专利名称：人生长抑素二十八肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其编码基因和制备方法
技术领域：
本发明属于长效融合蛋白药物技术领域，具体涉及人生长抑素二十八肽与人血清白蛋白的融合蛋白。
背景技术：
生长抑素(somatostatin, SST)是ー种环状的多肽类激素，是Brazeau等在1973年从羊下丘脑分离提纯的一种生长激素释放抑制因子(somatotropinrelease-inhibiting factor, SRIF)，有 14 肽(SST14)和 28 肽(SST-28)两种天然形式。 SST-28是SST14的N端延伸形式，两者由同一前体(92肽生长抑素前体)经蛋白水解而来。尽管两者有相似的活性，但其作用強度和组织学特性仍有一定的差別，SST14抑制胰高血糖素和胃泌素作用强，而SST-28抑制生长激素和胰岛素作用強。SST通过与祀细胞膜上的特异性受体(Somatostatin receptors, SSTRs)结合而发挥多种生物活性。SSTR共有5个分子亚型，SSTRl 5，其中SSTR2又存在SSTR2A和SSTR2B两种变异体，它们都以类似的亲和カ与SST14和SST-28结合。SST除能抑制生长激素外，几乎对机体所有的生理性内外分泌反应均有抑制作用，而且能广泛抑制细胞增殖活性。近年来的研究发现，SST及其类似物具有抗肿瘤活性，不仅能抑制内分泌肿瘤的増殖，而且对许多实体肿瘤，如乳腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌等也具有抑制作用。SST-28的降解速度明显低于SST14，因此SST-28是血浆中SST存在的主要形式。天然SST作用广泛，但选择性较差且半衰期短，停药后易出现激素水平的反跳高分泌现象，因而其临床应用受限。人工合成的生长抑素类似物，如奥曲肽、伐普肽、兰瑞肽及司格列肽等，作用持久但相对単一，仅与部分受体有高亲和力，在生理功能的发挥上远不如天然SST。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)作为人体血衆的主要成分,具有无酶活性和免疫原性、分子量大、半衰期长(大约23天)等优点，并且是许多内源因子和外源药物的载体。采用以HSA为载体的融合蛋白技木，将药物蛋白与HSA分子融合表达，一方面増加了药物蛋白的分子量，降低了肾脏的排泄速率；另ー方面，融合的蛋白分子表面产生空间位阻效应，减低血液中蛋白水解酶对药物蛋白的水解作用，从而有效地延长了药物蛋白分子在血液循环系统内的滁留时间。通过改变药物的药代动力学特性，使得药物的血浆浓度更加稳定，药物在体内維持的时间更长，从而达到提高药物疗效的效果。基因串联技术是将数个目的基因首尾相连随机串联起来，常常用在需要获取足够的DNA片段或基因的表达产物的情况下，由于SST在人体内是通过受体与配体相互结合的方式产生生理作用，增加药物分子中配体的数目，理论上无疑会使药物与配体结合的机会増加，活性增强。
发明内容
本发明的目的就是针对上述缺陷，提供了ー种人生长抑素二十八肽与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人生长抑素二十八肽同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白至少85%序列同源的第ニ区位于融合蛋白的N末端，所述与人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。所述的人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区为串联体形式。所述的人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区为单体、ニ联体或三联体。所述融合蛋白的第二区由人血清白蛋白部分结构域组成或经人血清白蛋白部分结构域重排后的人血清白蛋白组成。
上述融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白质
a)由序列表中序列2或4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2或4的氨基酸残基序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能延长的体内半衰期的由a)衍生的蛋白质。本发明的另ー个目的是提供了由人生长抑素二十八肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白的编码基因。所述的编码基因，是如下I)或2)的基因
1)其核苷酸序列是序列表中的序列I或3;
