专利名称：一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种三维类心肌组织的制备方法。
背景技术：
外太空环境具有微重力、超低温、高真空和强辐射等特征，其中，微重力对人体生理功能有明显影响。国内外航天医学研究者进行了大量微重力对人体机能影响的医学观察和研究，发现长时间太空飞行可引起生理机能出现一定程度的病理学改变，主要包括心血管系统、肌肉系统、免疫系统和骨骼系统的病理性改变。由于心血管系统维持着人体的正常生命活动，因此研究微重力对人体心血管系统的影响，探讨其机理及制定有效防护措施，对于保证航天员在太空飞行时的健康和有效工作具有重要意义。目前研究微重力效应的心肌细胞模型主要是通过在回转器中培养细胞，从而达到定性模拟微重力环境。心肌细胞的三维培养方法是目前用于研究模拟微重力效应最广泛的细胞培养方法，使心肌细胞生长在cytodex微载体的表面。这种方法存在许多不足(1) cytodex微载体材料具有毒性，会对细胞产生不利影响；( 培养时需要的细胞量大，收取细胞困难；(3)在回转器中培养时，易受气泡等因素产生的剪切力的干扰；(4)心肌细胞的持续收缩时间短。
发明内容
本发明是要解决目前用于研究模拟微重力效应的细胞三维培养方法中cytodex 微载体材料具有毒性而对心肌细胞产生不利影响，培养时需要的细胞量大，收取细胞困难， 细胞在回转器中培养时易受剪切力的干扰，心肌细胞的持续收缩时间短的问题，提供一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织微球的制备方法。本发明的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，按以下步骤进行一、将质量浓度为0. 05% 3%的海藻酸钠溶液与质量浓度为10% 50%的I型胶原蛋白溶液混合，得到混合溶液；二、将出生后1 3d的Wistar大鼠乳鼠心脏置于0 40C的0. lmol/L的PBS溶液中，然后用0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗心脏3 5次， 再将心脏组织剪成1 3mm3大小的组织块，再用0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗3 5次，然后将组织块用消化液消化10 30min，再加入组织块10倍体积的DMEM培养基，离心后弃上清，然后向沉淀中加入DMEM培养基制成细胞悬液A，将细胞悬液A接种到培养瓶中，差速贴壁90 120min，得到纯化的心肌细胞；三、将纯化的心肌细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为0. 5X IO6 5X IO6个/mL的心肌细胞悬液，采用针头将心肌细胞悬液逐滴加入到25 lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5 20min，得到包裹心肌细胞的微球；四、将包裹心肌细胞的微球加入质量浓度为0. 3%的海藻酸钠溶液中静置5 20min后，再放入质量浓度为0. 5 2 %的多聚赖氨酸溶液中静置5 20min，然后将经过静置的包裹心肌细胞的微球放于DMEM培养基进行三维培养1 2周，即形成具有持续搏动功能的三维类心肌组织；其中步骤一中I型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的0. 50% ；步骤二中消化液由胰酶和胶原酶II组成，消化液中胰酶的质量浓度为0. 02 0. 2%，胶原酶II的质量浓度为0. 01 0. 1%;步骤二中消化液的体积为组织块体积的9 12倍；步骤二和步骤四中的DMEM培养基中都含质量浓度为10% 15%的胎牛血清；步骤二中的细胞悬液A的细胞密度为0. 5X IO6 5X IO6个/mL ；步骤三中的二价阳离子溶液中二价阳离子为钙离子、钡离子或锶离子；步骤四中海藻酸钠溶液的体积为微球体积的9 12倍，多聚赖氨酸溶液的体积为微球体积的9 12倍。本发明采用组织工程技术在体外构建具有心肌结构和功能的类心肌组织，该类心肌组织具有与真实的心脏组织十分相近的特点而且便于精确调控，利用这样的类心肌组织来代替心肌细胞用于研究模拟失重条件下的心肌结构和功能改变的分子生物学机制，搭建一个适用于空间生命科学研究和空间环境风险评价的三维心肌细胞培养平台。本发明的方法具有以下优点1、心肌细胞在微球内较少受到剪切力干扰；2、心肌细胞在微球内形成球状细胞团，在生物学性能上与在体组织更为接近；3、微球具有一定的孔隙率，心肌细胞在微球内既能接受营养物质又能将代谢废物排出；4、心肌细胞在微球内可长期培养，无需传代，更适于空间搭载；5、使用本发明方法制备的三维类心肌组织可以长时间维持心肌细胞收缩功能，持续时间为6个月；而目前的二维培养方法心肌细胞持续收缩时间是130天，目前的三维培养方法心肌细胞持续收缩时间是2个月。
图1为具体实施方式
二十四中步骤三得到的包裹心肌细胞的微球的照片；图2为具体实施方式
二十四中步骤三得到的包裹心肌细胞的微球在显微镜下放大40倍的照片； 图3为具体实施方式
二十四中经DAPI染色后的微球在显微镜下放大40倍的照片；图4为具体实施方式
二十四中培养2个月的包裹三维类心肌组织的微球的照片；图5为具体实施方式
二十四中培养2个月的包裹三维类心肌组织的微球在显微镜下放大400倍的照片；图 6为具体实施方式
二十四中培养2个月的三维类心肌组织放大500倍的扫描电镜照片；图7 为具体实施方式
