姜黄素在制备大电导钙激活钾通道开放剂中的用途
【专利摘要】本发明属中药领域，涉及中药姜黄主要活性成分姜黄素的新的药用用途，具体涉及姜黄素在制备钾通道开放剂中的用途，尤其是姜黄素作为大电导钙激活钾通道开放剂的新用途。本发明经细胞实验结果证明，所述的姜黄素具有开放大电导钙激活钾通道的作用，包括：对该通道电流的增大作用，对该通道蛋白的总表达和表面表达的增加作用，抑制该通道蛋白的降解途径，增强其稳定性的作用。所述的姜黄素进一步可制备新的大电导钙激活钾通道开放剂药物，用以制备治疗平滑肌功能紊乱相关疾病的药物，包括治疗膀胱过度活动症、胃蠕动过强等平滑肌功能紊乱相关疾病的药物。
【专利说明】姜黄素在制备大电导钙激活钾通道开放剂中的用途【技术领域】
[0001]本发明属中药领域，涉及中药姜黄主要活性成分姜黄素的新的药用用途，具体涉及姜黄素在制备钾通道开放剂中的用途，尤其是姜黄素作为大电导钙激活钾通道开放剂的新用途。
【背景技术】
[0002]研究报道，大电导钙激活的钾通道(BK通道)广泛分布于各种类型的细胞中，尤其在平滑肌细胞、神经元和内分泌细胞等兴奋性细胞中表达丰富。BK通道受膜电位和细胞内Ca2+浓度双重调节，是细胞兴奋性，肌肉收缩和递质释放等多种生理过程的强大调节器。有研究显示，BK通道的激活、失活和变异与多种疾病调节有关，例如:作为血管平滑肌细胞膜上的优势离子通道，BK通道的激活和表达增加能够平衡高血压时冠脉张力的上升，增强平滑肌细胞舒张功能适应性；在固有免疫中，阻断BK通道使微生物杀伤和消化过程受到抑制；在若干种肿瘤的发生过程中，BK通道抑制肿瘤细胞增殖，影响其迁移，表现出抗肿瘤的特性，在神经系统中，激活的BK通道对神经细胞有保护作用。因此，BK通道是治疗高血压，脑中风，恶性肿瘤等许多疾病的潜在靶点。
[0003]鉴于BK通道在人类生理、病理过程中的重要作用，寻找高活性、高选择性、类药性好的BK通道开放剂成为本领域研究的热点。但是，目前对BK通道开放剂的研究大多还停留在早期药物发现的阶段，仅有4个开放剂进入临床试验的开放剂，而其中3个(NS8，BMS204352和TA1702)都因故被中止，只有Andolast还在试验中。
[0004]姜黄素是一种从草本植物姜黄中提取的天然植物酚类化合物。据文献报道，姜黄素是一个多靶点治疗药物，对若干疾病，如炎症性疾病，阿尔兹海默症、心血管疾病、肿瘤等有治疗作用。现代药理研究表明，姜黄素主要通过抗炎、抗氧化、抑制多种酶类等药理活性发挥作用。
[0005]目前，尚未见关于姜黄素具有调节BK通道活性的作用的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供姜黄素新的药用用途，涉及姜黄素在制备钾通道(BK通道)开放剂中的用途，尤其涉及姜黄素在制备大电导钙激活钾通道开放剂中的用途。
[0007]本发明通过细胞实验，证实了姜黄素能够显著增加BK通道的电流，增加BK通道的蛋白表达，以及进一步产生的开放BK通道的用途。
[0008]本发明所述的姜黄素是一种从草本植物姜黄中提取的天然植物酚类化合物，可以按常规方法通过中 药姜黄进行人工提取，或通过市购的渠道获得。
[0009]本发明以携带BK通道基因的pCMV-myc质粒转染HEK293细胞，使BK通道在HEK293细胞中过表达；采用全细胞膜片钳的方法研究姜黄素对BK通道电生理活性的影响；用蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)和细胞表面生物素化方法检测BK通道总蛋白和细胞膜表面蛋白的表达水平，通过Cycloheximide-based protein chase实验研究姜黄素对BK通道蛋白降解过程的作用。经细胞生物学实验结果证明，姜黄素具有以下开放BK通道的作用:
[0010]1、增加瞬时转染BK通道基因的HEK293细胞中BK通道总蛋白的表达。
[0011]2、增大BK通道电流。
[0012]3、增加BK通道蛋白的表面表达。
[0013]4、抑制BK通道蛋白降解途径，从而稳定BK通道蛋白。
