专利名称：一种抗幽门螺杆菌感染的植物乳杆菌及其用途的制作方法
一种抗幽门螺杆菌感染的植物乳杆菌及其用途
技术领域：
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种能够干预幽门螺杆菌感染的植物乳杆菌，还涉及所述植物乳杆菌的用途。
背景技术：
幽门螺杆菌OLpylori)作为慢性胃炎、消化性溃疡，甚至胃癌的主要致病因素， 一直困扰着全世界。幽门螺杆菌作为胃中的原籍菌，能够在强酸性的条件下生存并定殖下来，它主要有两个特性，第一个特性是幽门螺杆菌在代谢过程中能够产生大量的尿素酶，而尿素酶可以将尿素分解产生氨，因此，在幽门螺杆菌周围形成“氨云”的微环境，从而能够上调PH，使其免受强酸的侵蚀。第二个特性是幽门螺杆菌有鞭毛可以游动，因而游到粘膜层， 并且粘附到胃上皮细胞中，从而定殖下来。定殖后的幽门螺杆菌就会分泌毒素，造成机体的损伤、病变，引起疾病。虽然随着三联疗法，即PPI (质子泵抑制剂)加两种抗生素治疗法的应用，幽门螺杆菌治愈率得到很大的提高，但是仍然存在幽门螺杆菌感染复发率高，分布广，危害性极大，药物治疗费用高，并且幽门螺杆菌耐药率的增加、长期不合理应用抗生素可引起胃肠功能紊乱及胃肠道菌群失调等不良反应的问题。微生态疗法恰是以一个崭新的手段解决了传统疗法存在的多种问题。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵乳制品、发酵植物食品如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中。乳杆菌是食品工业上的常用菌种，与人类关系密切。乳杆菌具有耐酸性，定殖胃肠道的能力，并且乳杆菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇水平，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应激反应等产生有益的影响。因此探索利用乳杆菌作为食疗性食品预防幽门螺杆菌感染具有重大的意义。国内外学者对乳杆菌干预幽门螺杆菌感染进行大量的临床研究，研究结果表明益生菌具有抗感染，调节机体免疫机能，平衡胃肠道正常菌群，降低抗生素副作用等多种功能。CN 1796M0A公开了一种具有抗肠道致病菌和抗氧化特性的双歧杆菌及其用途，用于制备食品组合物或药物组合物，杀死或抑制幽门螺杆菌或大肠杆菌，治疗由其引起的各种疾病。CN 1982437A公开了一种新颖的耐酸耐胆盐、抗肠道致病菌和抗氧化能力鼠李糖乳杆菌株及其代谢产物与用途，用于制备抑制幽门螺杆菌、大肠杆菌或其它肠道致病菌的食品或药品。但是，这些文献没有筛选抗幽门螺杆菌的乳杆菌的有效方法。因此，需要筛选一种抗幽门螺杆菌的乳杆菌，并且证明它们在体内外都具有良好的抗幽门螺杆菌的效果，同时研制这些乳杆菌实际的用途。
发明内容[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种抗幽门螺杆菌感染的植物乳杆菌。本发明的另一个目的是提供所述的抗幽门螺杆菌感染的植物乳杆菌在制备药物组合物、发酵剂、动物饲料添加剂和保健品中的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CN2018。所述的植物乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC No.似86。所述的植物乳杆菌具有下述特性(1)在pH 2. 5环境下生长良好；(2)体外抑制幽门螺杆菌生长，降低其尿素酶活性；(3)体外抑制幽门螺杆菌粘附在胃上皮细胞上；(4)体内预防或减轻幽门螺杆菌感染。本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途，其特征在于它用于制备抑制幽门螺杆菌的药物组合物。根据本发明的一种优选实施方式，所述的组合物是由所述的植物乳杆菌CN2018 与在药学上可接受的载体组成的。根据本发明的一种优选实施方式，所述的组合物是胶囊、片剂、丸剂或口服液。根据本发明的一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌CN2018用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂。根据本发明的一种优选实施方式，所述植物乳杆菌CN2018用于生产动物饲料的添加剂。