专利名称：具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株及其在纤维素乙醇发酵中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株，具体涉及该菌株在乙醇发酵、特别是纤维素乙醇发酵中的应用。
背景技术：
当前，由于石油、天然气和煤炭等化石能源用量的急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化发展和加快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点。以燃料乙醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成为我国能源政策的重要方向。近年来，以淀粉质或糖质为原料生产燃料乙醇发展迅速，一定程度缓解了能源紧缺，但却引发了粮食安全问题。木质纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可发酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解石油资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和可持续发展等方面具有积极作用。酿酒酵母是以糖质和淀粉质为原料的乙醇发酵最经典的优势菌株，利用酿酒酵母发酵纤维素水解物生产乙醇可以很好地与以甘蔗糖和淀粉为底物的乙醇发酵工艺整合，降低纤维素乙醇的生产成本。但酿酒酵母应用于发酵木质纤维素水解物生产乙醇方面还存在一些亟待解决的问题，目前利用纤维素酶降解木质纤维素为可发酵糖的过程通常是在比较高的温度下(50°C左右)进行的，而目前使用的酵母菌在30°C才有比较好的发酵活性，高温条件下酵母细胞没有活性，甚至死亡，因此需要一定时间的冷却，才能进行酵母菌的发酵； 木质纤维素降解为可发酵糖的过程中，以及微生物发酵过程中均会产生许多抑制微生物生长和发酵的物质，如乙酸、乙醇、糠醛等，酿酒酵母不能利用纤维素水解液中的五碳糖，严重影响细胞活性和乙醇产率。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株及其在纤维素乙醇发酵中的应用。本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为1^43，是将酵母菌株 R8-10-2进行离子束诱变、原生质体融合及基因组改组得到的，已于2011年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No. 4642。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) T43 CGMCC No. 4642 简称酿酒酵母 T43。本发明提供的酿酒酵母T43 最高生长温度为44°C，具有比较宽的温度适应范围， 在30-40°C有较高的乙醇产率；具有良好的抑制物耐受性，在40°C时能够耐受0.4% (体积百分比)乙酸、0.2% (质量百分含量)糠醛和14%乙醇(体积百分比)。本发明提供的酿酒酵母T43可用于酒精发酵。在40°C、培养基含0. 5% (体积百分比)乙酸条件下，用酿酒酵母T43发酵200g/L葡萄糖，糖利用率为95. 2%，乙醇产量为 85. 8g/L，糖醇转化率为96. 2 %。用酿酒酵母T43在40°C发酵玉米秸秆水解液，消耗106. 2g/ L葡萄糖，产生47. 9g/L乙醇，糖醇转化率为96. 4%。酿酒酵母T43的发酵培养基也属于本发明的保护范围；每升所述发酵所用的培养基可包括如下物质5-10g酵母粉，2-6g尿素，0. 5-lg磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g 氯化钙，总还原糖含量为100-200g(其中葡萄糖含量为80-160g)的玉米秸秆水解液。每升所述发酵培养基(PH自然)具体可由如下物质组成5g酵母粉，5g尿素，Ig磷酸二氢钾， 1.5g七水硫酸镁，0.5g氯化钙，总还原糖含量为140g(其中葡萄糖含量为IlOg)的玉米秸秆水解液，其余为水。本发明还保护一种制备酿酒酵母T43的种子液的方法，包括如下步骤(1)将酿酒酵母T4328-37°C振荡培养14_20小时，得到液体菌种；(2)将所述液体菌种转接后振荡培养14-20小时，得到一级种子培养液；(3)将所述一级种子培养液转接后28-37°C搅拌培养14_20小时，溶氧控制在 3-%ig/L，得到种子液。所述步骤O)中，所述液体菌种可转接入如下培养基(pH自然)每升由如下组分组成5g酵母粉，IOg蛋白胨，5g尿素，Ig磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙，总还原糖含量为50g的玉米秸秆水解液(其中葡萄糖含量为39. 3g)，其余为水。