专利名称：一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种三维类骨组织的制备方法。
背景技术：
外太空环境具有微重力、超低温、高真空和强辐射等特征，其中，微重力对人体生理功能有明显影响。国内外航天医学研究者进行了大量微重力对人体机能影响的医学观察和研究，发现在空间飞行环境中，航天员的骨质每月减少1%，而且返回地球后不能完全恢复。因此，研究失重引起骨丢失的分子机制对于航天员的防护具有重要的意义。目前，多数研究采用二维成骨细胞为模型研究骨丢失的机制，这种模型存在以下缺陷首先，骨组织中具有成骨细胞和破骨细胞，二者相互影响、紧密配合形成一个动态平衡，决定了骨组织的重构，因此单纯的成骨细胞模型不能真实的反应空间骨丢失的过程；其次，人体中细胞的生长环境是三维的立体环境，细胞能够在三维方向上进行生长发育，而二维培养限制了细胞的生长范围，也不能真实反应在体组织的细胞间生物学特性。
发明内容
本发明是要解决目前研究模拟微重力效应的二维成骨细胞模型不能真实的反应空间骨丢失的过程，不能真实反应在体组织的细胞间生物学特性的问题，提供一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法。本发明一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，按以下步骤进行一、将明胶放入37°C孵箱内溶解，然后将0. lmol/L的PBS缓冲液或质量浓度为 0. 85% 0. 9%的生理盐水与海藻酸钠、溶解的明胶和羟基磷灰石混合，得到混合溶液，混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为1 % 5 %，明胶的质量浓度为0. 5 % 5 %，羟基磷灰石的质量浓度为0.01% 0. 1% ；二、成骨细胞的诱导；三、破骨细胞的诱导；四、将诱导后的成骨细胞和破骨细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为1 X IO6 5 X IO6个/mL 的混合细胞悬液，采用针头将混合细胞悬液逐滴加入到25 lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5 lOmin，得到包裹混合细胞的微球；五、将包裹混合细胞的微球放入质量浓度为0. 3%的海藻酸钠溶液中静置5 20min后，然后放入质量浓度为0. 5 2%的多聚赖氨酸溶液中静置5 20min，最后放于α -MEM培养基进行三维培养1 2周，即形成三维类骨组织。由于正常的骨组织中既有成骨细胞又有破骨细胞，成骨细胞分泌无机矿物(羟基磷灰石)，破骨细胞吞噬无机矿物质(羟基磷灰石)，二者的协调作用维持无机矿物的平衡， 一旦平衡打破，即产生骨质疏松或骨质增生。常用的二维单一类型细胞模型不能够模拟真实骨组织的情况。本发明利用海藻酸钠形成的三维支架，将成骨细胞与破骨细胞共同包埋在海藻酸钠微球之中，这样，在培养的过程中，细胞间既能通过分泌细胞因子或是生长因子而发生相互作用，亦可以有细胞间的直接接触；同时，三维培养也更好的模拟了生理状态下细胞的生长状况、模拟了骨组织中成骨-破骨细胞的相互作用，很好的解决了已有二维成骨细胞模型的不足。本发明用以探究微重力条件下的成骨-破骨细胞的相互作用和骨丢失的分子机制，能够为有效解决微重力对骨骼的不利影响提供理论依据。
图1为具体实施方式
十六步骤四制得的包裹混合细胞的微球照片；图2为具体实施方式
十六不加入细胞而形成的海藻酸钠微球内部结构的扫描电镜照片；图3为具体实施方式
十六步骤四制得的包裹混合细胞的微球中成骨细胞和破骨细胞共培养2周的扫描电镜照片。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，按以下步骤进行一、将明胶放入37°c孵箱内溶解，然后将0. lmol/L的PBS缓冲液或质量浓度为0. 85% 0. 9%的生理盐水与海藻酸钠、溶解的明胶和羟基磷灰石混合，得到混合溶液，混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为 5%，明胶的质量浓度为0. 5% 5%， 羟基磷灰石的质量浓度为0.01% 0. 1% ；二、成骨细胞的诱导；三、破骨细胞的诱导；四、 将诱导后的成骨细胞和破骨细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为1 X IO6 5 X IO6个/mL的混合细胞悬液，采用针头将混合细胞悬液逐滴加入到25 lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5 lOmin，得到包裹混合细胞的微球；五、将包裹混合细胞的微球放入质量浓度为0. 3%的海藻酸钠溶液中静置5 20min后，然后放入质量浓度为 0. 5 2%的多聚赖氨酸溶液中静置5 20min，最后放于α -MEM培养基进行三维培养1 2周，即形成三维类骨组织。本实施方式利用海藻酸钠形成的三维支架，将成骨细胞与破骨细胞共同包埋在海藻酸钠微球之中，这样，在培养的过程中，细胞间既能通过分泌细胞因子或是生长因子而发生相互作用，亦可以有细胞间的直接接触；同时，三维培养也更好的模拟了生理状态下细胞的生长状况，很好的解决了已有二维成骨细胞模型的不足。本实施方式用以探究微重力条件下的成骨-破骨细胞的相互作用和骨丢失的分子机制，能够为有效解决微重力对骨骼的不利影响提供理论依据。