专利名称：Bk通道阻断剂基因、其重组载体及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种新型BK通道阻断剂martentoxin基因、其重组载体及其克隆方法。
背景技术：
大电导钙激活钾通道(简称BK通道)是广泛分布于兴奋性和非兴奋性细胞中的一种受电压和钙离子双重门控的钾离子通道，具有调节神经细胞兴奋性、平滑肌的舒张；控制神经递质的释放、激素的分泌；参与非特异性免疫等功能。功能性的BK通道至少由四个 α亚基构成，每个α亚基均有10个疏水性α-螺旋结构；辅助性β亚基通常呈组织特异性表达，每个β亚基均由胞外环连接两个跨膜α-螺旋疏水性片段(Lippiat，Manden et al.2003)。α与β亚基共表达，可显著改变BK通道的动力学和药理学特点。值得指出的是，特异性分布于神经系统中的BK通道亚型(由α和β4亚基共表达构成)被认为具有重要的生理与药理功能效应。这种通道亚型基因欠缺可导致一系列临床疾病。神经系统的BK通道具有较慢的生理动力学特征，且该BK通道亚型对包括经典的 iberiotoxin和charybdotoxin等经典的BK通道阻断剂均呈现出相当的非敏感性。因此， 为了精确探明该BK通道亚型的生理与药理功能特性，以利设计研发相关临床BK通道疾病的针对性药物，开发BK通道的特异性阻断剂、解析其分子机制、鉴定BK通道上新的药物专一性、药物作用方式、药物作用新靶点、BK通道-阻断剂相互作用新模式，不仅可深度拓展有关BK通道立体结构与功能的知识，为相关BK通道病的诊断与治疗提供细胞与分子学依据，还可对相应的特异性药物设计提供有益的参考思路Kraft，Krause et al，2003。野生型的martentoxin是由东亚钳蝎粗毒中纯化出来的一个37肽阻断剂，分子量为4060 Da，其全长cDNA开放阅读框长为177 bp，编码59个氨基酸残基的前体(内含 22个氨基酸残基的信号肽和37个氨基酸残基的成熟肽)，已被鉴定可特异性地作用于大鼠嗜铬细胞的钙激活K+通道(Ji，Wang et al, 2003) 以charybdotoxin为对照，100 nM martentoxin可以阻遏70%的BK电流，相当于charybdotoxin的77%活性。但在NG-108 细胞和大鼠背根神经节细胞上，martentoxin对于Kv的作用微乎其微。Biosensor结合实验表明，martentoxin与大鼠脑突触体膜的结合能力比远远高于charybdotoxin，但对于BK 亚型，两者药理效应对应互补，400 nM martentoxin可高选择性阻断BK通道(α+β 4)电流，这提示martentoxin有可能和一种charybdotoxin非敏感的K+通道高度亲和。所以 martentoxin可以作为研究K+通道分型、电信号和化学信号的一个重要阻断剂Sii，He et al. 2008。对其进行基因工程表达，便于对其结构和功能进行研究，同时可以进行突变操作，研究特定钾通道的结构和功能。利用原核表达系统，探索简单易行的体外表达程序，使 martentoxin得以在体外表达，从而为解决天然阻断剂的稀有性，以及下一步的阻断剂结构与功能的研究提供必要的前提条件
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种BK通道阻断剂基因。本发明的目的之二在于提供该基因的重组载体。本发明的目的之三在于提供该BK通道阻断剂基因的克隆方法本发明的目的之三在于提供BK通道阻断剂基因重组载体的克隆方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种BK通道阻断剂基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列。一种上述的BK通道阻断剂基因的重组载体基因，其特征在于该重组载体基因为 SEQ ID NO:2所示的碱基序列。一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求2所述的重组载体。一种克隆上述的BK通道阻断剂基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为使用5，- ATTGAAGCTTACGCGTCGACTATA (dT)_3，引物逆转录野生东亚钳蝎总RNA，获得BK通道阻断剂基因。一种克隆上述的重组载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为
a.将BK通道阻断剂基因作为克隆模板，根据PGEX-4T-3的多克隆位点序列，选择 BamH I和Sma I两个限制性酶的识别位点做连接位点，设计正向引物和反向引物，再经过 PCR反应，将PCR产物及载体pGEX-4T-3进行BamH I和Sma I双酶切，酶切后通过T4DNA连接酶连接构建BK通道阻断剂基因的重组载体序列；
