专利名称：人前列腺凋亡反应蛋白4与凋亡素2配体融合蛋白的制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和生物技术药物领域。更具体地，本发明涉及人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)或其选择性凋亡癌细胞区(SAC)，与凋亡素2配体(Apo2L)融合的蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在如肿瘤等疾病治疗中的应用。
背景技术：
Par4是1994年由Sells等人用差示杂交法，从凋亡的前列腺癌细胞中首次分离到的凋亡诱导基因，因此命名为前列腺凋亡反应蛋白4(Prostate apoptosis response 4protein, Par4) [Cell Growth Differ, 1994 ；5 (4) :457-466. ]。Par4 基因位于人类染色体 12q21. 2上，有7个外显子和6个内含子组成，编码序列有1023个核苷酸(SEQ ID NO. 1)，编码的Par4蛋白质由340aa组成(SEQ ID NO. 2)。现国际上将Par4统一命名为PAWR(PRKC，apoptosis, WTl, regulator)，在各大生物数据库中的 ID 为HGNC :8614 ；Entrez Gene 5074 ；Ensembl ENSG00000177425 ；UniProtKB :Q96IZ0。在蛋白质缺失突变分析中发现，人Par4的145-203aa组成的59个氨基酸，为其发挥细胞凋亡作用的核心活性区域，即构成了人Par4诱导凋亡的最小功能域。这个核心区域是Par4进入细胞核、FasL/Fas定位于细胞膜、活化Fas促凋亡通路、抑制NF-K B活性等诱导凋亡的必要及充分的条件。该区域不仅能够定位于肿瘤细胞的细胞核，也能定位于正常及永生细胞的细胞核，但却只选择性地诱导肿瘤细胞的凋亡。这说明Par4诱导细胞凋亡是由这个核心区域实现的。由于这个核心区域在正常细胞中并不诱导凋亡，但却能够诱导各种肿瘤细胞凋亡，因此称为选择性凋亡癌细胞区(selective for apoptosis induction cancer cells domain, SAC)。Par4 与 SAC也可在细胞外，发挥选择性诱导癌细胞凋亡的作用[Cell，2009 ;138(2) =377-388.]1995年，国外报道从人表达标签序列文库(expressed sequence tag, EST)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白质的基因，该基因编码的蛋白质称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又称凋亡素2配体(apoptotin-2 ligand, Apo2L),其通过启动细胞固有的凋亡程序,可有效地诱导肿瘤和转化细胞凋亡，而对正常细胞无影响。现国际上将Apo2L统一命名为肿瘤坏死因子(配体)超家方矣成员 10 [tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10],在各大生物数据库中的 ID 为HGNC :11925 ；Entrez Gene :8743 ；Ensembl ENSG00000121858 ；UniProtKB :P50591。人Apo2L基因的编码序列有846个核苷酸(SEQ ID NO. 3)，编码的Apo2L蛋白质由281个氨基酸组成(SEQ ID NO. 4)。业已证明Apo2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第95或114位开始的胞外区可形成游离的可溶性凋亡素2配体蛋白，同样具有特异启动肿瘤凋亡作用。由于Par4与Apo2L对诱导肿瘤凋亡作用在不同的环节，用合适的氨基酸连接臂[Protein Eng, 2003 ；15(11) :871-879]使两者融合表达，由此所产生的重组融合蛋白质既可以通过Par4选择性诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤，还可以通过Apo2L特异启动肿瘤细胞固有的凋亡程序而抗肿瘤。因此，本发明所得到的融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等疾病的治疗提供新的药物或制剂。因此，本领域迫切需要开发新的具有Par4和Apo2L两者生物活性的药物。此外，本领域还迫切需要开发成本低廉和/或步骤简便的生产工艺。