所述步骤(3)中，所述一级种子培养液可转接入如下培养基(pH自然)每升由如下组分组成5g酵母粉，IOg蛋白胨，5g尿素，Ig磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙，总还原糖含量为75g的玉米秸秆水解液(其中葡萄糖含量为58. 9g)，其余为水。所述方法得到的种子液也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种生产乙醇的方法，是发酵酿酒酵母T43得到乙醇。所述发酵的条件可为30-40°C、20-36小时，溶氧为0. 2-0. 5mg/L。所述发酵的条件优选为30-40°C、36小时，溶氧为0. 3mg/L0所述发酵的底物可为玉米秸秆水解液。所述方法中，具体可将所述种子液接种至所述发酵培养基进行所述发酵。实验证明在40°C条件下，酿酒酵母T43发酵总还原糖含量为140g(其中葡萄糖含量为IlOg)的玉米秸秆水解液36小时，每升发酵醪可以产生46. 7g的乙醇，葡萄糖利用率为95.7%，糖醇转化率为96 %。本发明利用新的基因组改组策略提高了酿酒酵母对多重胁迫的耐受性，获得了一株遗传稳定的酿酒酵母重组菌。本发明提供重组菌能够在40°C发酵纤维素水解液，实现水解液中葡萄糖向乙醇的高效转化，可直接应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中。本发明提供的重组菌能够适应较宽的发酵温度范围(30-40°C)，可以降低发酵过程中的冷却成本，对纤维素水解液中抑制物具有较高的耐受性，可以简化生产工艺，缩短发酵时间，具有很好的工业化应用前景。本发明有助于在较高温度下启动酵母菌发酵纤维素水解物产乙醇，最终实现纤维素乙醇生产中酵母发酵层面的低能耗、低消耗、低成本和乙醇高产率，产生巨大经济效益的同时，也带来良好的社会效益。
图1为实施例2中酿酒酵母T43的发酵结果；实心符号为发酵液中乙醇浓度(也称乙醇产量或乙醇含量)，空心符号为发酵液中葡萄糖含量(也称葡萄糖浓度)；( 和〇) 表示30°C，(■和□)表示37°C，(▲和Δ)表示40°C，( 和 )表示42°C。图2为实施例3中酿酒酵母T43的发酵结果；〇表示生物量，Δ表示发酵液中葡萄糖含量(也称葡萄糖浓度)，■表示发酵液中乙醇含量(也称乙醇产量)。图3为实施例4中酿酒酵母Τ43的发酵结果；Δ表示发酵液中总糖浓度(也称总糖含量)，▲表示发酵液中葡萄糖浓度(也称葡萄糖含量)，■表示发酵液中乙醇浓度(也称乙醇产量)。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。YPD培养基将20g蛋白胨，IOg酵母粉，20g葡萄糖用水定容至1升。乙醇发酵培养基EFM(自然pH) :6g酵母粉、IOg蛋白胨、5g尿素、Ig磷酸二氢钾、 1. 5g七水硫酸镁、0. 5g氯化钙和200g葡萄糖，溶于水，定容至1升。YEPD液体培养基(自然pH)将20g蛋白胨，IOg酵母粉，20g葡萄糖溶于水，定容至1升。玉米秸秆水解液的制备方法粗粉碎玉米秸秆(干物料)，在1. SMPa压力下汽爆 5分钟(每次处理5kg干物料)；汽爆处理后的物料加入水中，使干物料的质量百分含量为 30%，加入纤维素酶(山东泽生生物科技有限公司)，纤维素酶的加入量为20FPU/g干物料， 50°C酶解处理，获得玉米秸秆水解液。总还原糖含量的检测方法如下(1)溶液的配制1克二硝基水杨酸溶于20ml 2M氢氧化钠水溶液和50ml水中，再加入30克四水合酒石酸钾钠，加水定容至100ml，存放在避光密闭的容器中，即为DNS溶液。(2)标准曲线的绘制配制浓度在I-IOmM的葡萄糖水溶液(标准溶液)各Iml (每一浓度做三个平行)， 加入Iml DNS溶液，沸水浴IOmin后，各管加入蒸馏水細1，MOnm处测定吸光度，求OD540平均值，绘制吸光度相对于葡萄糖浓度的标准曲线，获得OD54tl和葡萄糖浓度(g/L)之间的函数关系式0D54Q = 1. 096 X葡萄糖浓度(g/L)(3)样品测定取Iml待测溶液(每个样品做三个重复)，加入Iml DNS溶液，沸水浴IOmin后，各管加入蒸馏水細1，540nm处测定吸光度，求OD54tl平均值，按上述函数公式得到待测溶液中的总还原糖含量(g/L)。葡萄糖含量的检测方法如下(1)标准曲线的绘制准确配制浓度分别为Omg/1 OOml、1 Omg/1 OOml、20mg/lOOml、30mg/100ml、40mg/100ml、50mg/100ml的葡萄糖标准溶液，用50mg/100ml的葡萄糖标准溶液对SBA-40C 型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行定标，分别测定不同浓度葡萄糖标准溶液的传感器检测值，绘制传感器检测值A相对于葡萄糖浓度的标准曲线，获得葡萄糖浓度CG(mg/100ml)和传感器检测值A之间的对应关系，即:CG(mg/100ml) = A/1. 0216。
