专利名称：一种用于儿童哮喘检测的标志物的制作方法
技术领域：
本发明属于儿童哮喘辅助诊断领域，具体涉及一种用于儿童哮喘检测的标志物。
背景技术：
支气管哮喘是当前世界威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病，哮喘的发生可影响人类各年龄层，可在婴幼儿起病，并以儿童多发。在最近的几十年，儿童哮喘的患病率呈明显上升的趋势，有些国家甚至在短短10年间患病率就上升了 1倍多[1]。我国1990和2000年进行的全国儿童哮喘发病调查结果显示，10年间儿童哮喘患病率由0.91%上升到1.50%， 患病率上升了 64. 84% [2] 哮喘不仅严重危害儿童的健康成长，对其整个一生的生存质量产生远期影响，而且给我国带来沉重的经济损失和社会负担，影响社会稳定和国民经济的可持续发展。哮喘的病因和发病机制十分复杂，是免疫、遗传和环境因素综合作用的结果。一般认为哮喘在儿童5岁左右有两个发病高峰。临床上大多数患者是从隐匿发病开始，逐渐加重的。如果所有的哮喘患者都能在早期得到及时地诊断与治疗，其预后将大为改观，同时也会节约大量的医疗卫生资源。儿童因年龄、生理解剖、免疫功能、变应原接触量、环境情况等因素致喘，致喘因素复杂，故童哮喘在发作诱因、频度、轻重上不同于成人[3]。儿童哮喘诊断主要有以下几点难点1、儿童哮喘的诊断需除外其他疾病，但要除外的疾病种类相当庞大，需要临床工作者丰富的工作经验和审慎的工作态度。2、5岁以下的儿童肺功能测定及支气管激发试验难于开展，加大了儿童哮喘的诊断难度。3、对反复喘息的认识有一定难度，如对患儿既往喘息次数的正确掌握应该依据医疗病历记载而并非家长主诉，但在我国许多家长特别是来自农村的家长对医疗病历保管不当经常遗失，因此对患儿既往喘息情况不得而知。诊断主要依据症状、体征，缺乏诊断方法和指标的金标准。特应性变应原检测、总IgE和特异性IgE的检测、肺功能的检测、支气管舒张试验和支气管激发试验(后3项检查尤其适用于5岁以上儿童)对儿童哮喘的诊断具有重要的作用，但并非所有患儿均具有上述指标异常。因此，迫切需要更好的早期检测儿童哮喘的方法。TRPV2是 TRP(transientreceptor potential)阳离子通道超家族V亚家族的成员[4]，是非选择性阳离子通道，在体内可被伤害性热刺激(> 52摄氏度)和TRP激动剂激活。TRPV2广泛分布在所有脊髓、脑和非神经细胞[5_8]，在脾、肺、肠组织及淋巴细胞中均有表达[9_1(1]，其表达分布表明TRPV2除了可感伤有害的热刺激外，还可能具有广泛的生物学功能。研究表明，TRPV 家族成员可以被刺激性空气污染物等激活；同时它的激活，可引起感觉神经C纤维激活，刺激沿轴索上行传递，在它的轴索神经反射范围内的其它神经原亦会激活，可以使局部组织出现血管扩张、通透性增加、炎性渗出、黏膜水肿、黏液分泌亢进、支气管收缩，即所谓的“气道神经源性炎症”，是引起哮喘发作的重要原因。因此TRPV2作为TRPV家族成员之一，与哮喘的发病密切相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于儿童哮喘检测的标志物。一种用于儿童哮喘检测的标志物，其特征在于，所述标志物为采用半定量RT-PCR 或实时定量PCR的扩增产物，扩增引物为针对TRPV2基因序列(Genbank登录号匪 016113. 3)的特异性引物，扩增模板为儿童外周血淋巴细胞中提取总RNA并反转录成的 cDNA。所述半定量RT-PCR扩增产物的序列如SEQ ID No. 1所示，长度为578bp，实时定量 PCR扩增产物的序列如SEQ ID No. 2所示，长度为95bp。所述特异性引物包括针对半定量RT-PCR的特异性引物和针对实时定量PCR的特异性引物。所述针对半定量RT-PCR的特异性引物为引物fl具有序列表中SEQ ID No. 3的核苷酸序列，引物rl具有序列表中SEQ ID No. 4的核苷酸序列；针对实时定量PCR的特异性引物为引物f3具有序列表中SEQ ID No.5的核苷酸序列，引物r3具有序列表中SEQ ID No. 6的核苷酸序列。本发明的有益效果本发明通过标志物检测哮喘组儿童外周血淋巴细胞中TRPV2 基因表达水平，与检测总IgE相比，其敏感性更高。本发明采用半定量RT-PCR和实时定量 PCR的方法能够精确、快速检测TRPV2基因的表达水平。
