专利名称：一种负载gm1和ngf双营养因子的神经组织修复支架的制备方法
技术领域：
本发明属于神经缺损修复用生物材料支架及其制备领域，特别涉及一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法。
背景技术：
周围神经损伤是临床常见疾患，临床上对于周围神经的离断伤，常采用显微外科技术进行端-端外膜缝合、束膜缝合或联合缝合，以恢复神经的连续性，对于周围神经的缺损，自体神经移植仍是目前修复的“黄金标准”。近年来，组织工程的兴起，为众多的组织缺损、器官功能衰竭病人的治疗带来了曙光。
利用生物材料构建的神经再生导管，可以为神经细胞获取营养、生长和代谢提供了一个有利的空间。然而神经再生是细胞、细胞外基质和神经营养因子相互作用的结果，单一的神经导管对受损神经的修复效果是有限的，因为周围神经再生不仅要恢复其结构，更重要的是恢复其感觉和运动功能，为了达到或超过自体神经移植的修复效果，近年来研究者们不断致力可控制的活性复合神经导管的制备。近年来有报道神经生长因子(Nervegrowth factor, NGF)可以对运动神经的再生起促进作用，本研究小组也于2008年报道了用同轴共纺技术将神经生长因子包埋在纳米纤维中，使之缓慢释放得到活性神经导管。但是单独的NGF对运动神经元的作用还是比较微弱的，且NGF的市售价格较高。因此，引入另一种对NGF具有协同介导作用的营养因子，开发一种成本更低且具有控释模型的活性神经导管具有多重意义。至目前为止，未见有基于同轴静电纺丝技术制备神经节苷脂GM1、神经生长因子、NGF双营养因子负载纳米纤维，并最终制备GMUNGF双营养因子负载的活性神经修复导管的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种GM1、NGF双营养因子负载的活性神经修复导管及其制备方法，纳米纤维支架由负载GMl、NGF双营养因子且具有取向结构的同轴静电纺纳米纤维所构成，GMU NGF双营养因子负载的纳米纤维中呈现“芯-壳”结构，两种营养因子在神经恢复的期间缓慢释放，诱导和加速受损神经的再生，而具有取向结构的纳米纤维为神经再生提供了正确方向，使神经轴突能够定向生长，加速了神经恢复速度；该发明制备装置简易、控制参数较少、操作简便、制备过程稳定，有望广泛应用于神经修复导管的制备过程。本发明的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，包括:(I)将GMl和NGF两种营养因子以质量比1:1共溶于超纯水中，完全溶解得到10-20微克每毫升的溶液；(2)将质量比为25:75的丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯共混物溶于六氟异丙醇，完全溶解搅拌均匀后得到质量体积百分比为8-10%的溶液；(3)将步骤(I)得到的溶液装入推进容器，在微量注射泵的驱动下进入同轴装置复合毛细喷头的内毛细喷丝口 ；将步骤(2)得到的溶液装入推进容器，在微量注射泵的驱动下进入同轴装置复合毛细喷头的内外毛细喷丝口之间的环状空隙处；(4)启动推进泵、电压和电机，开始形成取向接收的同轴静电纺纳米纤维，得到所述支架；(5)将上述支架取下后采用一密闭容器用蒸汽处理，处理完毕后真空干燥，去除残留溶剂。所述步骤(I)中GMl和NGF的超纯水溶液配制完毕后在4°C条件下保存，避免营养因子活性的丧失。所述步骤(2 )中的聚乳酸-聚己内酯分子量为Mw 30万。所述步骤(2)中所采用的搅拌方法是磁力搅拌，搅拌速度均为400飞00转每分钟，搅拌时间为12-24小时。所述步骤(4)中的喷丝口为同心轴的复合毛细管，所制备的纳米纤维具有“芯-壳”结构。所述步骤(4)中所涉及的纺丝参数为:纺丝喷头为内层为8号外层为16号的同心轴喷丝头；注射泵的推进速度分别为芯层0.2毫升每小时和壳层1.0毫升每小时；在同心轴喷丝头和转鼓接受器之间接入的调节电压为12千伏；同心轴喷丝头和转鼓接受器之间的距离为15-20厘米；电机提供给转鼓的转速为4000转每分钟。所述步骤(5)中的蒸汽处理采用体积分数75%的乙醇；处理时间为24_36h。所述步骤(5)中的干燥时间为72_96h。可用作大动物长距离神经缺损修复的一种GMl介导NGF且具有营养因子控释模型的支架。本发明基于同轴静电纺丝技术，以丝素蛋白和P(LLA-CL)的共混物作为皮层材料，既提高纤维的表面亲水性以提供细胞识别位点，又使其具有一定的力学性能；以含有具有协同作用的双营养因子(GMl和NGF)的水溶液作为芯层材料，制备皮芯结构的活性纳米纤维，研究双营养因子的缓释行为，及对神经再生的促进作用，并且通过纳米纤维的取向诱导神经再生。有益效果(I)本发明的神经修复支架将具有协同作用的双营养因子(GMl和NGF)包载进纳米纤维，在制备过程中利用高速旋转的滚筒接收获得取向结构，从而从生化功能和拓扑结构两方面研究神经再生机理，为神经修复提供实验和理论依据。并且制备出的活性神经导管可用于修复大段神经缺损，揭示营养因子的缓释及纤维取向诱导作用对较长神经缺损修复的机理；(2)本发明所涉及的制备装置简易、过程参数少、制备过程稳定，在活性神经修复支架的制备领域有着广泛的应用前景。
图1负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架制备示意图2负载GMl和NGF双营养因子的取向神经组织修复支架的扫描显微镜照片；图3负载GMl和NGF双营养因子的纳米纤维透射电子显微镜照片。