[0014]本发明经细胞实验结果证明，姜黄素具有开放大电导钙激活钾通道的作用，包括对该通道电流的增大作用；对该通道蛋白的总表达和表面表达的增加作用；抑制该通道蛋白的降解途径，增强其稳定性。
[0015]本发明所述的姜黄素进一步可制备新的大电导钙激活钾通道开放剂药物，用以治疗平滑肌功能紊乱相关疾病的药物，包括治疗膀胱过度活动症、胃蠕动过强等平滑肌功能紊乱相关疾病。
[0016]本发明为姜黄素抗肿瘤，神经保护等的多种药理作用的机制提供了理论依据；有助于确证BK作为药物靶标；也为进一步将姜黄素作为大电导钙激活钾通道开放剂制备治疗膀胱过度活动症，胃蠕动过强等平滑肌功能紊乱相关疾病的药物奠定了实验基础。
[0017]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的姜黄素作为大电导钙激活钾通道开放剂的新用途进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这 些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是Western Blot方法证实瞬时转染pCMV-myc_BK质粒后BK通道蛋白的过表达图。
[0019]图2是姜黄素对BK通道总蛋白的增加作用，
[0020]其中，与空白对照相比，P <0.05。
[0021]图3是姜黄素对BK通道电流的增大作用，
[0022]其中，A:瞬时给药姜黄素的作用；B:长时间给药姜黄素的作用。
[0023]图4是姜黄素增加BK通道蛋白的表面表达，
[0024]其中，与对照组相比P <0.05。
[0025]图5是姜黄素对BK通道蛋白降解途径的抑制作用，
[0026]其中，*:与对照组同时间点相比，P < 0.05。
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]I)质粒转染HEK293细胞
[0029]转染前一天，将HEK293细胞传代，并以3X 108!/1的密度接种于直径3.5cm的培养皿中，含10%胎牛血清的DMEM液培养24h。将I μ g质粒DNA加入到100 μ L无血清无抗生素培养基中混匀，2 μ L Lipofectamine2000加入到100 μ L无血清无抗生素培养基中混匀，室温下两种溶液静置5分钟，然后将两种溶液混合，室温静置20分钟。用无血清抗生素培养基冲洗细胞两次，加入500 μ L无血清无抗生素培养基，将前面制备好的混合液加入培养皿，用300 μ L无血清无抗生素培养基冲洗EP管后加入培养皿中，加入C02细胞培养箱中培养。6小时后换成正常培养基，48~72h后进行试验。荧光显微镜下观察对照组荧光细胞形态，估计转染效率。
[0030]实验结果显示，pCMV-myc-BK质粒瞬时转染HEK293细胞24小时后，BK通道蛋白有
效表达。
[0031]2)姜黄素增加BK通道总蛋白
[0032]实验方法:
[0033]HEK293细胞以3X 108!/1的密度接种于直径3.5cm的培养皿中，含10%胎牛血清的DMEM液培养24小时后进行转染实验。转染后24小时，实验组给予不同浓度的姜黄素(2.5 μ M、5 μ Μ、10 μ M、20 μ M)。药物作用24小时后，裂解细胞，收集蛋白，进行WesternBlot实验，检测BK通道蛋白的表达情况。
[0034]I) HEK293细胞蛋白提取:
[0035]①细胞药物处理完毕后，弃上清，0° C的PBS洗涤2次，细胞刮收集细胞，置EP管中，4° C条件下离心，3000rpm5min,弃上清；
[0036]②加入细胞裂解液，在冰水浴中裂解0.5h，每隔IOmin反复震荡一次，使细胞充分裂解；
[0037]③4。C 条件下离心，12000rpm5min ；
[0038]④吸取上清，1:4加入缓冲液，37° C，20min灭活蛋白质，_80°C保存。
[0039]⑤用BCA法测定蛋白浓度。
[0040]2) Western Blot 实验:
[0041 ] ①制备8%分离胶和5%层积胶；
[0042]②将样品加入电泳孔槽中，空余孔槽加入等体积的上样缓冲液，先采用60V恒压