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的具有Par4和Apo2L生物活性的药物，它是Par4或其活性片段SAC和Apo2L的融合蛋白。本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞。本发明的另一目的是提供一种成本低廉和\或步骤简便的生产所述Par4或SAC 和Apo2L融合蛋白的方法。在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，它包括(a)人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)元件,该元件具有人Par4或其活性片段SAC的氨基酸序列；(b)人凋亡素2配体(Apo2L)元件，该元件具有人Apo2L或其活性片段的氨基酸序列；以及(C)位于人Par4元件和Apo2L元件之间的0_20个氨基酸的连接序列。
更佳的，所述的Par4元件具有SEQ ID NO. 2中第1-340位或145-203位的氨基酸序列；所述的Apo2L元件具有SEQ ID NO. 4中第95-281位或114-281位的氨基酸序列；而且，所述的连接序列为含4-14个氨基酸的接头肽；更佳的，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO. 6或9中所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明上述的融合蛋白。较佳地，所述的DNA分子编码包括SEQ ID NO. 6或9中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO. 5或7、8中所示的核苷酸序列。在本发明第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体和含有上述载体的宿主细胞。在本发明第四方面，提供了一种产生本发明融合蛋白的方法，它包括步骤在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的融合蛋白；和分离纯化所述的融合蛋白。在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明的融合蛋白。在本发明的第六方面，提供了本发明融合蛋白的用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物。
图I显示了不同长度的Par4、氨基酸连接臂和Apo2L的不同拼接方式。其中表示Apo2L氨基酸序列；■ , , ■表示Par4氨基酸序列；......表示氨基酸连接臂序列；
表示缺失部分氨基酸。图2显示了一种特征性的Par4_Apo2L融合蛋白重组表达及纯化过程的电泳分析(SDS-PAGE)。其中A :诱导表达3小时后Par4_Apo2L的细菌破碎上清；B :未诱导表达Par4Apo2L的细菌破碎上清；C :诱导表达2小时后Par4_Apo2L的全菌；D :诱导表达I小时后Par4-Apo2L的全菌；E :金属亲和纯化的重组Par4_Apo2L融合蛋白质洗出液；F :硫酸铵盐析表达上清的活性组分；G :金属亲和纯化的重组Par4-Apo2L融合蛋白质活性峰；H S200进一步纯化的Par4-Apo2L ；1 :蛋白质分子量标记(kD)图3显示了一种特征性的SAC_Apo2L融合蛋白重组表达及纯化过程的电泳分析 (SDS-PAGE)。其中A :蛋白质分子量标记(kD) ；B :进一步纯化的SAC_Apo2L ；C :金属亲和纯化重组SAC-Apo2L融合蛋白质活性峰；D :金属亲和纯化时的洗出液；E :热诱导表达的SAC-Apo2L工程菌破碎上清；F :未诱导表达SAC_Apo2L前的细菌破碎上清
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，将Par4编码序列或其活性片段SAC编码序列和Apo2L编码序列融合在一起,产生由合适的氨基酸连接臂连接的Par4-Apo2L或SAC_Apo2L的融合蛋白。所述融合蛋白质具有两者的生物学功能，既可通过Par4或SAC选择性的诱导肿瘤细胞凋亡，又可通过Apo2L特异启动肿瘤细胞凋亡程序杀伤肿瘤。因此，本发明所得到的Par4-Apo2L或SAC_Apo2L融合蛋白质可以在两者的协同下增强抗肿瘤的效果，还可减少两者分别给药给患者所带来的麻烦和痛苦，为抗肿瘤等治疗提供新的化合物。在此基础上完成了本发明。