图1 :TRPV_2在哮喘组(A)与正常组(B)半定量RT-PCR结果；其中标号33-38代表哮喘组实验标号，48、58、59、62、63代表正常组实验标号。图2 :TRPV-2在哮喘组与正常组实时定量PCR结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1 哮喘患儿及对照的选择按照儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2008年修订)的诊断标准，在儿童医院呼吸科，由临床医生选择符合标准的哮喘患儿，年龄彡15岁，共60例患儿。选取与哮喘组儿童年龄、性别、相匹配的健康儿童60例作为对照组。病例的判定依据儿童年龄选择不同的判定标准婴幼儿哮喘诊断标准⑴年龄< 3岁，喘息发作彡3次；⑵发作时双肺闻及呼气相哮鸣音，呼气相延长；(3)具有特应性体质，如过敏性湿疹、过敏性鼻炎等；(4)父母有哮喘病史或其他过敏史；(5)除外其他引起喘息的疾病。凡具有(1)、(2)、(5)条即可诊断哮喘。如喘息发作2次，并具有第(2)、(5)条，诊断为可疑哮喘或喘息性支气管炎(< 3岁)。 如同时具有第(3)和/或第(4)条时，可考虑给予哮喘治疗性诊断。儿童哮喘的诊断标准(1)年龄彡3岁，喘息呈反复发作者(如发作1次，若可追溯与某种变应原或刺激因素有关，亦可考虑)；(2)发作时双肺闻及以呼气相为主的哮鸣音， 呼气相延长；(3)支气管扩张剂有明显的疗效；(4)除外其他引起喘息的疾病。实施例2 血样的收集及生物指标的检测
抽取研究对象静脉血检测血清中总IgE，该部分检测工作由医院协助完成。分析方法采用免疫印迹法定量检测血清中总IgE水平。具体操作方法抽取病人静脉血1ml，分离血清，取250 μ L与吸附有特异性过敏原的硝酸纤维素膜于反应槽内室温孵育45min，洗涤后加入标记了生物素的抗人IgE抗体，室温孵育45min，洗脱未结合的二抗，加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，再室温孵育 20min，洗去未结合酶，加入底物显色。所有孵育在混勻器(120次振/min)上完成。显色深浅与血清中slgE含量成正比，通过C⑶相机照相，将结果导入软件系统，并计算出总IgE的分级和浓度数值(IU/ml)。
实施例3 提取RNA抽取研究对象静脉血3ml，EDTA抗凝用以提取RNA。RNA的提取方法，具体见盖宁生物科技有限公司生产的超纯总RNA快速提取试剂盒说明书。每份血样提取RNA后都分别对提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，利用紫外分光光度仪检测其浓度。计算 3微克所需反转录用量。实施例4:引物设计在GeneBank中下载登录的TRPV2基因的mRNA序列。根据已报道的TRPV2 基因序列，运用生物信息学分析，选择针对半定量RT-PCR的靶序列(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示)，设计并合成针对半定量RT-PCR检测TRPV2序列的特异性引物，上游引物:fl 5 ‘ -AGGGCGAGGACCGGAAATTC-3 ‘ (SEQ ID No. 3)，下游弓丨物:rl 5 ‘ -GGCGGGCTGGTGTGGGTT-3 ‘ (SEQ IDNo. 4)，上下游引物间的 TRPV2 片段长578bp。将hGAPDH磷酸甘油醛脱氢酶设为内参照物，上下游引物间的hGAPDH片段长 445bp。具体为上游引物f2 :5 ‘ -CATCATCCCTGCCTCTACTG-3 ‘，下游引物r2 5' -GGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3‘。