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中成骨细胞的诱导方法，按以下步骤进行向α-MEM培养基中添加50mmol/L的抗坏血酸、lmol/L的β甘油磷酸和lmmol/L的地塞米松，使α -MEM培养基中抗坏血酸的终浓度为0. 05mmol/L、β甘油磷酸的终浓度为lOmmol/L、地塞米松的终浓度为lX10_7mol/L，即得MC3T3-E1细胞的诱导培养基，利用诱导培养基培养MC3T3-E1细胞5 10天，即完成成骨细胞的诱导。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中破骨细胞的诱导方法，按以下步骤进行将小鼠单核/巨噬细胞系RAW^H. 7接种于6孔培养板上，用 α -MEM全培养液于37°C、体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养，Id后更换为破骨细胞培养液，之后每隔3d换1次破骨细胞培养液，培养1 2周，即完成破骨细胞的诱导；所述的 α -MEM全培养液中含体积分数为15%的胎牛血清(FBS)、100U/mL的青霉素、100mg/L的链霉素和0. 01mol/L的HEPES缓冲液，所述的破骨细胞培养液为含有30ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和50ng/mL破骨细胞分化因子(RANKL)的α-MEM培养基。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中海藻酸钠的质量浓度为2% 4%。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中海藻酸钠的质量浓度为3%。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中明胶的质量浓度为 4%。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中明胶的质量浓度为2 % 3 %。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤一中羟基磷灰石的质量浓度为0. 03% 0. 07%。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤一中羟基磷灰石的质量浓度为0. 05%。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤四中制成细胞密度为3 X IO6个/mL的混合细胞悬液。其它与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一至十之一不同的是步骤四中将混合细胞悬液逐滴加入到40 80mmol/L的二价阳性离子溶液中。其它与具体实施方式
一至十之一相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一至十之一不同的是步骤四中将混合细胞悬液逐滴加入到60mmol/L的二价阳性离子溶液中。其它与具体实施方式
一至十之一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤五中放入质量浓度为0. 5% 2. 5%的海藻酸钠溶液中。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤五中放入质量浓度为 2%的海藻酸钠溶液中。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
一至十四之一不同的是步骤五中放入质量浓度为 1.5%的多聚赖氨酸溶液中。其它与具体实施方式
一至十四之一相同。
具体实施方式
十六本实施方式用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，按以下步骤进行一、将明胶放入37°C孵箱内溶解，然后将0. lmol/L的PBS缓冲液与海藻酸钠、溶解的明胶和羟基磷灰石混合，得到混合溶液，混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为1. 5%，明胶的质量浓度为5%，羟基磷灰石的质量浓度为0. 05% ；二、成骨细胞的诱导；三、破骨细胞的诱导；四、将诱导后的成骨细胞和破骨细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为2 X IO6个/mL的混合细胞悬液，采用针头将混合细胞悬液逐滴加入到lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5min，得到包裹混合细胞的微球；五、将包裹混合细胞的微球放入质量浓度为的海藻酸钠溶液中静置IOmin后，然后放入质量浓度为 1. 5%的多聚赖氨酸溶液中静置lOmin，最后放于α -MEM培养基进行三维培养2周，即形成三维类骨组织。本实施方式步骤四制得的包裹混合细胞的微球如图1所示，本实施方式不加入细胞而形成的海藻酸钠微球内部结构的扫描电镜照片如图2所示，本实施方式步骤四制得的包裹混合细胞的微球中成骨细胞和破骨细胞共培养2周的扫描电镜照片如图3所示，可以看出成骨细胞和破骨细胞共培养形成细胞团。本实施方式利用海藻酸钠形成的三维支架，将成骨细胞与破骨细胞共同包埋在海藻酸钠微球之中，这样，在培养的过程中，细胞间既能通过分泌细胞因子或是生长因子而发生相互作用，亦可以有细胞间的直接接触；同时，三维培养也更好的模拟了生理状态下细胞的生长状况，很好的解决了已有二维成骨细胞模型的不足。