定义如本文所用，术语“前列腺凋亡反应蛋白4和凋亡素2配体融合蛋白”与“Par4-Apo2L融合蛋白”可互换使用，都指由人前列腺凋亡反应蛋白4元件的氨基酸序列和人凋亡素2配体的氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外，所述融合蛋白可以具有或没有起始的甲硫氨酸或信号肽。如本文所用，术语融合蛋白中“前列腺凋亡反应蛋白4元件”与“Par4元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的全长人前列腺凋亡反应蛋白4或其活性片段SAC具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与人天然前列腺凋亡反应蛋白4基本上相同的生物活性。优选的Par4元件是人前列腺凋亡反应蛋白4，更佳的是全长的人前列腺凋亡反应蛋白4和其选择性凋亡癌细胞区，如SEQ ID NO. 2中第1-340位和145-203位的氨基酸序列。如本文所用，术语融合蛋白中“凋亡素2配体元件”或“Apo2L元件”可互换使用，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，该序列与天然的或变异的凋亡素2配体或其可溶性活性片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然凋亡素2配体基本上相同的生物活性。优选的Apo2L元件是人凋亡素2配体，更佳的是人凋亡素2配体可溶性活性片段，如SEQ ID NO. 4中第95-281位或114-281位的氨基酸序列。前列腺凋亡反应蛋白4和凋亡素2配体的序列可以源自人，也可以源自非人的动物，就如人来源的与小鼠、大鼠来源的SAC的氨基酸序列是完全一致的一样。然而，优选的是人的天然序列。 如本文所用，术语“连接肽”或“氨基酸连接臂”可互换使用，指位于前列腺凋亡反应蛋白4元件的氨基酸序列和凋亡素2配体元件的氨基酸序列以及SAC元件的氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽 或氨基酸。连接肽的长度通常为0-20个氨基酸，较佳地为3-10个氨基酸，最佳地为4-6个氨基酸。技术人员可按照本领域常规方法[如参见PNAS 1998 ；95 :5929-5934 ；Protein Eng,2000 ；13(5) :309-312 ；Protein Eng,2003 ；15(11) :871-879等文献]设计连接肽。通常，连接肽不影响或不严重影响前列腺凋亡反应蛋白4元件的氨基酸序列和凋亡素2配体元件的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。优选的连接肽例子包括(但并不限于)①为了有利于蛋白折叠成相互独立的结构域，用GGGGSGGGGS等序列作为连接臂是合适的，如SEQ ID NO. 6中第341-350位和SEQID NO. 9中第61-70位为了有利于蛋白酶把Par4_Apo2L切割成两个独立的蛋白分子，可用活性X因子的酶切位点IEGR、肿瘤特异高表达的金属蛋白酶的酶切位点PLGLWA作连接臂，相似的，chymotrypsin I, papain, plasmin, thrombin, trypsin 等酶的酶切位点也可设计作为氨基酸连接臂；③为了有利于纯化，可把6His作为纯化标签或作为连接臂，以用金属亲和层析纯化融合蛋白，相似的，麦芽糖结合蛋白(MBP)，谷胱甘肽-S转移酶(GST)等也可设计作为纯化的标签或作为连接臂；④上述三种方案的结合也可设计成新的氨基酸连接臂，如NVVVHQAHHHHHHEFTYK连接臂就是融合了蛋白酶切位点(NIa蛋白酶)和金属亲和层析位点6His。编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR扩增或合成的方法获得，甚至从市场购买(如Par-4编码序列可以来至Origene的Cat. No. SCl 10969 ；Apo2L编码序列可以来至Origene的Cat. No. RC207596)，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适表达载体，再转入合适宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新融合蛋白。