根据本发明的一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌的用途，其特征在于所述的植物乳杆菌CN2018发酵液与益生元组合发酵制成液体、散剂、片剂或胶囊。下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CN2018。所述的植物乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC No.似86。本发明的目的是解决上述问题。本发明人设立了下述标准筛选所需要的乳杆菌。 更具体地，本发明人通过大量实验从传统食品和人肠道及粪便中筛选出一种具有下述性质的乳杆菌，即本发明的植物乳杆菌CN2018 1、具有耐酸性，在低pH下可以生长；2、混合物培养时对幽门螺杆菌(以H. pylori SSl为例)生长和尿素酶活性有抑制作用；3、对幽门螺杆菌粘附人胃上皮细胞SGC7901有抑制作用；4、对未感染幽门螺杆菌的小鼠具有预防或减轻幽门螺杆菌感染的作用。下面将对这些性质进行详细描述。1、具有耐酸性，在低pH下可以生长将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CN2018分别接种于MRS培养基(例如青岛海博
4的产品)中，在温度37°C下培养Mh，再经MRS培养液传代培养2 3次后，取ImL植物乳杆菌CN2018培养液，接种于19mL pH3. 0的MRS液体培养基，在温度37°C下培养Mh，测定初始和培养结束后的0D600值。0D600值是在600nm波长处的吸光值，利用这个值来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌体细胞密度。选择在上述条件下生长良好的菌株进行下一步实验。采用同样培养方式，取1. OmL 用PBS (磷酸盐缓冲液)清洗两次后，并用PBS重悬的乳杆菌菌体，与9. OmL pH 2. 5的人工胃液混合后，在温度37°C下进行培养，分别在开始(Oh)和池后，取样用MRS琼脂培养基倾注培养，测定活菌数并计算其存活率(存活率用对数比值换算，％)。筛选出存活率在80% 以上的菌株进行下步研究。2、混合物培养时对H. pylori SSl生长和尿素酶活性有抑制作用用琼脂扩散法检测乳杆菌的MRS 18h混合培养物抑制H. pylori SSl生长情况，本发明植物乳杆菌CN2018能够很强抑制H. pylori SSl生长。所述植物乳杆菌CN2018的上清液可以明显抑制H. pylori SSl的尿素酶活性。3、对H. pylori SSl幽门螺杆菌粘附人胃上皮细胞SGC7901有高抑制作用本发明植物乳杆菌CN2018的上清液和活菌体可以通过竞争、替代和排阻三种方式降低H. pylori SSl粘附人胃上皮细胞SGC7901的粘附力。4、对未感染H. pylori SSl的小鼠具有预防或是减轻H. pylori SSl感染的作用通过先灌胃本发明植物乳杆菌CN2018十天，再灌胃H. pylori SSl感染小鼠，一周五次，最后再灌胃本发明植物乳杆菌CN2018三个月，对照组为灌生理盐水十天，接着灌胃 H. pylori SS1，从感染小鼠的模型比较发现，通过本发明植物乳杆菌CN2018预防的小鼠炎症较轻，并且胃组织的尿素酶活力和血清中的抗H. pylori SSl的Ig-G抗体降低。本发明植物乳杆菌CN2018的其它生物学特性对植物乳杆菌CN2018的生长特性的研究结果显示该菌株的最低生长温度为 20°C，最高生长温度为40°C，该菌株以30-37°C的生长温度为佳，最高和最低初始生长pH为 9. 0和3. 0，最适生长初始pH为6. 0 ；本发明植物乳杆菌CN2018菌株的延迟期相对较短，4h 左右开始进入对数生长期，12h就达到稳定期。本发明植物乳杆菌的培养方法与培养条件所述植物乳杆菌CN2018原始菌种在温度_75°C下以30重量％甘油悬液形式保存， 或者在温度4°C下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。培养时，本发明植物乳杆菌CN2018可以在MRS培养基中在兼性厌氧条件、于温度37°C下培养18-3 即可使用。本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途，其特征在于它用于制备抑制幽门螺杆菌的药物组合物。根据本发明的一种优选实施方式，所述的组合物是由所述的植物乳杆菌剂与在药学上可接受的载体或赋形剂组成的。所述的植物乳杆菌剂是将含有所述的植物乳杆菌CN2018的菌液通过冻干处理所得到的冻干粉剂，或采用其它方法处理得到的粉剂。得到的粉剂可以与在药学上可接受的载体或赋形剂组合制成各种剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体或赋形剂可以根据不同剂型进行选择，所使用的这些载体或赋形剂对于制药技术领域的普通技术人员都是容易确定的，也是显而易见的。