0.5h，后改用120V至溴酚蓝至凝胶底部；
[0043]③电转液配制好后4°C预冷；裁PVDF膜，滤纸，PVDF膜在甲醇内浸泡lOmin，然后与滤纸，海绵，电转夹等一起置入4°C预冷的电转液中30min ；
[0044]④电泳结束后，参考蛋白质Markers切下目的蛋白所处凝胶区域，将其用转膜缓冲液漂洗；组装转印夹层:阴极-3张滤纸，凝胶，PVDF膜，3张滤纸-阳极；用玻棒去除残留于凝胶和PVDF膜之间的气泡,然后装好转膜装置,220mA恒流转膜2h ；
[0045]⑤将转印膜放入封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)室温封闭；
[0046]⑥用抗体稀释液按1:200稀释一抗，一抗4°C孵育过夜；用了831'漂洗4*5min ; 二抗(1:5000)室温孵育 lh，TBST 漂洗 4*5min;
[0047]⑦膜上加上Protein ECLkit试剂(等体积的A液和B液充分混合)；使用AlphaEaseFC System下成像，并对条带进行分析。
[0048]实验结果显示，分别以2.5 μ Μ、5 μ M、10 μ Μ、20 μ M的姜黄素作用于瞬时转染ΗΕΚ293细胞后，相对于对照组可以看到BK通道蛋白的表达量显著提高，2.5 μ M组P< 0.05 ;5μΜ、10μΜ、20μ]\α?Ρ < 0.01 ；η = 4 ;且 10 μ M 时 BK 通道蛋白表达量提高最多，表明姜黄素能够提高BK通道蛋白的表达并呈现剂量依赖性。
[0049]3)姜黄素增加BK通道蛋白的细胞表面表达
[0050] 实验方法:细胞表面生物素化实验[0051]HEK293细胞接种在IOcm培养皿中，当细胞密度达到90_95%时，可以进行表面生物
素化实验。
[0052]I)生物素标记(4°C下进行)
[0053]①预冷DPBS-Ca-Mg (7mL)快速冲洗两次；
[0054]②用含有lmg/mL 的 NHS-SS-biotin/DPBS 溶液孵育细胞 30min (gentlelyshaking) (7mL/ 孔)；
[0055]③用淬火液(含有IOOmM甘氨酸的DPBS-Ca-Mg溶液)漂洗细胞两次，每次IOmin-终止生物素化反应。
[0056]2)裂解细胞(4°C下进行)
[0057]①预冷DPBS-Ca-Mg漂洗冲洗细胞两次；
[0058]②刮下细胞，用200uL RIPA(with PMSF)裂解30min，提取蛋白；
[0059]③裂解液以6000Xg离心10min，收集上清。其中1/10 (20uL)上清作为全细胞蛋白上样对照，剩余进行免疫共沉淀。
[0060]3)免疫共沉淀 [0061]①孵育(4°C):上一步剩余的上清与200uL streptavidin-agarose磁珠孵育。streptavidin-agarose磁珠提取两次:第一次4°C过夜,第二次4°C 2h ；
[0062]②洗脱(37°C):RIPA冲洗 beads5 次，用 50uL 含有 200mM DTT 的 2XLaemmli 上样缓冲液37°C孵育一小时，洗脱过程可以重复两次。洗脱液不要混合，作为第一次洗脱和第二次洗脱；
[0063]③14000 Xg离心2min，收集洗脱液。
[0064]4) Western Blot 检测蛋白量
[0065]实验结果显示，与对照组相比，姜黄素能使BK通道蛋白的细胞表面表达增加。
[0066]4)姜黄素增加BK通道电流
[0067]实验方法:全细胞膜片钳实验
[0068]电极液配制:
[0069]电极内液(mmol / L):KC1140, HEPES 10, MgCl2I, Na2ATP5, Na2GTP0.5，EGTA I 和Cacl20.001, pH7.35。
[0070]电极外液(mmoL/ L):Nacll45, KC14, MgCl2I, CaCl2I, HEPES 10 和葡萄糖 10，pH7.4。所有实验均在室温(22 °C )下进行。
[0071]操作方法:
[0072]玻璃微管电极在电极拉制机上两步拉制而成，充灌电极内液后，尖端阻抗为2~3ΜΩ。将拉制好的电极尖端先在不含anaphotericin-B的电极内液中浸]Λ3秒,然后从电极尾部反向充灌含amphotericin-B的电极内液,用手指轻弹电极中部排除尖端气泡。在10分钟内尽快进行细胞封接。在室温下，将贴附有细胞的盖玻片放入盛有Iml浴液的实验小槽中，在倒置相差显微镜下找到折光性好、膜光滑的细胞，用微推进器控制电极接近细胞，使检测方波的高度下降约一半时放掉正压，给予电极尖端约l(T20cmH20的负压，使微管电极尖端与细胞间形成电-化学绝缘，阻抗达到10-1006Ω，即形成细胞贴附式膜片(cell-attached patch),约3~20分钟,可以看到膜电容出现并逐渐增大,而Rs则逐渐变小，提示穿孔膜片正在逐渐形成，20-30分钟后，膜电容瞬变值和Rs都趋于稳定。给予细胞-1OOmV至+IOOmV,步阶电压为+20mV的电压刺激，电流经Axon膜片钳放大器后，记录到pClamp9.0和Clamp9.0软件系统中，以获取电流-电压变化曲线。
[0073]BK通道电流和1-U曲线记录:
[0074]电流记录程序为维持电位一 60mV，刺激电位从一 IOOmV至IOOmV,阶跃10mV，刺激时问100ms，刺激问隔时间10 S。先记录未加入BK通道特异性阻滞剂IBTX)(前BK通道电流，然后再记录加入IBTX后BK通道电流。采用Clampfit软件，将加入IBTX前后记录的BK通道电流相减，可得IBTX敏感的钾离子流，即为BK通道电流，以电流和刺激电位作图，可得1-U曲线。
[0075]BK通道电流时间-过程图:
[0076]电流记录程序为维持电位一 60mV，刺激电位IOOmV,刺激时间100ms，刺激间隔时间10s，可记录到总钾离子流的变化。
[0077]实验结果显示，与对照组相比，在不同电压刺激下，实验组BK通道的电流明显高于对照组。表明姜黄素对BK通道具有开放作用。
[0078]5)姜黄素对BK通道蛋白降解途径的抑制作用
[0079]实验方法:Cycloheximide_basedprotein chase 实验
[0080]肥(293细胞转染后2处，预给药姜黄素(10^) 12小时后，加入蛋白合成抑制剂Cycloheximide (CHX)0分别于CHX作用细胞0、3、6、12、24h后，收集细胞，提取蛋白进行Western Blot 实验。
[0081]实验结果显示，与对照组相同作用时间节点相比，实验组BK通道蛋白量明显增多。用AlphaEaseFC软件对3次实验结果进行光密度测定，用Excel绘制平均BK蛋白量-时间趋势图，实验组曲线下降趋势比对照组缓慢。表明姜黄素可降低了 BK通道蛋白的降解速率，增加BK通道蛋白的稳定性。
【权利要求】
1.姜黄素在制备大电导钙激活钾通道开放剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的姜黄素增加大电导钙激活钾通道的总蛋白和表面蛋白表达。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的姜黄素增加大电导钙激活钾通道的电流。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的姜黄素抑制大电导钙激活钾通道蛋白降解，增加该蛋白的稳定性。
5.大电导钙激活钾通道开放剂在制备治疗平滑肌功能紊乱相关疾病的药物中的用途，所述的大电导钙激活钾通道开放剂中以姜黄素为活性成分。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的平滑肌功能紊乱相关疾病选自膀胱过度活动症 或胃蠕动过强症。
【文档编号】A61P1/00GK103933020SQ201310023700
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月22日 优先权日:2013年1月22日
【发明者】张雪梅, 彭文, 陈启菁, 王云满, 付文成, 王利, 王浩 申请人:复旦大学