如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)能在真核细胞如CH0、C0S系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽作为前体表达并参与多肽的分泌，那么编码信号肽(分泌前导序列)的DNA就是可操作地连于多肽DNA ;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型Par-Apo2L或SAC_Apo2L蛋白，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服或局部给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于人，其中该安全有效量通常至少约I微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳的该剂量是约10微克/千克体重到约I毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5_Fu、氨甲蝶呤等影响核酸生物合成的药物，氮芥、环磷酰胺等烷化剂类，阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物，长春新碱、喜树碱类影响蛋白质合成的药物，紫杉醇等微管抑制的药物，及某些激素等各类药物。综上所述，本发明的主要优点如下(l)Par4-Apo2L、SAC-Apo2L融合蛋白，既具有Par4或SAC的选择性诱导肿瘤细胞凋亡的功能，又具有Apo2L特异性启动肿瘤细胞凋亡的功能，是一种治疗肿瘤的新型药物。(2)给药方便。由于两者的有效作用剂量在大多数情况下接近，所以用融合蛋白同时给予，方便了单药的配比，同时受试者也减少了痛苦。(3)具有靶向性。Par4或SAC在选择性诱导肿瘤细胞凋亡的同时可以把Apo2L运抵肿瘤局部发挥作用；同样的，Apo2L特异作用于肿瘤细胞时，把Par4或SAC运抵肿瘤组织发挥其选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用。(4)增强蛋白的稳定性。两者融合表达后，体外半衰期明显变长，在水溶液中的稳定性由两者各约一周变为融合后的一至两个月(皆在4°C下)；相信在体内的半衰期也会适当的延长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I建立cDNA文库，筛选得到Par4和Apo2L基因I.制备人外周血单个核细胞总RNA
按常规用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞，用RPMI-1640培养基(GIBC0公司)，加10%新生小牛血清(杭州四季青生物公司)及青霉素和链霉素培养至贴壁，得单个核细胞，然后用10μ g/L的大肠杆菌R595的内毒素刺激2h，以激活单个核细胞，收集IO7细胞，用总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA，得人外周血单个核细胞总RNA。2.建立cDNA文库，筛选Apo2L基因上述所得的总RNA,用01igo-dT柱(Qiagen公司)纯化得总mRNA,用cDNA合成试剂盒(Clontch公司)按说明书进行cDNA第一链和第二链的合成，加上EcoR I接头后连接到AgtlO载体中，并用λ噬菌体包装试剂盒(Clontech公司)包装成λ噬菌体文库，建成XgtlO cDNA文库，文库的滴度为6Χ106。此λ gtlO cDNA文库以IX IO5菌落/LB平板上铺板，在20 X 20cm的硝酸纤维素滤膜上制作重复的印模。用Apo2L理论序列设计随机引物，制备基因探针，杂交筛选文库。含有菌落的重复印膜在含10%硫酸葡聚糖、100 μ g/ml tRNA和6X105cpm/ml探针的平板筛选缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 7. 5, lmol/L NaCl，O. I %焦磷酸钠，O. 2%聚乙烯吡咯烧酮和 O. 2% Ficoll)中 65°C杂交过夜。65°C平板筛选，2X SSC(O. 3mol/L NaCl, 30mmol/L柠檬酸钠，pH7. O)、0. 1% SDS缓冲液洗两次。然后在_40°C与胶片紧密接触，筛选40小时。双份阳性的样品从主平板上挑出对应菌落，转到添加了明胶的缓冲液(lOOmmol/LNaCl, 10mmol/L MgSO4, 50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)的 LB 平板上，得到 12 个阳性噬菌斑。12个纯化的λ DNA用Not I消化，I %琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹确认与探针杂交。挑选与上述探针杂交时，放射性强度最大的克隆(约1.7kp)进行DNA纯化。这些克隆的插入部分被亚克隆到PSP0RT1 (GIBC0公司)的Not I位点。