权利要求
1.一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，其特征在于用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，按以下步骤进行一、将明胶放入37°C孵箱内溶解，然后将0. lmol/L的PBS缓冲液或质量浓度为0. 85% 0. 9 %的生理盐水与海藻酸钠、溶解的明胶和羟基磷灰石混合，得到混合溶液，混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为 1 % 5 %，明胶的质量浓度为0.5^-5%,羟基磷灰石的质量浓度为0.01% 0.1%; 二、 成骨细胞的诱导；三、破骨细胞的诱导；四、将诱导后的成骨细胞和破骨细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为1 X IO6 5 X IO6个/mL的混合细胞悬液，采用针头将混合细胞悬液逐滴加入到25 lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5 lOmin，得到包裹混合细胞的微球；五、将包裹混合细胞的微球放入质量浓度为0. 3%的海藻酸钠溶液中静置5 20min后，然后放入质量浓度为0. 5 2%的多聚赖氨酸溶液中静置5 20min， 最后放于α -MEM培养基进行三维培养1 2周，即形成三维类骨组织。
2.根据权利要求1所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，其特征在于步骤二中成骨细胞的诱导方法，按以下步骤进行向α-MEM培养基中添加 50mmol/L的抗坏血酸、lmol/L的β甘油磷酸和lmmol/L的地塞米松，使α -MEM培养基中抗坏血酸的终浓度为0. 05mmol/L、β甘油磷酸的终浓度为IOmmol/L、地塞米松的终浓度为 1 X KTmol/L，即得MC3T3-E1细胞的诱导培养基，利用诱导培养基培养MC3T3-E1细胞5 10天，即完成成骨细胞的诱导。
3.根据权利要求1所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，其特征在于步骤三中破骨细胞的诱导方法，按以下步骤进行将小鼠单核/巨噬细胞系 RAW264. 7接种于6孔培养板上，用α -MEM全培养液于37°C、体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养，Id后更换为破骨细胞培养液，之后每隔3d换1次破骨细胞培养液，培养1 2周，即完成破骨细胞的诱导；所述的α-MEM全培养液中含体积分数为15%的胎牛血清、 100U/mL的青霉素、100mg/L的链霉素和0. 01mol/L的HEPES缓冲液，所述的破骨细胞培养液为含有30ng/mL巨噬细胞集落刺激因子和50ng/mL破骨细胞分化因子的α -MEM培养基。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，其特征在于步骤一中海藻酸钠的质量浓度为2% 4%。
5.根据权利要求4所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法， 其特征在于步骤一中明胶的质量浓度为 4%。
6.根据权利要求5所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法， 其特征在于步骤一中羟基磷灰石的质量浓度为0. 03% 0. 07%。
7.根据权利要求6所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法， 其特征在于步骤四中制成细胞密度为3 X IO6个/mL的混合细胞悬液。
8.根据权利要求7所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法， 其特征在于步骤四中将混合细胞悬液逐滴加入到40 80mmol/L的二价阳性离子溶液中。
9.根据权利要求8所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法， 其特征在于步骤五中放入质量浓度为0. 5% 2. 5%的海藻酸钠溶液中。
10.根据权利要求9所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，其特征在于步骤五中放入质量浓度为 1. 5%的多聚赖氨酸溶液中。
全文摘要
一种用于研究模拟微重力效应的三维类骨组织的制备方法，涉及一种三维类骨组织的制备方法。本发明是要解决目前研究模拟微重力效应的二维成骨细胞模型不能真实的反应空间骨丢失的过程，不能真实反应在体组织的细胞间生物学特性的问题。方法一、将PBS缓冲液或生理盐水、海藻酸钠、明胶和羟基磷灰石混合；二、成骨细胞的诱导；三、破骨细胞的诱导；四、制备包裹混合细胞的微球；五、形成三维类骨组织。本发明利用海藻酸钠形成的三维支架，将成骨细胞与破骨细胞共同包埋在海藻酸钠微球之中，三维培养也更好的模拟了生理状态下细胞的生长状况，很好的解决了已有二维成骨细胞模型的不足。应用于空间生物学、航天医学和组织工程研究领域。
文档编号C12N5/07GK102206608SQ20111010735
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者李钰, 田维明, 郑红霞 申请人:哈尔滨工业大学