(2)样品测定 取Iml待测溶液(每个样品做三个重复)，适当稀释，测定传感器检测值A，求平均值，按上述函数公式得到待测溶液中的葡萄糖糖含量(g/L)。葡萄糖利用率的计算公式为(Ctl-C1) +CtlX 100%，C0为代表发酵起始时刻发酵液中的葡萄糖糖含量，C1代表发酵结束时刻发酵液中的葡萄糖糖含量。糖醇转化率=实际生成的乙醇量+消耗利用的葡萄糖理论上应生成的乙醇量 X100%o1、酉良胃## (Saccharomyces cerevisiae)T43 白勺一、离子束诱变酿酒酵母菌株R8-10-2酿酒酵母R8-10-2已于2009年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC Ns. 3226(见专利CN101633896 ；200910091841. 7)。酿酒酵母R8-10-2 (CGMCC No. 3226)是一种能耐受高浓度乙酸的酵母菌株，该菌株在30°C能够抗0. 8%乙酸(体积百分比)，在37°C 能抗0. 6%乙酸(体积百分比)，40°C能抗0. 2%乙酸，最高生长温度为42°C。酿酒酵母R8-10-2在酵母菌完全培养基YPD中，30°C培养至对数中期(约16小时)，3000Xg离心5分钟收集细胞，用0. 2M磷酸缓冲液(pH6. 0)洗涤两次，加入缓冲液悬浮细胞，适当稀释使菌体浓度为IO5-IO6细胞/ml左右。取0. 2ml均勻涂布于无菌干燥平皿中，无菌风吹干或在紫外操作台自然晾干制成菌膜，进行N离子注入诱变(磁场电流1. 82A, 注入束流3-4 μ m,注入能量30kev)。二、耐热突变株的筛选步骤一诱变后的菌液涂布在YPD培养基平板上，43°C培养72小时，筛选耐热性提高的突变株，从中筛选出3株能在43°C生长且乙醇产量比较高的遗传稳定的突变株，作为基因组改组的亲株。三、耐酸突变株的筛选步骤一诱变后的菌液涂布在含0. 25%乙酸的YPD培养基平板上，40°C培养72小时，筛选乙酸耐受性提高的突变株，从中筛选出3株能在40°C抗0. 25%乙酸且乙醇产量比较高的遗传稳定的突变株，作为基因组改组的亲株。四、原生质体融合及融合菌株筛选制备乙酸抗性突变株和耐热突变株的原生质体，各菌株原生质体等量混合，在 PEG4000介导下进行融合，融合后菌液涂布在含0. 3%乙酸(体积百分比)的YPDS (含lmol/ 1山梨醇的YPD培养基)平板上，40°C培养72小时。分析平板上长出的单菌落的乙酸耐受性和热耐受性，测定乙酸和热耐受性提高的融合菌株的乙醇产量和遗传稳定性，获得5株最高生长温度为43°C、40°C能够耐受0. 3%乙酸、乙醇产量比较高的遗传稳定菌株。五、基因组重组分别提取上述5株酵母菌的总DNA，不同菌株来源的总DNA等量混合，加入1 %(体积百分含量)的DES (硫酸二乙酯)，37°C温育lh，然后通过电击转化的方法(Bio-Rad Gene-Pulser, 1. 5kV，50 μ F，200 Ω，3mSec)将上述DNA转化到乙醇产量最高的菌株细胞中， 使不同菌株的基因组DNA之间发生重组，转化菌液涂布在含0.35%乙酸(体积百分比)的 YPDS平板上，40°C培养筛选重组菌株，共获得56个能够在40°C、0. 35%乙酸(体积百分比) 条件下生长的重组菌。分析上述菌株的耐热性和乙酸耐受性，从中获得16个能够在40°C耐受0. 4%乙酸、最高生长温度为44°C的酵母菌株。对16个菌株的热、乙酸、糠醛、乙醇、高渗等胁迫耐受性和乙醇产量进行分析，获得两株具有多重胁迫抗性和乙醇产量高的重组酵母菌。(Saccharomyces cerevisiae)T43通过遗传稳定性分析和乙醇发酵实验筛选得到遗传稳定、具有多重胁迫抗性、乙醇产量最高的酿酒酵母，将其命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) T43，简称酿酒酵母！"43。七、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)T43的形态和生理生化特征酿酒酵母T43具有典型的酿酒酵母形态特征细胞为椭圆形，多边芽殖；菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。菌株T43具有典型的酿酒酵母生理生化特征，能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖，缓慢发酵棉子糖；不能发酵半乳糖、乳糖、纤维二糖、蜜二糖和淀粉等。酿酒酵母T43具有比较宽的温度适应范围，最高生长温度为44°C，在30_40°C均具有较高的乙醇产率。酿酒酵母T43具有良好的抑制物耐受性，在40°C时能够耐受0.4% (体积百分比)乙酸、0.2% (质量百分含量)糠醛和14%乙醇(体积百分比)。