测定质粒中插入部分的DNA序列。从序列分析的结果中得到，其中一个质粒中的插入序列为1769bp，根据Kozak定义的翻译起始位点要求，第88-90位核苷酸(ATG，编码蛋氨酸)为翻译起始位点，所以其包含87bp的5’非翻译区，846bp开放阅读框和3’非翻译区(含多聚腺苷酸化信号或称polyA尾)，其中的编码序列如SEQ ID NO. 3。由此得到所编码的281个氨基酸序列如SEQ IDN0. 4。3.筛选Par4基因用步骤I和2类似的方法，从人前列腺细胞cDNA文库中筛选得到Par4的编码序列如SEQ ID NO. I，推断的所编码的340个氨基酸序列如SEQ ID NO. 2。实施例2逆转录-聚合酶链反应法(即RT-PCR)得到Par4的编码序列I. RT 获得 Par4 的 cDNA 第一链以从Clontech公司(美国)购买的人前列腺细胞总RNA为模板，以Pl为引物，逆转录酶催化合成Par4 cDNA第一链。引物
Pl :5’ -CCA CAT TGA GTC TTG AAT CC-3，(SEQ ID NO. 11)2.聚合酶链反应(PCR)扩增获得Par4编码序列以上述cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，Tag DNA聚合酶催化合成和扩增Par4编码序列。经序列分析，所得DNA序列与各大数据库中所显示的Par4编码序列一致，即得到了 Par4编码核苷酸序列。引物P2 :5，-TAC AAG CTC CTC CAA GC-3，(SEQ ID NO. 12)实施例3RT-PCR得到Apo2L的编码序列 I.制备人外周血单个核细胞总RNA(I)按常规方法从人外周血中分离淋巴细胞，进而用贴壁法获得单个核细胞；(2)用细菌内毒素激活单个核细胞以刺激细胞表达更多的基因和提高RNA的丰度，用RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA。2.逆转录(RT)获得Apo2L的cDNA第一链以上述总RNA为模板，以P3为引物，逆转录酶催化合成Apo2L cDNA第一链。弓丨物P3 :5，-TCC AGG TCA GTT AGC CAA C_3’ (SEQ ID NO. 13)3.聚合酶链反应(PCR)扩增获得Apo2L编码序列以上述cDNA第一链为模板，P3、P4为引物，Tag DNA聚合酶催化合成和扩增Apo2L编码序列。经序列分析，所得DNA序列与各大数据库所显示的Apo2L编码序列一致，即得到了 Apo2L编码核苷酸序列。引物P4 :5，-CTG ACT TAC AGC AGT CAG-3’ (SEQ ID NO. 14)实施例4 人工合成与PCR相结合获得SAC编码序列I.设计和合成SAC编码相关序列根据大肠杆菌密码子偏爱性和密码子兼并性，设计编码SAC的各密码子，分4段委托生物技术公司(上海生工)化学合成。这4段序列的特点是P5为SAC模板链的一部分，P6为编码链的一部分，且P5和P6的3’端序列互补，即P5、P6中下划直线的序列；P7的5’加上限制性内切酶EcoR I酶切位点，即P7中加框的6核苷酸序列，优化了 SD序列与外源基因之间的距离为7个核苷酸(斜体部分)，引入蛋白合成起始密码子ATG，3’端序列与P5的5’序列相同，即P7中下划波浪线的序列，中间为SAC部分编码序列；P8的5’加上另一个限制性内切酶BamH I酶切位点，即P8中加框的6核苷酸序列，3’端序列与P6的5’序列相同，即P8中下划波浪线的序列，中间为SAC部分编码序列。P5 :5， -GGC CAG ATT GAA AAA CGT AAA CTG CGT GAG AAA CGT CGCAGC ACC GGCGTG GTC AAC ATC CCG GCC GCA GAA TGC TTA GAT GAA~3 (SEQ ID NO. 15)P6 :5’ -AAT AGT GTT CTG TTG GGT AAT TGC ATC TTC ACG TTT ACGTTC TTT CTGGCC TGC TTC ATC ATC TTC GTA TTC ATC TAA GCA TTC-3 (SEQ ID NO. 16)P7 :5，-Ac|GAv4 TTC\ACA ATG CGT AAA GGC AAA GGC CAG ATT GAAMA C_3，(SEQID NO. 17)