二十四中培养2个月的三维类心肌组织放大4000倍的扫描电镜照片；图8 为具体实施方式
二十四中三维类心肌组织在不同的培养时间同步搏动频率的检测图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，按以下步骤进行一、将质量浓度为0. 05% 3%的海藻酸钠溶液与质量浓度为 10% 50%的I型胶原蛋白溶液混合，得到混合溶液；二、将出生后1 3d的Wistar大鼠乳鼠心脏置于0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液中，然后用0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗心脏3 5次，再将心脏组织剪成1 3mm3大小的组织块，再用0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗3 5次，然后将组织块用消化液消化10 30min，再加入组织块10倍体积的DMEM培养基，离心后弃上清，然后向沉淀中加入DMEM培养基制成细胞悬液A，将细胞悬液A接种到培养瓶中，差速贴壁90 120min，得到纯化的心肌细胞；三、将纯化的心肌细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为0. 5X IO6 5X IO6个/mL的心肌细胞悬液，采用针头将心肌细胞悬液逐滴加入到25 lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置 5 20min，得到包裹心肌细胞的微球；四、将包裹心肌细胞的微球加入质量浓度为0. 3%的海藻酸钠溶液中静置5 20min后，再放入质量浓度为0. 5 2%的多聚赖氨酸溶液中静置5 20min，然后将经过静置的包裹心肌细胞的微球放于DMEM培养基进行三维培养 1 2周，即形成具有持续搏动功能的三维类心肌组织；其中步骤一中I型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的0. 50% ；步骤二中消化液由胰酶和胶原酶II组成，消化液中胰酶的质量浓度为0. 02 0.2%，胶原酶II的质量浓度为0.01 0. 1% ；步骤二中消化液的体积为组织块体积的9 12倍；步骤二和步骤四中的DMEM培养基中都含质量浓度为10% 15%的胎牛血清；步骤二中的细胞悬液A的细胞密度为0. 5X106 5X106个 /mL ；步骤三中的二价阳离子溶液中二价阳离子为钙离子、钡离子或锶离子；步骤四中海藻酸钠溶液的体积为微球体积的9 12倍，多聚赖氨酸溶液的体积为微球体积的9 12倍。本实施方式步骤一中的I型胶原蛋白为大鼠I型胶原蛋白，为购买得到。本实施方式的方法具有以下优点心肌细胞在微球内较少受到剪切力干扰；心肌细胞在微球内形成球状细胞团，在生物学性能上与在体组织更为接近；微球具有一定的孔隙率，心肌细胞在微球内既能接受营养物质又能将代谢废物排出；心肌细胞在微球内可长期培养，无需传代，更适于空间搭载；使用本发明方法制备的三维类心肌组织可以长时间维持心肌细胞收缩功能，持续时间为6个月；而目前的二维培养方法心肌细胞持续收缩时间是130天，目前的三维培养方法心肌细胞持续收缩时间是2个月。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5% 2%。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中海藻酸钠溶液的质量浓度为1%。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中I 型胶原蛋白溶液的质量浓度为20% 40%。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中I 型胶原蛋白溶液的质量浓度为30%。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中I 型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的5% 40%。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中I 型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的10% 30%。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中I 型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的20%。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤二的消化液中胰酶的质量浓度为0. 05 0. 15%。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤二的消化液中胰酶的质量浓度为0. 1%。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一至十之一不同的是步骤二的消化液中胶原酶II的质量浓度为0. 05%。其它与具体实施方式
一至十之一相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一至十一之一不同的是步骤二中消化液的体积为组织块体积的10倍。其它与具体实施方式
