专利名称：鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPK1-a的分子标记方法和引物的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术工程技术领域，用于含ΙΡΚΙ-a突变基因的低植酸大豆品种的鉴定和选育，尤其涉及一种鉴别大豆低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法和引物。
背景技术：
植酸在植物中约占总磷的50% -80% ；在大豆等作物种子中植酸通常占到种子全磷量的75%以上。种子中的植酸通常与K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等金属离子螯合，与蛋白结合聚积为球状体沉积在双子叶植物种子的子叶中，因此，植酸盐是金属阳离子和磷元素的储藏库。尽管在大豆等农作物中植酸有着许多重要的生理功能，但由于人类和非反刍动物的消化道中植酸酶的活性极低，几乎为零，因此植酸不能被其所消化利用，这显著降低了植酸所结合的磷、金属元素和蛋白的生物有效性；据报道，全球有近一半的人口存在形式不同、程度不同的微量元素缺乏症，特别在发展中国家90%的孕妇和学龄前儿童患有铁缺乏引起的贫血症或相关疾病，而植酸是造成微量元素缺乏的主要物质之一。种子中的植酸盐不能被非反刍动物利用，随动物粪便排泄到环境中，动物粪便中的植酸盐难以被植物再利用，造成磷元素的浪费和污染；为了满足动物磷素营养的需求，饲料工业中往往采用添加无机磷或植酸酶的方法。饲料中添加无机磷不仅增加了饲料的成本，而且不能解决动物排泄造成的磷污染问题，也造成了磷素元素的过度利用；添加植酸酶可以降低粪便中的磷的排泄，但在饲料制粒过程中容易失活。因此降低作物种子中植酸的含量，是最为经济、有效的方法，它可以有效改善金属元素、蛋白和磷在人和动物营养中的生物有效性；减少由此带来的水环境的富营养化；降低饲料生产成本；节约磷矿资源。以往的遗传研究表明低植酸突变体的低植酸含量一般是由单隐性基因控制。不同的突变基因不仅不等位，而且对植酸含量的降低程度也不尽相同。进一步研究表明，改变控制植酸合成代谢途径各种蛋白酶的功能和活性，可以显著改变种子中植酸磷和非植酸磷的含量，如以在不同作物中克隆的MIPS、IPKU MIK和MRP等。1，3，4，5，6肌醇-2磷酸激酶 (IRQ)蛋白催化植酸合成代谢的最后一步反应，肌醇五磷酸经磷酸化合成肌醇六磷酸的反应。发育植物中IPKl激酶活性的降低或功能的改变将中断植酸的合成，改变植物种子中植酸磷和非植酸磷的含量。IPKl的等位突变在玉米和拟南芥中均有报道，它的突变直接导致了这些植物籽粒中植酸含量的大幅度下降。在文献(Fengjie Yuan等，Theor Appl Genet (2007) 115:945 - 957)中公开的大豆低植酸突变体材料Gm-lpa-ZC-2，经进一步的精细定位和代谢组学研究表明，该突变体中的植酸含量降低是由IPKl的等位突变所导致(袁凤杰等，浙江农业学报，2011 (已录用文章)；Frank T等，J Agric Food Chem，2009)，其cDNA全序列如SEQIDN0:1所示。随着分子生物学的发展，基于核苷酸变异的分子标记在作物遗传改良中已产生了非常重要的作用，因此，若能获得与目的基因紧密连锁的分子标记，不仅能有效鉴定含有目的基因的低植酸作物种质资源，同时也能加速低植酸农作物品种的选育。
发明内容
为了有效快捷地鉴定大豆材料中是否含有IPKl-a基因，本发明的一个目的提供一种鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，该方法通过对标记位点的比较，可以鉴定大豆植株中有无IPKl-a基因，进而预测大豆籽粒中植酸的含量，加快低植酸含量大豆的选择进度。本发明的另外一个目的是鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，该方法包括以下的步
骤
(1)大豆品种开花20天后生长发育中的幼嫩种子获得总RNA；
(2)总RNA反转录获得总cDNA；
(3)用引物对总cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的正向引物序列为 CTTGGAGGACTGGGAGGT，反向引物序列为ATACCCCTTTGCATTCAGCT ；