2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。本发明的第三个目的是提供含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本发明的第四个目的是提供一种表达所述的由人生长抑素二十八肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白的方法，是将含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主，表达得到融合蛋白；所述宿主为酵母菌，优选为毕赤酵母GS115 ;所述用于构建所述重组表达载体的出发载体为PPIC9K。本发明的有益效果为本发明提供的由人生长抑素二十八肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白中间不加任何连接肽，避免了因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性等方面的问题；并且其在提高和/或維持天然人生长抑素二十八肽的生物活性的基础上，延长了天然人生长抑素二十八肽分子在血液循环系统内的滁留时间，改变了其药代动力学特性，从而使该融合蛋白具有临床药用价值；此种融合蛋白可应用于治疗因生长激素分泌过剩所引起的各种疾病，用于治疗胃肠道内分泌紊乱引起的疾病，用于抑制表达SSTRs和不表达SSTRs肿瘤的生长，用于降低胃肠道辐射损伤导致的死亡率。
图I为本发明所提供的融合蛋白中人生长抑素二十八肽与人血清白蛋白关联示意图。图2 为质粒 PPIC9K- (SST-28) 2-HSA/pPIC9K_HSA- (SST-28) 2 结构图。
图3为(SST-28) 2的重叠PCR产物。图4为HSA的PCR产物。图 5 为融合蛋白(SST-28) 2_HSA 和 HSA- (SST-28) 2 的 SDS-PAGE 分析。其中，M:蛋白质分子量标准；Lane I:重组菌GS115/pPIC9K-(SST_28)2-HSA表达产物；Lane 2:重组菌 GS115/pPIC9K-HSA-(SST_28)2 表达产物。图6 为融合蛋白(SST-28)2_HSA 和 HSA-(SST-28)2 的 Western blot 鉴定。其中，LaneI:融合蛋白(SST-28)2-HSA ；Lane 2:融合蛋白 HSA-(SST_28)2 图7为融合蛋白(SST-28)2-HSA和(SST-28)2-HSA的分离纯化。
其中，M:蛋白质分子量标准；Lane I:缓冲液B洗脱的融合蛋白(SST_28)2_HSA的透析产物；Lane 2: 50%こニ醇洗脱的融合蛋白(SST-28) 2_HSA的透析产物；Lane 3:缓冲液B洗脱的融合蛋白HSA- (SST-28) 2的透析产物；Lane 2: 50%こニ醇洗脱的融合蛋白HSA-(SST-28)2的透析产物。缓冲液B的洗脱液中含高浓度融合蛋白，纯度在95%以上，冷冻干燥后作为后续药效学研究的样品。50%こニ醇的洗脱液中大部分为融合蛋白的降解产物，表明该亲和柱有较好的分离效果。图8为融合蛋白(SST-28)2_HSA和(SST-28)2_HSA在小鼠体内的药效学检测結果。图9为融合蛋白(SST-28)2_HSA抑制裸鼠体内移植肿瘤的生长研究結果。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法和所用的试剂，如无特别说明，均为常规方法和常规试齐 。质粒抽提试剂盒，DNA胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购自上海生エ生物エ程有限公司。pMD19-T Simple Vector, TaKaRa Taq , T4 DNA 连接酶，各种限制性内切酶以及Ε. coli Competent Cell JM109 均购自 TaKaRa 公司。毕赤酵母宿主菌GSl 15及分泌型表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。引物合成及DNA测序服务均由上海生エ生物工程有限公司提供。胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司产品，
无氨基酸的酵母氮基为美国BD公司Difco培养基。PVDF膜购自美国Bio-Rad公司。兔抗人SST多抗(ab53165)和兔抗人HSA多抗(ab83465)为英国Abcam公司产品。HRP标记的羊抗兔ニ抗为美国Santa Cruz公司产品。增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色购自天根生化科技有限公司。Blue Sepharose 购自美国 Pharmacia 公司。小鼠生长激素(GH)定量检测试剂盒为美国R&D公司产品。下述实施例中的主要试剂