P8 :5，-AC |GGA TCCj TTA AGC CTC ATT CTG AAT AGT GTT CTG TTG G_3’ (SEQID NO. 18)2.聚合酶链反应(PCR)扩增SAC编码序列P5、P6互相作为引物，PCR扩增SAC部分编码序列。然后以扩增产物为模板，P7、P8为引物，再次PCR扩增，产物与T vector (TaKaRa公司)连接，DNA序列分析，与设计的一致，即SEQ ID NO. 19。由此得到了由大肠杆菌偏爱密码子组成的，并5’和3’带有不同限制性内切酶位点的SAC编码序列，可用于实施例5中构建pBV-SAC及构建SAC_Apo2L融合蛋白表达质粒时的PCR模板。实施例5构建表达融合蛋白的表达载体及工程菌通过改建载体pBV220，构建高效表达SAC的重组质粒，所构建的表达SAC的原核表 达载体，命名为pBV-SAC。本发明相应的融合蛋白的重组表达以同样的方法实施。具体实施步骤如下I.设计并合成寡聚核苷酸双链合成寡聚核苷酸双链，序列如下(未给出互补链的序列)P9 :5， -AAA GAT CTC TCA CCT ACC AAA CAA TGC CCC CCT GCA AAA AATAAA TTCATA TAA MA ACA TAC AGA TAA CCA TCT GCG GTG ATA AATTAT CTC TGG CGG TGT TGA CATAAA TAC CAC TGG CGG TGA TAC TGA GCACAT CAG CAG GAC GCA CTG ACC ACC ATG AAG GTGACG CTC TTA AAAATT AAG CCC TGA AGA AGG GCA GCA TTC AAA GCA GAA GGC TTT GGGGTGTGT GAT AOG AAA CGA AGC ATT GGT TAA AAA TTA AGG AGG AATTCA CA-3’(SEQ ID NO. 20)其中，斜体部分为λ PJr串联启动子序列，阴影部分为Cl抑制蛋白结合位点，黑体部分为优化的SD序列，5’端引入BglII酶切位点AGATCT，3’端引入EcoR I酶切位点GAATTC ；PlO :5，-AAG GAT CCG TCG ACC TGC AGC CAA GCT TGG CTG TTT TGGCGG ATG AGAGAA GAT TTT CAG~3 (SEQ ID NO. 21)其中，5’端引入了 BamH I酶切位点GGATCC，随后是Sal I、Pst I和HindIII酶切位点，3 ’弓丨入Xmn I酶切位点GAANNNNTTC。2.构建表达载体pBV-SAC以实施例4中PCR扩增得到的SAC编码序列，以EcoR I和BamH I酶切(工具酶皆购自美国NEB公司)。以Bgl II和EcoR I酶切P9，BamH I和Xmn I酶切P10。以BglII和Xmn I双酶切pBV220质粒。上述各酶切片段琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4 DNA连接酶连接各片段，所得到的重组质粒即选择性凋亡癌细胞区的表达载体，命名为pBV-SAC。pBV-SAC相比pBV220具有以下特征SAC编码序列受上游λ噬菌体PlPk串联启动子控制，优化的核糖体结合序列(SD序列)，插入EcoR I酶切位点及翻译起始密码子ATG，同时优化了与SD序列之间的距离为7个核苷酸等。该质粒与PBV220同样，在启动子序列中含有clts857结合序列；带有氨苄青霉素抗性基因；转录终止序列rrnB ;质粒上含有编码温度敏感蛋白因子clts857基因，在42°C时该编码产物失活，从而失去对启动子的抑制，启动子控制的下游外源基因被表达。上游调控序列、优化的SD序列、SAC编码序列及翻译终止序列等特征核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。SAC编码序列可以以实施例I和2中所获得的天然Par4编码序列为模板，以表I种所列举的引物SEQ ID NO. 23、25，PCR即可获得天然SAC编码序列，然后用上述同样的方法，也可构建pBV-SAC。所得的重组质粒虽然编码SAC序列不同，但编码的产物序列是相同的，即 SEQ ID NO. 2 中的 145-203 位。3.各片段引入酶切位点构建融合蛋白表达载体用上述同样的方法，以表I所列序列为引物(所列引物只部分列举了扩增图I中所列8种融合蛋白质),以上述实施例或市售(如Par-4编码序列可以来至Origene的Cat.No. SCl 10969 ；Apo2L编码序列可以来至Origen e的Cat. No. RC207596)所得的相应编码序列为模板，分别PCR扩增相应编码DNA片段，相应限制性内切酶酶切各PCR产物及SEQ IDNO. 38、39形成的连接臂编码序列(柔性氨基酸连接臂)，T4 DNA连接酶连接入已用限制性内切酶EcoR I与Pst I酶切的上述改建的PBV220载体，转化感受态细胞，筛选含重组质粒的克隆，DNA序列测定证实，即可得到表达各融合蛋白质的表达工程菌。