具体实施例方式结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容后，本技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。实施例1称取本蛋 白丝素0.20克，聚乳酸-聚己内酯0.60克，溶于10毫升六氟异丙醇(HFIP)，聚乳酸-聚己内酯分子量为Mw 30万，以400转每分钟的速率磁力搅拌12小时混合均匀得到总浓度8%的壳层静电纺丝溶液；取10微克每毫升的神经节苷脂(GMl)超纯水溶液和10微克每毫升的神经生长因子(NGF)超纯水溶液分别I毫升，混合均匀得到两毫升GMUNGF浓度比为1:1混合溶液，得到芯层静电纺溶液。将壳层静电纺丝溶液装入注射器，微量注射泵的推进速度控制为I毫升每小时，将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器，微量注射泵的推进速度控制为0.2毫升每小时。同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头为8号针头，壳层溶液通过的针头为16号针头，针头与12千伏的高压相连。用铝箔平整包缠的直径为5厘米的滚筒接收纳米纤维丝，滚筒与电机相连，电机控制滚筒转速4000转每分钟，同心轴喷丝头和转鼓接受器之间的距离为15厘米，10小时后铝箔上接收到一定厚度的取向纳米纤维膜。上述支架取下后采用一密闭容器、体积分数75%的乙醇进行蒸汽处理24h，处理完毕后真空干燥72h，去除残留溶剂。实施例2称取蛋白丝素0.25克，聚乳酸-聚己内酯0.75克，溶于10毫升六氟异丙醇(HFIP)，聚乳酸-聚己内酯分子量为Mw 30万，以600转每分钟的速率磁力搅拌12小时混合均匀得到总浓度10%的壳层静电纺丝溶液；取20微克每毫升的神经节苷脂(GMl)超纯水溶液和20微克每毫升的神经生长因子(NGF)超纯水溶液分别I毫升，混合均匀得到两毫升GMUNGF浓度比为1:1混合溶液，得到芯层静电纺溶液。将壳层静电纺丝溶液装入注射器，微量注射泵的推进速度控制为I毫升每小时，将芯层静电纺丝溶液装入另一个注射器，微量注射泵的推进速度控制为0.2毫升每小时。同轴静电纺丝所用的同心轴芯层溶液通过的针头为8号针头，壳层溶液通过的针头为16号针头，针头与12千伏的高压相连。用铝箔平整包缠的直径为5厘米的滚筒接收纳米纤维丝，滚筒与电机相连，电机控制滚筒转速4000转每分钟，同心轴喷丝头和转鼓接受器之间的距离为20厘米，10小时后铝箔上接收到一定厚度的取向纳米纤维膜。上述支架取下后采用一密闭容器、体积分数75%的乙醇进行蒸汽处理36h，处理完毕后真空干燥96h，去除残留溶剂。
权利要求
1.一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，包括: (1)将GMl和NGF两种营养因子以质量比1:1共溶于超纯水中，完全溶解得到10-20微克每毫升的溶液； (2)将质量比为25:75的丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯共混物溶于六氟异丙醇，完全溶解搅拌均匀后得到质量体积百分比为8-10%的溶液； (3 )将步骤(I)得到的溶液装入推进容器，在微量注射泵的驱动下进入同轴装置复合毛细喷头的内毛细喷头；将步骤(2)得到的溶液装入推进容器，在微量注射泵的驱动下进入同轴装置复合毛细喷头的内外毛细喷丝口之间的环状空隙处； (4)启动推进泵、电压和电机，开始形成取向接收的同轴静电纺纳米纤维，得到支架； (5)将上述支架取下后采用一密闭容器用蒸汽处理，处理完毕后真空干燥，去除残留溶剂。
2.根据权利要求1所述的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中GMl和NGF的超纯水溶液配制完毕后在4°C条件下保存，避免营养因子活性的丧失。
3.根据权利要求1所述的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中的聚乳酸-聚己内酯分子量为Mw 30万。
4.根据权利要求1所述的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中所采用的搅拌方法是磁力搅拌，搅拌速度均为40(Γ600转每分钟，搅拌时间为12-24小时。
5.根据权利要求1所述的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中的喷丝口为同心轴的复合毛细管，所制备的纳米纤维具有“芯-壳”结构。
6.根据权利要求1所述的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中所涉及的纺丝参数为:纺丝喷头为内层为8号外层为16号的同心轴喷丝头；注射泵的推进速度分别为芯层0.2毫升每小时和壳层1.0毫升每小时；在同心轴喷丝头和转鼓接受器之间接入的调节电压为12千伏；同心轴喷丝头和转鼓接受器之间的距离为15-20厘米；电机提供给转鼓的转速为4000转每分钟。
7.根据权利要求1所述的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中的蒸汽处理采用体积分数75%的乙醇；处理时间为24-36h。
8.根据权利要求1所述的一种负载GMl和NGF双营养因子的神经组织修复支架的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中的干燥时间为72-96h。
全文摘要
本发明涉及一种GM1、NGF双营养因子负载的活性神经修复导管的制备方法，包括搭建制备装置、配制GM1和NGF超纯水溶液、配制丝素蛋白(Silk)/聚乳酸-聚己内酯(P(LLA-CL))的六氟异丙醇(HFIP)混合溶液、负载GM1和NGF双营养因子的纳米纤维支架的制备等过程。本发明制备出的纳米纤维支架从生物化学的途径(活性营养因子的加入)和拓扑结构的途径(取向结构的引入)对神经修复导管进行改造，研究双营养因子的缓释行为及对神经再生的促进作用，通过纳米纤维的取向诱导神经再生。本发明为神经修复提供实验和理论依据，为临床修复大段神经缺损提供新思路。
文档编号A61L27/54GK103083724SQ201310039519
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者莫秀梅, 贺梨萍, 吴瑃辰 申请人:东华大学