"类"，如IgG，IgM，IgA，IgG，或者IgE。免疫球蛋白亚类（同 型）例如IgG^ IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等被很好表征并在功能上具有特异性。本领域技术人员 参考本申请可容易识别这些类和同型的每一种修饰形式，因此，这些形式在本申请范围内。 所有免疫球蛋白类明确地在本申请的范围内，下列讨论通常将针对免疫球蛋白分子的IgG 类。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两个相同的轻链多肽（它们的分子量约为23, 000 道尔顿）和两个相同的重链多肽（它们的分子量为53, 000-70, 000)。这四条链通常经二硫 键以"Y"型连接在一起，其中轻链在"Y"结构的口部开始支撑重链，并延伸穿过可变区。
[0050] 本申请的抗体、抗原结合多肽、它们的变体或衍生物包括但不限于，多克隆抗体、 单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化的抗体、灵长类化的（primatized)抗体、或嵌 合抗体、单链抗体、抗原表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab'） 2、Fd、Fvs、单链Fvs (scFv)、 单链抗体、二硫键连接的Fvs (sdFv)、包含VL结构域或VH结构域的片段、由Fab表达库产 生的片段、和抗独特型（idiotypic)(抗-Id)抗体（包括,例如，本文公开的抗Id抗体至 LIGHT抗体）。本申请的免疫球蛋白分子或抗体分子可为任何类型的（例如IgG、IgE、IgM、 IgD、IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的任何类（例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2) 或亚类。
[0051] 轻链分为kappa或lambda (，）。每类重链均可结合kappa或lambda轻链。通常， 轻链和重链共价地结合在一起，且当这些免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因改造的宿主细 胞产生时，两条重链的"尾部"部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在该重链中， 氨基酸序列从Y型结构的叉端的N末端向每条链的底部C末端延伸。
[0052] 轻链和重链两者都分成结构区和功能同源区。术语"恒定"和"可变的"为功能上 的使用。在此，应认识到轻链可变结构域（VL)和重链可变结构域（VH)同时决定了抗原识 别和特异性。相反地，轻链恒定结构域（CK)和重链恒定结构域（CH1，CH2或CH3)提供了重 要的生物学性质，例如分泌、经胎盘的流动性、Fc受体结合，补体结合等。通常恒定区结构 域的数量随着远离抗体的抗原结合位点或氨基端的末端位置而增加。N末端部分为可变区， 而在C末端部分为恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
[0053] 如上所述，该可变区域使得抗体能选择性识别并特异性结合抗原上的抗原表位。 艮P，抗体的VK结构域和VH结构域，或互补决定区（CDR)的亚类组合形成定义三维抗原结 合位点的可变区域。这种四价抗体结构形成了抗原结合位点，该抗原结合位点存在于Y构 型的每个臂的末端。更具体地，该抗原结合位点被每个VH和VK链（S卩，CDR-H1，CDR-H2， ⑶R-H3，⑶R-Ll，⑶R-L2和⑶R-L3)上的三个⑶R定义。在一些实例中，例如，某些衍生自骆 驼种或基于骆驼免疫球蛋白改造的免疫球蛋白，完整的免疫球蛋白分子可仅由重链组成， 而没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman 等，Nature363:446-448 (1993)。
[0054] 自然产生的抗体中，存在于每个抗原结合域中的六个"互补决定区"或"⑶R"是 短的，非连续的氨基酸序列，它们具有特定的定位以形成抗原结合结构域，对于抗体假定其 三维构型处于水环境中。该抗原结合结构域的其余氨基酸，称为"框架"区，具有更少的分 子内可变性。该框架区主要采用β-折叠片构型，且⑶R形成环，该环连接该β-折叠片 结构，有时形成该β-折叠片结构的一部分。因此，框架区用于形成支架，该支架使CDR通 过链内的、非共价作用在正确方向上定位。由该定位的CDR形成的抗原结合域定义了互补 于免疫活性抗原表位的表面。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。本领 域技术人员可对分别包括CDR和框架区的氨基酸针对任何给定的重链或轻链可变区容易 地识别，因为它们已经被明确定义（参见，"Sequences of Proteins of Immunological Interest,，Kabat，E·，等，美国卫生和公共服务部（U.S. Department of Health and Human Services, )，（1983) ;Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol.，196:901-917 (1987)，其在此通过引用 以全文形式结合至本文）。
[0055] 在本【技术领域】内使用和/或可接受的情况下，一个术语有两个或两个以上定义 时，本文使用的术语的定义用于包括所有的含义，除非明确说明与此相反。一个具体的例子 为，使用术语"互补决定区"（"CDR"）来描述在重链和轻链多肽的可变区中都存在的非连 续的抗原结合位点。这种具体区域由Kabat等描述于美国卫生和公共服务部，"Sequences of Proteins of Immunological Interest"（1983)和由 Chothia 等描述与 J. MoI. Biol. 196:901-917(1987)中，其通过全文引用结合至本文。根据Kabat和Chothia的定义， CDR包括相互比较时重叠的氨基酸残基，或氨基酸亚结构。然而，每种关于抗体或其变体的 CDR的定义的应用都将在本文定义和使用的术语的范围内。包含如以上引用的每一篇参考 文献定义的CDR的合适的氨基酸残基列于下表中作为比较。包含特定CDR的精确残基数将 随该CDR的序列和大小变化。如果给定该抗体的可变区氨基酸序列，则本领域技术人员通 常可确定哪些残基包含特定⑶R。