(4)PCR产物在1.洲琼脂糖电泳胶上分离，PCR产物如果具有30!3bp的电泳条带，则为不含IPKl-a基因的大豆品种；如果有192bp的电泳条带，则为含有IPKl-a基因纯合体大豆；如果有两条电泳条带，则是含IPKl-a基因杂合体的大豆品种。作为优选，上述的总RNA的提取采用Ε. Ζ. N. Α. 植物RNA提取试剂盒。上述的总 RNA提取的具体方法为提取的总RNA样品10 μ 1，10Xbuffer (含Mg2+) 2 μ 1，DNasel酶 2. 5 μ 1，DEPC水5. 5 μ 1，总反应体系20 μ 1 ；反应条件首先37°C保温30分钟，接下来65°C 酶灭活10分钟，最后加入2 μ 1的EDTA终止反应；去除DNA的RNA样品利用分光光度计测定浓度，最终将所有样品浓度调节一致，为200ng/μ 1。作为优选，上述的RNA的反转录采用ReverTra Ace qPCR RT Kit FSQlOl试剂盒。 上述的RNA的反转录的具体方法为RNA样品在65°C条件下5分钟后，立即放于冰上冷却； 20μ 1反应体系为5XRT Buffer 4 μ 1，酶混合液1 μ 1，随机引物1 μ 1，RNA样品10 μ 1， DEPC水4μ 1 ；反应条件为37°C条件下进行15分钟的逆转录反应，在98°C条件下进行5分钟的酶失活反应。作为优选，上述的总cDNA进行PCR扩增的具体方法为反应体系为20 μ 1，其中 10 X buffer (含Mg2+) 2 μ 1，dNTP混合液0. 4 μ 1，正反向引物分别为0. 6 μ 1，cDNA样品 1.5 μ 1，Taqplus 酶 0. 2 μ 1，ddH2014. 7 μ 1 ；PCR 程序为94°C变性 5 分钟，进入 35 个循环， 每个循环包括94°C变性1分钟，50°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，循环结束72°C延伸10 分钟，4°C保存。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案
鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法用引物，其正向引物序列为CTTGGAGGACTGGGAGGT，反向引物序列为ATACCCCTTTGCATTCAGCT。本发明利用分子生物学的方法获得一个与大豆低植酸含量突变基因IPKl-a直接相关的PCR标记，该标记的优点如下1、对低植酸大豆的有效利用，首先必须建立在明确基因来源的基础上。由于目前已发现的低植酸突变基因较多，且突变体之间外观差异甚微，很难通过表型观察进行有效的区分，利用本发明所获得的PCR标记可以对大豆低植酸资源进行筛选，准确鉴定出低植酸突变体是否含有IPKl-a基因。2、本发明所获得的PCR标记是依据IPKl基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。 3、低植酸突变性状的观察必须等待种子收获以后才能进行，而利用与IPKl-a直接相关的分子标记及进行检测，可以在苗期判断其低植酸基因型，为有效选育低植酸大豆品种提供依据。4、用本发明方法进行分子标记辅助选择育种，提高了大豆品种的选择效率。
图1为突变种质Gm-lpa-ZC-2与浙春3号、Willams大豆品种中IPKl基因部分 cDNA序列比对图。其中Gm-lpa-ZC-2种质中等位突变IPKl-a基因的cDNA序列缺失1 IObp。图2为PCR分子标记对浙春3号和Gm-lpa-ZC-2种质中IPKl基因的cDNA序列扩
增结果。图3为分子标记对Gm-lpa-ZC-2 X浙鲜豆4号F2代单株的选择效果，1-5泳道为 IPKl突变基因纯合型的低植酸单株；7-11泳道为不含有IPKl突变基因的非低植酸单株。
具体实施例方式遗传性分析、分子定位和代谢组学分析表明，大豆低植酸突变体Gm-lpa-ZC-2低植酸含量由 IPKl 等位突变基因 IPKl-a控制(Fengjie Yuan 等，Theor Appl Genet, 2007 ； Frank T等，J Agric Food Chem，2009)。根据大豆全基因组序列信息设计引物，并对PCR产物直接测序，获得低植酸突变体大豆低植酸突变体材料Gm-lpa-ZC-2中约^OObp的IPKl-a 全基因组序列。如图1所示，Clustal X软件分析突变材料与浙春3号和Willams之间 IPKl基因全DNA序列的差异，发现突变材料IPKl序列的DNA序列在第五个外显子与内含子的剪切序列发生了一个G/A突变，该突变使真核生物中普遍存在的剪切保守序列GT/AC 序列改变为AT/AC，致使该基因在转录过程中的RNA剪切酶无法识别，最终导致剪切异常。 