I.引物
PSl :5，-TGAGAATTCAAAAGAtctgctaactcaaacccggctatggcaccccga-3，；
PS2 :5’ -TAAATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCacaggatgtgaaag-3’ ；
PS3 :5’ -ACTGCCTTAGGCTTATCTGCTAACTCAAACCCGGCT-3’ ；PS4 :5’ -GATAGCGGCCGCTTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCA-3’ ；
PHl :5’ -AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ ；
PH2 :5’ -GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ ；
PH3 :5’ -GCCGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGAT-3’ ；
PH4 :5’ -CATAAGGCGGCCGCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’ ；
2.SST-28 ニ联体核苷酸序列
(SS-28)2-寡核苷酸序列I :
5’ -tctgctaactcaaacccggctatggcaccccgagaacgcaaagctggctgcaagaatttcttctggaagactttcacatcctgttctgctaactcaaac-3> ；
(SS-28)2-寡核苷酸序列2
5’ -acaggatgtgaaagtcttccagaagaaattcttgcagccagctttgcgttctcggggtgccatagccgggtttgagttagcagaacaggatgtgaaagt-3，；
3.培养基配方
BMGY培养基2%胰蛋白胨，1%酵母提取物，100 mmol/L磷酸钾(pH 6. 0)，I. 34%无氨基酸的酵母氮基(YNB)，4X 10_5%生物素，2%甘油。BMMY培养基2%胰蛋白胨，1%酵母提取物，100 mmol/L磷酸钾(pH 6. O), I. 34%无氨基酸的酵母氮基(YNB)，4X 10_5%生物素，2%甲醇。4、序列说明包括有融合蛋白(SST28)2_HSA和HSA_(SST28)2的氨基酸和基因序列。通过定点突变在HSA的N端引入ClaI酶切位点，用于构建(SST28)2_HSA融合基因；HSA的C端存在SauI酶切位点，用于构建HSA-(SST28)2融合基因；采用EcoRI和NotI酶切位点，插入表达载体PPIC9K的阅读框。实施例
I. SST-28 ニ联体基因的克隆 a. (SST-28) 2寡核苷酸退火
人工合成ニ条互补的(SST-28)2寡核苷酸(參见(SS-28)2-寡核苷酸序列I和(SS-28)2-寡核苷酸序列2)。ΙΟΟμΜ浓度的寡核苷酸序列I和2各取ΙΟμΙ至70μ1 ddH20中，同时加入ΙΟμΙ IOX退火缓冲液，制备ΙΟμΜ (SS28)2_寡核苷酸混合溶液。95° C高温加热寡核苷酸混合溶液2分钟后，让寡核苷酸混合溶液自然冷却至室温(25° C-300 C)。b. (SST-28) 2 延伸
30 μ 退火的寡核苷酸模板，10 μΙΙΟΧ Klenow缓冲液，ΙΟμΙ 25 mM dNTPs，混合，37° C孵化30分钟。增加4 μΙΙΟΟ mM EDTA终止反应。c. (SST-28) 2 PCR 扩 增
反应体系为10μ mol/L 的 PSl 和 PS2 引物各 0. 5μ1,1OmmoI/L 的 dNTP O. 5μ1, IOXpfu缓冲液 2· 5μ 1，5υ/μ1 的 pfu DNA 聚合酶 0. 5μ1，(SST-28) 2 延伸产物 0. 5μ1 (含 Ing DNA),カロ dd H2O 补齐 25μ1。PCR反应程序95°C预变性5分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸秒，循环25次；72 °C延伸2分钟。2%琼脂糖凝胶分析重叠PCR反应产物，切割下目的条带卿230bp条带)，PCR胶回收试剂盒回收，并与PMD19-T Simple vector连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞内，通过菌落鉴定阳性克隆，DNA测序验证SST-28 ニ联体基因序列正确，获得的阳性重组子命名为 JM109/pMD19T-(SST-28)2。2. HSA基因的克隆