选择针对实时定量PCR的靶序列(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示)，设计并合成针对实时定量PCR检测TRPV2序列的特异性引物，上游引物f3 5' -CTTCCTTTTC GGCTTCGCTGTAG-3‘ (SEQ ID No. 5)下游引物r3 :5‘ -GCACTGACTCTGTGGCATTGG-3‘ (SEQ ID No. 6)。上下游引物间的TRPV2片段长95bp。将hGAPDH磷酸甘油醛脱氢酶设为内参照物,上下游引物间的hGAPDH片段长87bp。上游引物f4 5' -TGCACCACCAACTGCTTAGC-3‘ 下游引物r4 5' -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3‘。对TRPV2基因预期产物进行BLAST分析。 结果证实所设计的目的片段与TRPV2基因的同源率为100%，而与其它因子的同源率均小于 40%。实施例5 半定量RT-PCR检测TRPV2基因的表达采用半定量RT-PCR方法，操作步骤如下RT-PCR方法以提取的RNA为模板，模板浓度为3 μ g，反应体系如下RNA 3 μ gOligo dT primer (50 μ Μ) 1 μ LdNTP (IOmM) 1 μ LddH20 力口至丨J 10 μ L65°C保温5min后，迅速在冰上冷却2min。离心数秒，在管中加下列反转录反应液5 X AMV反转录酶缓冲液2 μ L
AMV 反转录酶(5U) 1uLRNA 酶抑制剂(40U) 1uLddH20 力口至Ij 20 μ L42°C，30min，75°C，15min，4°C，冷却。取1 μ L反转录产物进行PCR反应，用相应 TRPV2基因引物(fl和rl)及GAPDH引物(f2和r2)进行PCR反应，反应体系(20 μ L)如
下
权利要求
1.一种用于儿童哮喘检测的标志物，其特征在于，所述标志物为采用半定量RT-PCR或实时定量PCR的扩增产物，扩增引物为针对TRPV2基因序列的特异性引物，扩增模板为儿童外周血淋巴细胞中提取总RNA并反转录成的cDNA。
2.一种用于儿童哮喘检测的标志物，其特征在于，所述半定量RT-PCR扩增产物的序列如SEQ ID No. 1所示，长度为578bp，实时定量PCR扩增产物的序列如SEQ ID No. 2所示，长度为％bp。
3.根据权利要求1所述一种用于儿童哮喘检测的标志物，其特征在于，所述特异性引物包括针对半定量RT-PCR的特异性引物和针对实时定量PCR的特异性引物。
4.根据权利要求3所述一种用于儿童哮喘检测的标志物，其特征在于，所述针对半定量RT-PCR的特异性引物为引物fl具有序列表中SEQ ID No. 3的核苷酸序列，引物rl具有序列表中SEQ ID No. 4的核苷酸序列；针对实时定量PCR的特异性引物为引物f3具有序列表中SEQ ID No. 5的核苷酸序列，引物r3具有序列表中SEQ ID No. 6的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了属于儿童哮喘辅助诊断领域的一种用于儿童哮喘检测的标志物。该标志物为采用半定量RT-PCR或实时定量PCR的扩增产物，扩增引物为针对TRPV2基因序列的特异性引物，扩增模板为儿童外周血淋巴细胞中提取总RNA并反转录成的cDNA，扩增产物的长度分别为578bp和95bp。采用本发明标志物检测哮喘组儿童外周血淋巴细胞中TRPV2基因表达水平，与检测总IgE相比，其敏感性更高。
文档编号C12Q1/68GK102154494SQ20111006051
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月14日 优先权日2011年3月14日
发明者付文亮, 徐东刚, 徐东群, 朱泽轶, 蔡欣, 邹民吉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所