Clustal X软件比较突变植株与浙春3号的cDNA序列，结果发现，突变植株的cDNA序列缺失了第五个外显子的IlObp的全序列。本发明设计了能扩增包括第五个外显子缺失序列的cDNA序列引物。该系列其正向引物序列为CTTGGAGGACTGGGAGGT，反向引物序列为 ATACCCCTTTGCATTCAGCT。本发明采用上述的cDNA序列引物提供了一种鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，该方法包括以下的步骤。(1) 基因组RNA的提取
总RNA来自于开花20天后生长发育中的幼嫩种子。总DNA的提取用Ε. Ζ. N. Α. 植物 RNA提取试剂盒(Omega Bio-tek, Inc. USA)，操作方法按说明书所示；提取的RNA用DNasel 处理，具体方法为提取的总RNA样品10 μ 1，10Xbuffer (含Mg2+》μ 1，DNasel酶2. 5 μ 1， DEPC水5.5 μ 1，总反应体系20 μ 1 ；反应条件首先37°C保温30分钟，接下来65°C酶灭活10 分钟，最后加入2 μ 1的EDTA终止反应。去除DNA的RNA样品利用分光光度计测定浓度，最终将所有样品浓度调节一致，为200ng/μ 1。(2) 总 cDNA 的获得
RNA 的反转录应用 ReverTra Ace qPCR RT Kit FSQlOl 试剂盒(T0Y0B0 CO. , LTD JAPAN)。具体为RNA样品在65°C条件下5分钟后，立即放于冰上冷却。20 μ 1反应体系为5 X RT Buffer 4 μ 1，酶混合液 1 μ 1，随机引物 1 μ 1，RNA 样品 10 μ 1，DEPC /K 4 μ 1。反应条件为37°C条件下进行15分钟的逆转录反应，在98°C条件下进行5分钟的酶失活反应。(3) 用所述引物对大豆总cDNA进行PCR扩增
反应体系为20 μ 1，其中IOXbuffer (含Mg2+) 2 μ 1，dNTP混合液0. 4 μ 1，正反向引物分别为 0. 6 μ 1，cDNA 样品 1. 5 μ 1，Taqplus 酶 0. 2 μ 1，ddH2014. 7 μ 1。PCR 程序为94°C变性5分钟，进入35个循环，每个循环包括94°C变性1分钟，50°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，循环结束72°C延伸10分钟，4°C保存。PCR产物在1. 琼脂糖电泳胶上分离。如图2 所示，PCR产物电泳检测显示IPKl-a基因纯合体的大豆材料为Gm-lpa-ZC-2、浙97031及其上述材料的杂交后代，具有192bp的一条电泳条带；浙春3号(1998年审定)和浙鲜豆4号 (2007年审定)不含有IPKl-a基因，具有一条大小为30!3bp的电泳条带。(4) 分子标记对基因型为IPKl-a的大豆杂交后代的选择效果
如图3所示，以IPKl-a基因纯合型材料Gm-lpa-ZC-2和不含IPKl-a的大豆品种浙鲜豆4号为亲本进行杂交。杂交大豆Fl代混收；F2代单株于苗期利用PCR标记进行IPKl-a 基因型的检测，将F2材料分为三种类型具有192bp电泳条带材料、303bp电泳条带材料和二者兼具的材料；收获F2植株上的F2 3种子，利用HPLC技术检测每个单株的植酸含量，发现所有具有192bp电泳条带材料均为低植酸含量，而30;3bp电泳条带材料和二者兼具的材料为植酸含量正常。继续种质兼具192bp和30!3bp电泳条带的F2:3种子，在后代中继续用分子标记进行选择，用化学分析法进行验证，发现具有192bp电泳条带材料均为低植酸含量，303bp电泳条带材料和二者兼具的材料为植酸含量正常。由于低植酸性状为隐性突变， 因此兼具192bp和30!3bp电泳条带的材料为IPKl-a的杂合基因型，但表现型为正常的植酸含量。所开发标记对低植酸性状的选择效率为100%。
权利要求
1.鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，其特征在于该方法包括以下的步骤(1)大豆品种开花20天后生长发育中的幼嫩种子获得总RNA；(2)总RNA反转录获得总cDNA；(3)用引物对总cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的正向引物序列为 CTTGGAGGACTGGGAGGT，反向引物序列为ATACCCCTTTGCATTCAGCT ；(4)PCR产物在1. 2%琼脂糖电泳胶上分离，PCR产物如果具有30!3bp的电泳条带，则为不含IPKl-a基因的大豆品种；如果有192bp的电泳条带，则为含有IPKl_a基因纯合体大豆；如果有两条电泳条带，则是含IPKl-a基因杂合体的大豆品种。