利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA。PCR 反应体系10 μ mol/L 的 PHl 和 PH2 引物各 I. 5μ 1,2. 5mmol/L 的 dNTP 4 μ 1，IOXpfu 缓冲液 5μ1，5υ/μ1 的 pfu DNA 聚合酶 O. 5 μ 1，人胎肝 cDNA 文库 lng，加 ddH20补齐50 μ I οPCR反应程序95°C预变性5分钟；94°C变性I分钟，60°C退火I分钟，72°C延伸I分30秒，循环25次；72°C延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，回收并纯化I. Skb的目的片断。对回收的目的 片断和pBlu2KSP载体进行Sal I和Hind III双酶切，并经T4 DNA连接酶将双酶切的PCR目的片段和双酶切的pBlu2KSP载体相连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，通过含有X-gal、IPTG和100 μ g/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板的培养、PCR扩增、核酸内切酶位点的有无、及DNA序列测定等方法鉴定阳性克隆。阳性重组子命名为JM109/pBlu2KSP-HSA。3. (SST-28) 2和HSA融合基因的克隆
a. (SST-28) 2-1，(SST-28) 2-2 PCR 反应产物扩增
以pMD19T-(SST-28)2为模板，以PSl和PS2为引物，进行PCR扩增反应，反应产物为(SST-28) 2-1，用于构建融合蛋白(SST-28) 2_HSA。以pMD19T-(SST_28)2为模板，以PS3和PS4为引物，进行PCR扩增反应，扩增产物为(SST-28)2-2，用于构建融合蛋白HSA-(SST-28)2。PCR 反应体系为10ymol/L 的引物 PSl 和 PS2(或 PS3 和 PS4)各 I. 5μ 1,2. 5mmol/L 的 dNTP 4μ 1,10XPCR 缓冲液 5 μ 1，5U/μ I 的 TaKaRa Taq 0·25μ1，质粒 DNA O. 5 μ I(含 lng DNA)，カロ (1册20补齐5(^1。PCR反应程序95°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，循环25次；72°C延伸3分钟。b. HSA基因的PCR扩增
以pBlu2KSP-HSA为模板，以PH3和PH4为引物，进行PCR扩增反应。反应体系为10ymol/L的引物 PH3 和 PH4 各 I. 5μ 1，2· 5mmol/L 的 dNTP 4μ I,10XPCR 缓冲液 5 μ I，5U/ μ I 的 TaKaRa Taq O. 25 μ I,质粒 DNA O. 5 μ I (含 lng DNA)，加ddH20 补齐 50 μ I。PCR反应程序95°C预变性5分钟；94°C变性I分钟，60°C退火I分钟，72°C延伸I分30秒，循环25次；72°C延伸10分钟。PCR产物与pMD19_T载体相连接，阳性重组子命名为 JM109/pMD19T-HSA。c. (SST-28)2和HSA融合蛋白表达基因的构建
PCR 产物(SST-28)2-l 经 EcoRI-ClaI 双酶切，PCR 产物(SST_28)2_2 经 SauI-NotI 双酶切，井分别与经同样酶切的PMD19T-HSA载体连接，PCR扩增反应鉴定阳性克隆菌落，阳性重组子命名为 JM109/pMD19T-(SST-28)2-HSA 和 JM109/pMD19T_HSA-(SST-28) 2。4. (SST-28)2_HSA和HSA-(SST_28)2酵母表达系统构建及融合蛋白的表达 a.融合蛋白(SST-28) 2-HSA和HSA- (SST-28) 2酵母表达系统的构建(a-1). pMD19T- (SST-28) 2_HSA、pMD19T_HSA_ (SST-28) 2 及酵母表达载体 pPIC9K，分别经EcoRI-NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收酶切(SST-28)2-HSA、HSA-(SST-28) 2以及载体PPIC9K酶切DNA片段，经1\ DNA连接酶将载体pPIC9K分别与(SST-28) 2_HSA和HSA-(SST-28)2相连接，PCR扩增反应鉴定阳性克隆菌落。阳性重组子命名为JM109/pPIC9K- (SST-28) 2_HSA 和 JM109/pPIC9K_HSA- (SST-28) 2。(a-2). pPIC9K-(SST-28) 2-HSA 和 pPIC9K_HSA_ (SST-28) 2，经 Sail 单酶切后，DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。单酶切回收产物通过电击方法转化毕赤酵母GSl 15，转化物涂布于含有lmol/L山梨醇的MD平板上，于30°C培养4天。阳性克隆命名为GS115/pPIC9K-(SST-28)2-HSA 和 GS115/pPIC9K-HSA-(SST_28)2。b.融合蛋白(SST-28) 2-HSA 和 HSA- (SST-28) 2 的酵母表达