所述的正向引物为5，- TTCGGATCCTTTGGACTCATAGA-3，； 所述的反向引物为5，- CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT-3，；
b.将步骤a所得重组载体序列经过kpharose4B-GSH亲和层析柱纯化，GSH洗脱液洗脱得到一条30KD的蛋白条带，即为BK通道阻断剂基因的重组载体
发明的是一种神经型BK通道的特异性阻断剂，不仅可作为该通道的特异性探针运用于科学研究，且可为开发治疗BK通道相关神经系统疾病的先导药物设计提供借鉴。 Martentoxin体外表达的新方法为日后的产业化提供了可行的技术保障。
图1为重组BK通道阻断剂基因诱导表达的SDS-PAGE检测图；其中左侧为低分子量蛋白Marker ’第1泳道为未诱导表达的全细胞蛋白；第2、3泳道为经IPTG诱导表达3小时的全细胞蛋白 ’第4、5泳道为经IPTG诱导表达4小时的全细胞蛋白。图2为重组BK通道阻断剂基因的表达与纯化SDS-PAGE检测图；其中右侧为低分子量蛋白Marker ’第1泳道为未诱导表达的全细胞蛋白；第2泳道为经IPTG诱导表达4小时的全细胞蛋白；第3泳道为细胞经超声波破碎后上清液；第4泳道为经GSH亲和层析纯化的融合蛋白；第5泳道为酶切前的融合蛋白；第6泳道为经酶切后的融合蛋白；
图3为重组BK通道阻断剂基因与GST分离的凝胶过滤图谱； 图4为GST-martentoxin融合蛋白小肠激酶酶切图谱；其中缓冲液A:0. 1%盐酸/去离子水，缓冲液B :60% acetonitrile/去离子水。洗脱梯度为缓冲液B起始浓度为15%， 2-7分钟15-25%, 7-25分钟25-40%, 25-30分钟40%的恒浓度； 图5为重组rMartentoxin质谱鉴定；
图6为野生型和重组州3汁6壯(《丨11对抓通道(0+0 4)的抑制效应；其中4.为在IuM浓度下，野生型和重组rMartentoxin对BK通道电流的抑制作用。(钳制细胞于-70 mV，给予 +100 mV的去极化刺激诱发BK外向电流，刺激长度为100 ms);B为对BK通道电流抑制的统计图，rMarTx 的 If (电流残留比例)=0. 3415士0. 05778 ；MarTx 的 If =0. 1871 士0. 03020。
具体实施例方式实施例一pGEX-4T-3_martentoxin载体的构建
利用5’ - ATTGAAGCTTACGCGTCGACTATA (dT)_3’引物对野生型东亚钳蝎总RNA进行逆转录，获得BK通道阻断剂基因，参见SEQ ID NO 1所示的碱基序列。根据pGEX_4T_3的多克隆位点和BK通道阻断剂基因序列，选择BamH I和Sma I两个限制性酶的识别位点做连接位点，设计正向引物和反向引物；
所述的正向引物为5，- TTCGGATCCTTTGGACTCATAGA-3，； 所述的反向引物为5，- CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT-3，；
进行PCR反应，PCR产物以及pGEX-4T-3载体均进行BamH I和Sma I双酶切，酶切后通过T4DNA连接酶将BK通道阻断剂基因连接到pGEX-4T-3载体上，构建 pGEX-4T-3-martentoxin载体序列，选择表达BK通道阻断剂基因载体的单菌落接种至5mL LB/Amp培养基37°C培养过夜，送测序。pGEX-4T-3_martentoxin 质粒测序结果如下 AAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCTTTGGACTCATAGACGTAAAATGTTTTGCATCTAGTGAATGTTGG
ACAGCTTGCAAAAAAGTAACAGGATCGGGACAAGGAAAGTGCCAGAATAATCAATGTCGATGCTACTGATTAACCCG GGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGAC
可知martentoxin的基因已经正确地插入到pGEX_4T_3载体的多克隆位点中(划线部分)。实施例二 重组martentoxin的表达及纯化
在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以体积比1 50接种表达BK通道阻断剂的工程菌， 37°C培养至0D600约0. 8-1. 0时加入IPTGCIPTG终浓度为1. 0 mM)，对培养物诱导4小时， 诱导温度为37°C。与未经诱导的工程相比，诱导后的工程菌总蛋白中明显多出一条约30 KD 的较明显的蛋白条带，参见图1。经过kpharose 4B-GSH亲和层析柱纯化，GSH洗脱液洗脱得到一条约30KD的蛋白条带。由于在表达质粒载体中，BK通道阻断剂martentoxin的cDNA前融合了一个谷胱甘肽转移酶基因，谷胱甘肽转移酶约^KD,加上4 KD的martentoxin约为30KD。从蛋白分子量大小及GSH介质的亲和性判断，所得30KD蛋白条带即融合蛋白GST- martentoxin.对洗脱下的融合蛋白进行酶切，通过SDS-PAGE蛋白质电泳可见GST-martentoxin融合蛋白被酶切成^KD的GST和约4KD的rMartentoxin，参见图2。经过kphadex G-50凝胶过滤，可以将GST和martentoxin分离，参见图3，得到粗纯化的重组martentoxin，得率约为1 mg/ L培养物。实施例三重组martentoxin的HPLC分离纯化以及质谱鉴定