一至十一之一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤二中将组织块用消化液消化20min。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
一至十三之一不同的是步骤二中差速贴壁lOOmin。其它与具体实施方式
一至十三之一相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
一至十四之一不同的是步骤二中的细胞悬液A的细胞密度为1 X IO6 3 X IO6个/mL。其它与具体实施方式
一至十四之一相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
一至十四之一不同的是步骤二中的细胞悬液A的细胞密度为2 X IO6个/mL。其它与具体实施方式
一至十四之一相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
一至十六之一不同的是步骤三中制成细胞密度为1 X IO6 3 X IO6个/mL的心肌细胞悬液。其它与具体实施方式
一至十六之一相同。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
一至十六之一不同的是步骤三中制成细胞密度为2X106个/mL的心肌细胞悬液。其它与具体实施方式
一至十六之一相同。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
一至十八之一不同的是步骤三中将心肌细胞悬液逐滴加入到40 80mmol/L的二价阳性离子溶液中。其它与具体实施方式
一至十八之一相同。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
一至十八之一不同的是步骤三中将心肌细胞悬液逐滴加入到60mmol/L的二价阳性离子溶液中。其它与具体实施方式
一至十八之一相同。
具体实施方式
二十一本实施方式与具体实施方式
一至二十之一不同的是步骤四中海藻酸钠溶液的质量浓度为0. 5% 2%。其它与具体实施方式
一至二十之一相同。
具体实施方式
二十二 本实施方式与具体实施方式
一至二十之一不同的是步骤四中海藻酸钠溶液的质量浓度为1%。其它与具体实施方式
一至二十之一相同。
具体实施方式
二十三本实施方式与具体实施方式
一至二十二之一不同的是步骤四中多聚赖氨酸溶液的质量浓度为1%。其它与具体实施方式
一至二十二之一相同。
具体实施方式
二十四本实施方式一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，按以下步骤进行一、将质量浓度为2%的海藻酸钠溶液与质量浓度为30% 的I型胶原蛋白溶液混合，得到混合溶液；二、将出生后3d的Wistar大鼠乳鼠心脏置于4°C 的0. lmol/L的PBS溶液中，然后用4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗心脏5次，再将心脏组织剪成1 3mm3大小的组织块，再用4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗3次，然后将组织块用消化液消化30min，再加入组织块10倍体积的DMEM培养基，离心后弃上清，然后向沉淀中加入DMEM培养基制成细胞悬液A，将细胞悬液A接种到培养瓶中，差速贴壁120min，得到纯化的心肌细胞；三、将纯化的心肌细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为 2X IO6个/mL的心肌细胞悬液，采用针头将心肌细胞悬液逐滴加入到lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5min，得到包裹心肌细胞的微球；四、将包裹心肌细胞的微球加入质量浓度为的海藻酸钠溶液中静置IOmin后，再放入质量浓度0.5%的多聚赖氨酸溶液中静置lOmin，将经过静置的包裹心肌细胞的微球放于DMEM培养基进行三维培养2周，即形成具有持续搏动功能的三维类心肌组织；其中步骤一中I型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的20% ；步骤二中消化液由胰酶和胶原酶II组成，消化液中胰酶的质量浓度为 0. 02%，胶原酶II的质量浓度为0. 01%;步骤二中消化液的体积为组织块体积的10倍；步骤二和步骤四中的DMEM培养基中都含质量浓度为15%的胎牛血清；步骤二中的细胞悬液 A的细胞密度为2 X IO6个/mL;步骤三中的二价阳离子溶液中二价阳离子为钙离子、钡离子或锶离子；步骤四中海藻酸钠溶液的体积为微球体积10倍，多聚赖氨酸溶液的体积为微球体积的10倍。本实施方式步骤三制得的包裹心肌细胞的微球如图1和2所示，图1为包裹心肌细胞的微球的照片，图2为微球在显微镜下放大40倍的照片，可看出微球的大小均勻，直径约为2. 3mm。将微球进行DAPI染色，如图3所示，图3为经DAPI染色后的微球在显微镜下放大40倍的照片，可以看到心肌细胞在微球内分布均勻。将本实施制备的三维类心肌组织继续培养至2个月，形成肉眼可见的三维类心肌组织，如图4和图5所示，图4为培养2个月的包裹三维类心肌组织的微球的照片，图5为培养2个月的包裹三维类心肌组织的微球在显微镜下放大400倍的照片。将培养2个月的三维类心肌组织从微球中释放出来，进行扫描电镜观察，图6为培养2个月的三维类心肌组织放大500倍的扫描电镜照片，图7为培养2个月的三维类心肌组织放大4000倍的扫描电镜照片，可以看到类心肌组织具有多层致密的细胞结构。将本实施制备的三维类心肌组织继续培养，观察其搏动情况，图8为三维类心肌组织在不同的培养时间同步搏动频率的检测图，图中表明类心肌细胞在三维状态下形成了细胞间通讯连接，其搏动时间可持续2个月，搏动频率维持在20 30次左右。