同样的，也可以以SEQ ID NO. 40、41形成的编码肿瘤高表达的金属蛋白酶酶切位点编码序列作为氨基酸连接臂，构建各融合蛋白的表达工程菌。4.重叠PCR构建融合蛋白表达载体相似的，可以分别以SEQ ID NO. 42、43和44、45，作为重叠PCR引物，同时以实施例4得到的SAC和实施例1、2或市售的Apo2L编码序列为模板，加入其他相应引物，I次PCR扩增，即可得到由柔性氨基酸或肿瘤高表达的金属蛋白酶酶切位点为氨基酸连接臂的SAC-Apo2L融合蛋白的编码序列，再以EcoR I与Pst I酶切，T4 DNA连接酶连接入同样酶切的载体上，转化感受态细胞，筛选含重组质粒的克隆，DNA序列测定证实，即可得到表达融合蛋白质的表达工程菌。相似的，其他融合蛋白表达工程菌也可同样构建。同样的，融合蛋白之间以其他氨基酸连接臂连接的，也同样构建。显而易见，与上述引入限制性内切酶酶切位点相比，通过重叠PCR构建的融合蛋白之间，少了 2个限制性内切酶酶切位点编码的4个氨基酸。但氨基酸连接臂序列是相同的。表I引物核苷酸序列表第一组扩增所编码融合蛋白质中的Par4在融合蛋白N端，如图I所示的A_D(p表示引物，P表示以实施例1、2或市售的Par4为模板,A表示以实施例1、2或市售的Apo2L为模板，S表示以实施例4合成的SAC为模板，中间数字表示所编码的氨基酸的起始或终止位置，f表示正向引物，r表示反向引物)
权利要求
1.一种融合蛋白质，其特征在于它由下列元件组成 (a)人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)元件,该元件具有人Par4或其活性片段-选择性凋亡癌细胞区(SAC)的氨基酸序列，即具有SEQ ID NO. 2中第1-340位、或145-203位的氨基酸序列； (b)人凋亡素2配体(Apo2L)元件，该元件具有人凋亡素2配体或其活性片段的氨基酸序列，即具有SEQ ID NO. 4中第95-281、或114-281位的氨基酸序列；以及 (c)位于人Par4元件和Apo2L元件之间的0_20个氨基酸的连接序列。
2.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接序列含4-14个氨基酸。
3.如权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有SEQIDN0.6、9中所示的氨基酸序列。
4.一种人工合成的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求I所述的融合蛋白质。
5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有SEQID NO. 5、7、8、10中所示的核苷酸序列。
6.—种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的DNA分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.—种产生权利要求I所述的融合蛋白的方法，其特征在于步骤如下(I)建立cDNA文库，筛选得到Par4和Apo2L基因；(2) RT-PCR得到Par4的编码序列和Apo2L的编码序列，或化学合成具有大肠杆菌密码子偏爱性的SAC的编码序列；(3)构建融合蛋白表达载体；(4)转化大肠杆菌，建立工程菌；(5)制备融合蛋白质；(6)融合蛋白质的生物学活性确定。
9.一种药物组合物，其特征在于，由药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求I所述的融合蛋白组成。
10.权利要求I所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明提供了人前列腺凋亡反应蛋白4(Par4)或其选择性凋亡癌细胞区(SAC)，与凋亡素2配体(Apo2L)融合的蛋白，即Par4-Apo2L、SAC-Apo2L融合蛋白，以及编码这些蛋白的DNA序列，含编码这些DNA序列的载体，含这些载体的宿主细胞，用基因工程制备这些蛋白的方法，以及含这些蛋白的药物组合物。本发明的Par4或SAC、Apo2L具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，所以融合蛋白可以用于制备治疗如肿瘤等疾病的药物。
文档编号C12R1/19GK102757503SQ201110107409
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者吴腾云, 张威, 王梁华 申请人:中国人民解放军第二军医大学