接种融合蛋白(SST-28)2-HSA和融合蛋白HSA-(SST-28)2阳性单菌落于装有IOml BMGY培养基的三角瓶中，200rpm，30°C培养约24h至OD6tltl为18，静置2h使菌体自然沉降，倾去上清，重悬菌体于3ml BMMY培养基中，连续诱导培养72h，每24 h补加一次甲醇至终浓度为2%，离心收集上清，SDS-PAGE检测融合蛋白表达情況，筛选表达产量最高的重组菌作为后续实验的出发菌株。c.融合蛋白(SST-28) 2_HSA 和 HSA- (SST-28) 2 的鉴定
挑选生产融合蛋白(SST-28)2-HSA和HSA-(SST-28)2最高的重组菌株，其发酵上清经SDS-PAGE电泳后，利用兔抗人SST-28多抗和兔抗人HSA多抗，经Western blot鉴定融合蛋白(SST-28) 2-HSA 和 HSA- (SST-28) 2 的表达。5. (SST-28)2_HSA 和 HSA-(SST_28)2 融合蛋白的样品制备 a.融合蛋白在5升(5L)发酵罐上的表达
阳性 GSl 15/pPIC9K- (SST-28) 2_HSA 或 GSl 15/pPIC9K_HSA_ (SST-28) 2 克隆菌，接种至装有50ml BMGY培养基的250ml三角瓶中，200rpm，30°C培养24h，制备得到ー级种子。以2%接种量将一级种子接入装有150ml BMGY培养基的500ml三角瓶中，200rpm，30°C培养24h，制备得到ニ级种子。按5%接种量把ニ级种子接入装有2. 51 BMGY培养基的5L发酵罐中，设定发酵初始条件为温度30°C，转速500rpm，通气量2VVM，pH6. O。发酵开始24h左右，初始培养基中的碳源(甘油)消耗完毕，溶氧开始反弹，此时开始流加补料生长培养基(5%胰蛋白胨，10%酵母提取物，10%甘油，6. 7% YNB，2X 10、生物素)，流速为4ml/min，补料500ml。补料完成后，一次性补加O. 2%甲醇，使其适应新碳源。待溶氧再次上升超过40%时，开启甲醇脉冲式流加，一次性补加O. 5%甲醇，周期性执行，每当溶氧上升超过40%时，一次性补加O. 5%甲醇，诱导42h。SDS-PAGE电泳检测不同时段融合蛋白的表达情況。b.融合蛋白发酵产物的分离纯化
发酵液下罐后，4°C,8，000 r/min离心IOmin,取上清，过O. 45 μπι膜。采用CogentMl中试规模半自动超滤装置，截留分子量为10 kDa，进行超滤。原始发酵液上清3L超滤至300ml,加入300ml蒸懼水重新超滤至300ml,如此重复3遍,使电导降至10 ms/cm以下。Blue Sepharose F. F.树脂 50 ml 装柱(25/20)，以缓冲液 Α(ρΗ7· 2，O. 02 mol/L磷酸缓冲液，0.15 mol/L NaCl)平衡，流速10 ml/min。上述样品解冻后调pH为7. 2，15，000r/min离心10 min,以5 ml/min的流速上样,上样量为300 ml。上样结束后调节流速为10 ml/min，继续以缓冲液A洗脱至基线水平。以缓冲液B (pH7. 2，0. 02 mol/L磷酸缓冲液，2 mol/L NaCl)洗脱吸附在亲和柱上的蛋白样品，随后用50%こニ醇(50%こニ醇，pH7. 2，O. 02 mol/L磷酸缓冲液，2 mol/L NaCl)洗脱残余蛋白。收集各洗脱峰，进行SDS-PAGE分祈。纯化样品在蒸馏水中透析至电导为20 μ s/cm，冷冻干燥后用于后续药效学实验。6.融合蛋白(SST-28)2_HSA和HSA-(SST_28)2在小鼠体内的药效学研究 BALB/c雄性小鼠18只，平均体重约为20g，随机分为阳性对照组，融合蛋白
(SST-28) 2-HSA组和HSA- (SST-28) 2组，尾静脉注射10mg/kg体重融合蛋白，阳性对照样品为天然SST14 ( Cat No. S1763_lmg，Sigma),注射剂量为O. 15mg/kg体重。融合蛋白注射后的0、2、6、24 h分钟别从眼框采血，小鼠血清经生长激素(GH)定量检测试剂盒(R&D公司)检测血清中GH的含量。7.融合蛋白(SST-28)2_HSA抑制裸鼠体内移植肿瘤的生长研究 8周龄实验裸鼠20只，平均体重20g，每只裸鼠皮下移植IxlO6 FTC-133人甲状腺滤泡癌细胞(human follicular thyroid carcinoma),移植7天后肉眼可见移植肿瘤结节形成后，裸鼠随机分成实验和对照ニ组，实验组每ニ天皮下注射10mg/kg体重融合蛋白(SST-28)2-HSA 一次，对照组每ニ天皮下注射10mg/kg酵母表达的HSA —次。实验第21天(每只裸鼠共注射融合蛋白或HSAll次)，处死实验裸鼠，并从裸鼠皮下分离肿瘤块，检测肿瘤块的大小和重量，结果如图9所示。8. SST-28单体融合基因的构建