根据本发明，在药学上可接受的载体应该是指在药学领域中的常规药物载体，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解齐U、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或矫味剂的载体，例如填充剂如淀粉、蔗糖、 乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠； 吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土 ；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇；其它辅剂如香味剂、甜味剂等。根据本发明的一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂。根据本发明，所述的发酵剂应该理解是含有用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的本发明植物乳杆菌CN2018的活体培养物。在本发明中，所述的乳制品例如是牛奶、酸奶油和干酪等。所述的豆制品例如是豆腐乳、豆豉、豆酱和酱油等。所述的果蔬制品例如是黄瓜、红萝卜、甜菜、芹菜和圆白菜等。通常，把所述的发酵剂接种到待处理的原料中，通常使本发明植物乳杆菌CN2018浓度达到106CFU/mL以上，在一定条件下让所述植物乳杆菌 CN2018繁殖，其代谢产物使发酵制品具有一定的酸度、香味等优异特性，同时使产品增加了保藏时间，改善了营养价值和消化性。根据本发明的一种优选实施方式，所述植物乳杆菌用于制备生产动物饲料的添加剂。根据本发明的一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌的用途，其特征在于所述的植物乳杆菌CN2018发酵液与益生元组合发酵制成液体、散剂、片剂或胶囊剂。根据本发明， 所述的益生元应该理解为通过选择性的刺激一种或少数种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响从而改善寄主健康的不可被消化的食品成分，例如低聚果糖、大豆低聚糖等。添加益生元可以给肠道益生菌补充“食物”，激活与增殖人体内的益生菌群，以达到促进微生态平衡，改善健康的目的。人们知道，在人体结肠中有约100万亿个、400至 500种细菌，这些细菌可分为三类有害菌、条件致病菌和益生菌。在益生菌中，以双歧杆菌和乳杆菌为代表，它们作为微生态调节剂，具有促进人体对营养物质的吸收，提高免疫力， 预防和治疗便秘及腹泻，降低血脂，抑制肠道病源和腐败微生物的生长，分解致癌物质等作用，而益生元则通过调节体内微生态环境，强化肠道益生菌的功能。[有益效果]本发明的植物乳杆菌CN2018具有耐酸性，对幽门螺杆菌生长和尿素酶活性有抑制作用，对幽门螺杆菌粘附人胃上皮细胞SGC7901有高抑制作用，对未感染幽门螺杆菌的小鼠具有预防或是减轻感染的作用。所述植物乳杆菌CN2018可以用于制备抑制幽门螺杆菌的药物组合物；制备生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂；制备生产动物饲料的添加剂；所述的植物乳杆菌CN2018发酵液与益生元组合发酵制成液体、散剂、片剂或胶囊剂。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2010年11月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 428