权利要求
1.一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，按以下步骤进行一、将质量浓度为 0. 05% 3%的海藻酸钠溶液与质量浓度为10% 50%的I型胶原蛋白溶液混合，得到混合溶液；二、将出生后1 3d的Wistar大鼠乳鼠心脏置于0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液中，然后用0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗心脏3 5次，再将心脏组织剪成1 3mm3 大小的组织块，再用0 4°C的0. lmol/L的PBS溶液清洗3 5次，然后将组织块用消化液消化10 30min，再加入组织块10倍体积的DMEM培养基，离心后弃上清，然后向沉淀中加入DMEM培养基制成细胞悬液A，将细胞悬液A接种到培养瓶中，差速贴壁90 120min， 得到纯化的心肌细胞；三、将纯化的心肌细胞与步骤一制得的混合溶液混合，制成细胞密度为0. 5X IO6 5X IO6个/mL的心肌细胞悬液，采用针头将心肌细胞悬液逐滴加入到25 lOOmmol/L的二价阳性离子溶液中，静置5 20min，得到包裹心肌细胞的微球；四、将包裹心肌细胞的微球加入质量浓度为0. 3%的海藻酸钠溶液中静置5 20min后，再放入质量浓度为0. 5 2%的多聚赖氨酸溶液中静置5 20min，然后将经过静置的包裹心肌细胞的微球放于DMEM培养基进行三维培养1 2周，即形成具有持续搏动功能的三维类心肌组织；其中步骤一中I型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的0. 50% ；步骤二中消化液由胰酶和胶原酶II组成，消化液中胰酶的质量浓度为0. 02 0. 2%，胶原酶II 的质量浓度为0. 01 0. 1%;步骤二中消化液的体积为组织块体积的9 12倍；步骤二和步骤四中的DMEM培养基中都含质量浓度为10% 15%的胎牛血清；步骤二中的细胞悬液 A的细胞密度为0. 5X IO6 5X IO6个/mL ；步骤三中的二价阳离子溶液中二价阳离子为钙离子、钡离子或锶离子；步骤四中海藻酸钠溶液的体积为微球体积的9 12倍，多聚赖氨酸溶液的体积为微球体积的9 12倍。
2.根据权利要求1所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于步骤一中海藻酸钠溶液的质量浓度为0. 5% 2%。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于I型胶原蛋白溶液的质量浓度为20% 40%。
4.根据权利要求3所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于步骤一中I型胶原蛋白溶液的质量是海藻酸钠溶液质量的5% 40%。
5.根据权利要求4所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于步骤二的消化液中胰酶的质量浓度为0. 05 0. 15%。
6.根据权利要求5所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于步骤二的消化液中胶原酶II的质量浓度为0. 05%。
7.根据权利要求6所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于步骤三中制成细胞密度为IX IO6 3X IO6个/mL的心肌细胞悬液。
8.根据权利要求7所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法， 其特征在于步骤三中将心肌细胞悬液逐滴加入到40 SOmmol/L的二价阳性离子溶液中。
9.根据权利要求8所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于步骤四中海藻酸钠溶液的质量浓度为0. 5% 2%。
10.根据权利要求9所述的一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，其特征在于步骤四中多聚赖氨酸溶液的质量浓度为1%。
全文摘要
一种用于研究模拟微重力效应的三维类心肌组织的制备方法，涉及一种三维类心肌组织微球的制备方法。本发明是要解决目前用于研究模拟微重力效应的细胞三维培养方法中cytodex微载体材料具有毒性而对心肌细胞产生不利影响，培养时需要的细胞量大，收取细胞困难，细胞在回转器中培养时易受剪切力的干扰，心肌细胞的持续收缩时间短的问题。方法制备混合溶液；制备心肌细胞；制成细胞悬液，加入二价阳性离子溶液中，得微球；将微球置于培养基中培养，即形成三维类心肌组织。使用本发明方法制备的三维类心肌组织可长期培养，无需传代，可长时间维持心肌细胞收缩功能。应用于空间生物学、航天医学和组织工程研究领域。
文档编号C12N11/04GK102174501SQ20111006154
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者李钰, 田维明, 郑红霞 申请人:哈尔滨工业大学