经酶切后的产物进样与HPLC系统C18反向层析柱进行检测。结果显示，在2分钟左右出现的吸收峰为GST的吸收峰；在15分钟出现了一个较高的吸收峰，参见图4，推测其很可能为目的产物(重组martentoxin的小分子多肽)的吸收峰。对在15分钟收集的吸收峰进行质谱分析。结果显示，其分子量为4059. 0 Da,与天然martentoxin的分子量4060相近， 参见图5。实施例四重组martentoxin的功能鉴定
将BK通道质粒转染HEK293细胞后M-72小时内，进行电生理实验。HEK293T细胞于 +60 mV刺激下所得到的通道电流和(Lippiat et al. 2003)所报道的特征一致，参见图6。序列表
<110>上海大学
<120> BK通道阻断剂基因、其重组载体及其克隆方法
<160> 2
<210> 1
<211> 118
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
TTTGG ACTCA TAGAC GTAAA ATGTT TTGCA TCTAG TGAAT GTTGG ACAGC TTGCA AAAAA 60 GTMC AGGAT OGGGA CMGG AAAGT GCCAG AATAA TCMT GTCGA TGCTA CTGAT TM 118 <210> 2 <211> 184 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2
AAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCTTT GGACT CATAGACGTAAAATG TTTTGCATCT60AGTGAATGTTGGACAGCTTGCAAAAAAGTA ACAGG ATCGGGACAAGGAAA GTGCCAGAAT120AATCAATGTCGATGCTACTGATTAACCCGG GTCGA CTCGAGCGGCCGCAT CGTGACTGAC180
TGAC
权利要求
1.一种BK通道阻断剂基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的BK通道阻断剂基因的重组载体基因，其特征在于该重组载体基因为SEQ ID NO 2所示的碱基序列。
3.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求2所述的重组载体。
4.一种克隆根据权利要求1所述的BK通道阻断剂基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为使用5’ - ATTGAAGCTTACGCGTCGACTATA (dT)_3’引物逆转录野生东亚钳蝎总 RNA,获得BK通道阻断剂基因。
5.一种克隆根据权利要求2所述的重组载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.将BK通道阻断剂基因作为克隆模板，根据pGEX-4T-3的多克隆位点序列，选择 BamH I和Sma I两个限制性酶的识别位点做连接位点，设计正向引物和反向引物，再经过 PCR反应，将PCR产物及载体pGEX-4T-3进行BamH I和Sma I双酶切，酶切后通过T4DNA连接酶连接构建BK通道阻断剂基因的重组载体序列；所述的正向引物为5，- TTCGGATCCTTTGGACTCATAGA-3，； 所述的反向引物为5，- CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT-3，；b.将步骤a所得重组载体序列经过kpharose4B-GSH亲和层析柱纯化，GSH洗脱液洗脱得到一条30KD的蛋白条带，即为BK通道阻断剂基因的重组载体。
全文摘要
本发明涉及一种新型BK通道阻断剂martentoxin基因、其重组载体及其重组表达方法。该基因具有SEQIDNO1所示的碱基序列。实验数据表明BK通道阻断剂martentoxin基因是一种神经型BK通道的特异性阻断剂，不仅可作为该通道的特异性探针运用于科学研究，且可为开发治疗BK通道相关神经系统疾病的先导药物设计提供借鉴。Martentoxin体外表达的新方法为日后的产业化提供了可行的技术保障。
文档编号C12N15/10GK102242125SQ201110107768
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者严丽, 吉永华, 周智磊, 沈昊, 董邦乾 申请人:上海大学