(Saccharomyces cerevisiae)T43 ^1 2011年3月9日将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)T43保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 4642。酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) T43 CGMCC No. 4642 简称酿酒酵母 T43。实施例2、酿酒酵母T43和酿酒酵母R8-10-2在不同温度下的发酵能力比较将酿酒酵母T43和酿酒酵母R8-10-2同时进行如下实验(摇床的旋转半径均为25 毫米)一、制备种子液酿酒酵母(T43或R8-10-2)接种于YPD培养基，30°C摇床培养QOOrpm) 18小时， 按10% (体积百分比)的接种量转接于50ml YPD培养基中，30°C摇床QOOrpm)培养20小时，得到的菌液即为种子液(0D600值约为6. 0)。二、发酵产乙醇将步骤一得到的种子液按10% (体积百分比)的接种量接于装有100ml乙醇发酵培养基EFM的250ml的摇瓶中，分别在不同温度(30°C、37°C、40°C或42°C )下摇床培养 (150rpm)6小时，然后密闭瓶口，在相应的温度下摇床培养(IOOrpm)进行微氧发酵，不同时间(从本步骤最初的摇床培养开始计时)取发酵液进行分析。进行三次重复试验，每次接种3个摇瓶，结果取平均值。三、发酵效果测定取5ml步骤二的发酵液，3000 Xg离心5分钟，分别收集细胞沉淀和上清液；细胞沉淀进行步骤1的生物量测定；上清液分别进行步骤2的乙醇含量测定和步骤3的残糖量测定。1、发酵液中细胞生物量的测定细胞沉淀用蒸馏水洗一次后称重获得细胞湿重，然后在65°C干燥至恒重称重获得细胞干重，生物量的计量单位为每升发酵液中的细胞干重(g/L)。结果见表1。表1细胞生物量的测定结果
权利要求
1.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) T43，其保藏编号为 CGMCC No. 4642。
2.权利要求1所述酿酒酵母在酒精发酵中的应用。
3.权利要求1所述酿酒酵母的发酵培养基，每升包括如下物质5-10g酵母粉，2-6g尿素，0. 5-lg磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙、总还原糖含量为100-200g的玉米秸秆水解液。
4.如权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于每升所述发酵培养基由如下物质组成5g酵母粉，5g尿素，Ig磷酸二氢钾，1. 5g七水硫酸镁，0. 5g氯化钙，总还原糖含量为 140g的玉米秸秆水解液，其余为水。
5.一种制备权利要求1所述酿酒酵母的种子液的方法，包括如下步骤(1)将权利要求1所述酿酒酵母振荡培养14-20小时，得到液体菌种；(2)将所述液体菌种转接后振荡培养14-20小时，得到一级种子培养液；(3)将所述一级种子培养液转接后搅拌培养14-20小时，溶氧控制在3-%ig/L， 得到种子液。
6.权利要求5所述方法制备得到的种子液。
7.—种生产乙醇的方法，是发酵权利要求1所述酿酒酵母得到乙醇。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵的条件为30-40°C、20-36小时， 溶氧为 0. 2-0. 5mg/L。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述发酵的底物为玉米秸秆水解液。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中是将权利要求6所述种子液接种至权利要求3或4所述发酵培养基中进行所述发酵。
全文摘要
本发明公开了一种具有多重胁迫抗性的酿酒酵母菌株及其在纤维素乙醇发酵中的应用。本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)T43 CGMCC No.4642。酿酒酵母T43具有广泛的温度适应性(可降低发酵过程中的冷却和加热成本)，对纤维素水解液中的抑制物有较高的耐受性(可简化生产工艺，缩短发酵时间)，具有很好的工业化应用前景，可实现玉米秸秆水解液中葡萄糖向乙醇的高效转化，直接应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中。本发明有助于在较高温度下启动酵母菌发酵纤维素水解物产乙醇，最终实现纤维素乙醇生产中酵母发酵层面的低能耗、低消耗、低成本和乙醇高产率，产生巨大经济效益的同时，也带来良好的社会效益。
文档编号C12R1/865GK102199554SQ201110060479
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月14日 优先权日2011年3月14日
发明者何秀萍, 卢莹, 张博润, 程艳飞, 郭雪娜 申请人:中国科学院微生物研究所