图1是主成分分析载荷因子图；图2是主成分分析因子评分图；图3是抗幽门螺杆菌的乳杆菌成分分析图；图4是本发明植物乳杆菌CN2018抑制H. pylori SSl粘附在胃上皮细胞上的作用方式分析图；图5是小鼠胃组织切片HE染色图，其中A :H. pylori SSl 感染组B :CN2018 干预组
具体实施方式实施例1 利用主成分分析筛选拮抗H. pylori SSl的乳杆菌从238株乳杆菌中筛选得到16株乳杆菌，它们在低pH条件下生长良好，能够耐受酸性人工胃液，对这16株乳杆菌进行了耐酸性试验研究。通过耐酸性试验、抑制幽门螺杆菌(以H. pylori SSl为例)生长试验、尿素酶活性检测、乳杆菌的自凝集和疏水性作用以及乳杆菌和H. pylori SSl的共凝集作用试验，利用主成分分析和筛查了这些乳杆菌拮抗 H. pylori SSl 的能力。这些试验结果表明，因子载荷图(图1)主要分成4个成分。第一个成分占 28. 87%，抑菌力起主要贡献；第二个成分占14. 17%，共凝集和疏水性起主要作用；第三个成分占19. 40%，尿素酶活力和自凝集起主要作用；第四个成分占14. M%，耐酸性起主要作用。以第一个成分和第二个成分作因子评分图(图2)，从图中可以看出第一个成分中， L. ρlantarum CN2018>L. ρlantarum DJ102-1>L. plantarum S3 禾口 L. ρlantarum ZS211-2 ^3 主要作用；第二个成分中主要是LGG、L. caise Siang和L. gesseri Chen起主要作用。通过综合考虑，筛查得到L. plantarum CH2018可能潜在具有拮抗H. pyioriSSl的能力。实施例2 植物乳杆菌CN2018对其他幽门螺杆菌菌株的拮抗能力分析哥伦比亚培养基(Oxiod，UK)倾注平板(每平板15mL，平板为标准平板9mm)，把 H. pylori 43504,H. pylori 11637,H. pylori 26695 和 H. pylori C0707 涂布到平板上(浓度为1 X IO8CFU/平板)，立即放入4个牛津杯中，并向牛津杯中加入100 μ L乳杆菌发酵液， 在微需氧条件下固定Ih后，放入三气培养箱培养48-7池，测量抑菌环大小。以MRS作为阴性对照，实验重复3次，其试验结果列于表1中。表1抑制其他幽门螺杆菌生长分析
权利要求
1.一种植物乳杆菌，其特征在于所述的植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum) CN2018于2010年11月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 4286。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于它具有下述特性(1)在pH2. 5环境下生长良好；(2)抑制幽门螺杆菌生长，降低其尿素酶活性；(3)抑制幽门螺杆菌粘附在胃上皮细胞上；(4)预防或减轻幽门螺杆菌感染。
3.根据权利要求1所述植物乳杆菌的用途，其特征在于它用于制备抑制幽门螺杆菌的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的组合物是由根据权利要求1所述的植物乳杆菌与在医用上可接受的载体组成的。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
6.根据权利要求1所述植物乳杆菌的用途，其特征在于它用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂。
7.根据权利要求1所述植物乳杆菌的用途，其特征在于它用于生产动物饲料的添加剂。
8.根据权利要求1所述植物乳杆菌的用途，其特征在于所述的植物乳杆菌CN2018发酵液与益生元组合发酵制成液体、散剂、片剂或胶囊。
全文摘要
本发明涉及一种乳杆菌CN2018，CGMCC No.4286及其用途。该乳杆菌CN2018具有耐酸性，对幽门螺杆菌(以H.pylori SS1为例)生长和尿素酶活性有抑制作用，对幽门螺杆菌粘附人胃上皮细胞SGC7901有较强的抑制作用，对小鼠感染幽门螺杆菌具有预防或减轻感染程度的作用。
文档编号A23C9/12GK102174450SQ20111005982
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者刘小鸣, 张灏, 张秋香, 田丰伟, 赵建新, 陈卫, 陈晓华 申请人:江南大学