2.根据权利要求1所述的鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，其特征在于总RNA的提取采用Ε. Ζ. N. Α. 植物RNA提取试剂盒。
3.根据权利要求2所述的鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl的分子标记方法，其特征在于总RNA提取的具体方法为提取的总RNA样品10 μ 1，IOXbuffer (含Mg2+) 2 μ 1，DNasel酶2. 5 μ 1，DEPC水5. 5 μ 1，总反应体系20 μ 1 ；反应条件首先37°C保温30分钟，接下来65°C酶灭活10分钟，最后加入2 μ 1的EDTA终止反应；去除DNA的RNA样品利用分光光度计测定浓度，最终将所有样品浓度调节一致，为200ng/μ 1。
4.根据权利要求1所述的鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，其特征在于RNA的反转录采用ReverTra Ace qPCR RT Kit FSQlOl试剂盒。
5.根据权利要求4所述的鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，其特征在于RNA的反转录的具体方法为RNA样品在65°C条件下5分钟后，立即放于冰上冷却；20 μ 1反应体系为5XRT Buffer 4 μ 1，酶混合液1 μ 1，随机引物1 μ 1，RNA样品 10μ 1，DEPC水4μ 1 ；反应条件为37°C条件下进行15分钟的逆转录反应，在98°C条件下进行5分钟的酶失活反应。
6.根据权利要求1所述的鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法，其特征在于总cDNA进行PCR扩增的具体方法为反应体系为20 μ 1，其中IOXbuffer (含 Mg2+) 2 μ 1，dNTP 混合液 0. 4 μ 1，正反向引物分别为 0. 6 μ 1，cDNA 样品 1. 5 μ 1，Taqplus 酶0. 2μ l，ddH2014. 7μ 1 ；PCR程序为:94°C变性5分钟，进入35个循环，每个循环包括94°C 变性1分钟，50°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，循环结束72°C延伸10分钟，4°C保存。
7.鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPKl-a的分子标记方法用引物，其特征在于 正向引物序列为CTTGGAGGACTGGGAGGT，反向引物序列为ATACCCCTTTGCATTCAGCT。
全文摘要
本发明属于农业生物技术工程技术领域，用于含IPK1-a突变基因的低植酸大豆品种的鉴定和选育，尤其涉及一种鉴别大豆低植酸含量突变基因IPK1-a的分子标记方法和引物。鉴别大豆籽粒中低植酸含量突变基因IPK1-a的分子标记方法，该方法包括以下的步骤(1)大豆品种开花20天后生长发育中的幼嫩种子获得总RNA；(2)总RNA反转录获得总cDNA；(3)用引物对总cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的正向引物序列为CTTGGAGGACTGGGAGGT，反向引物序列为ATACCCCTTTGCATTCAGCT；(4)PCR产物在1.2%琼脂糖电泳胶上分离，PCR产物如果具有303bp的电泳条带，则为不含IPK1-a基因的大豆品种；如果有192bp的电泳条带，则为含有IPK1-a基因纯合体大豆；如果有两条电泳条带，则是含IPK1-a基因杂合体的大豆品种。
文档编号C12Q1/68GK102154495SQ20111006059
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月14日 优先权日2011年3月14日
发明者付旭军, 朱丹华, 朱申龙, 李百权, 舒庆尧, 袁凤杰 申请人:浙江省农业科学院