人工合成SST-28单体基因，分别采用EcoRI和ClaI双酶切构建(SST-28)-HSA融合基因，采用SauI和NotI双酶切构建HSA-(SST-28)融合基因，采用EcoRI和Not I双酶切分别将其插入毕赤酵母表达载体PPIC9K中。其余操作同SST-28 ニ联体融合蛋白的制备。10. SST-28三联体融合基因的构建
按步骤I所述进行SST-28串联体的重叠PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，割下SST-28三联体基因目的条带(约310bp条带)，PCR胶回收试剂盒回收，并与pMD19_T Simplevector连接,测序验证序列正确。从步骤2开始，其余操作同SST-28 ニ联体融合蛋白的制备。
权利要求
1.一种人生长抑素二十八肽与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于包括与人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人生长抑素二十八肽同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述的人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区为串联体形式。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述的人生长抑素二十八肽至少85%序列同源的第一区为单体、二联体或三联体。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第二区由人血清白蛋白部分结构域组成或经人血清白蛋白部分结构域重排后的人血清白蛋白组成。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于是如下a)或b)的蛋白质 a)由序列表中序列2或4的氨基酸残基序列组成的蛋白质； b)将序列表中序列2或4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能延长的体内半衰期的由a)衍生的蛋白质。
6.权利要求5所述的由人生长抑素二十八肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白的编码基因。
7.如权利要求6所述的编码基因，其特征在于是如下I)或2)的基因 1)其核苷酸序列是序列表中的序列I或3; 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。
8.含有权利要求7所述融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
9.一种表达权利要求I所述的由人生长抑素二十八肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白的方法，其特征在于将含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主，表达得到融合蛋白；所述宿主为酵母菌；所述用于构建所述重组表达载体的出发载体为PPIC9K。
全文摘要
本发明公开了一种人生长抑素二十八肽与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人生长抑素二十八肽至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；与人生长抑素二十八肽同源的第一区位于融合蛋白的N末端，与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的N末端，与人生长抑素二十八肽至少85％序列同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。本发明的有益效果为可应用于治疗因生长激素分泌过剩所引起的各种疾病，用于治疗胃肠道内分泌紊乱引起的疾病，用于抑制表达SSTRs和不表达SSTRs肿瘤的生长，用于降低胃肠道辐射损伤导致的死亡率。
文档编号C12N15/63GK102675467SQ201110061089
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者董永艳, 陈蕴 申请人:无锡坤洲大得药业有限公司