[0056] [表 1]
【权利要求】
1. 一种抗体，包含： (a) 针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻链-重链对；和 (b) 融合肽，所述融合肽包含单链可变片段（scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的 Fc片段，其中所述融合肽针对免疫细胞具有特异性。
2. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对肿瘤抗原具有特异 性。
3. 根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述肿瘤抗原选自：EGFR、Her2、EpCAM、 CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD 133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸盐结合蛋 白、⑶2、⑶3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5βl、ERBB2、ERBB3、MET、IGFlR、EPHA3、 TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP 和肌腱蛋白。
4. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对在肿瘤细胞上相对 于对应的非肿瘤细胞过表达的蛋白具有特异性。
5. 根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对病毒或者细菌具有 特异性。
6. 根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对内毒素具有特异 性。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其特征在于，所述免疫细胞选自T细胞、B 细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细 胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其特征在于，所述融合肽针对选自CD3、 ⑶16、⑶19、⑶28和⑶64的抗原具有特异性。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其特征在于，所述轻链通过二硫键与所述 重链结合。
10. 根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链通过一个或多个二 硫键与所述融合肽结合。
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链包含人或者人源 化的Fc片段。
12. 根据权利要求11所述的抗体，其特征在于，所述重链的Fc片段包含人IgG Fc片 段。
13. 根据权利要求1-12中任一项所述的抗体，其特征在于，所述融合肽的Fc片段包括 人或者人源化的Fc片段。
14. 根据权利要求13所述的抗体，其特征在于，所述融合肽的Fc片段包括人IgG Fc片 段。
15. 根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其特征在于，与野生型抗体片段相比，所 述重链和/或所述融合肽的Fc片段包含一处或多处氨基酸替换，所述替换在所述重链和Fc 片段之间形成离子键。
16. 根据权利要求15所述的抗体，其特征在于，所述替换选自表1。
17. 根据权利要求1-16中任一项所述的抗体，其特征在于，与野生型抗体片段相比，所 述重链和/或所述融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，所述替换在所述重链和Fc片段 之间形成杵-臼结构配对。
18. 根据权利要求17所述的抗体，其特征在于，所述替换选自表2。
19. 根据权利要求1-18中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体还包含可检测的 标签。
20. 根据权利要求1-19中任一项所述的抗体，其特征在于，所述CH2结构域位于所述 scFv片段和CH3结构域之间。
21. 根据权利要求1-20中任一项所述的抗体，其特征在于，所述融合肽不包含CH1结构 域。
22. -种组合物，包含根据权利要求1-21中任一项所述的抗体和载体。
23. 根据权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述载体为药物载体。
24. -种复合体，所述复合体包含根据权利要求1-21中任一项所述的抗体，所述抗体 与一个或多个抗原结合。
25. -种抗体的制备方法，所述方法包括：将（a)轻链-重链对和（b)融合肽混合，其 中所述轻链-重链对针对免疫细胞具特异性，所述融合肽包含单链可变片段（scFv)和具有 CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中所述融合肽针对肿瘤细胞具有特异性。
26. 根据权利要求25所述的方法制得的抗体。
【文档编号】A61K39/44GK104271602SQ201280065551
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2012年11月21日
【发明者】周鹏飞, 张敬, 严永祥 申请人:武汉友芝友生物制药有限公司