专利名称：一种负载生物活性因子的仿生涂层制备方法
技术领域：
本发明属于医用材料制造技术领域，涉及一种负载生物活性因子的仿生涂层制备方法，尤其涉及一种具有生物活性因子缓释功能的仿生涂层制备方法，是牙科钛种植体表面生物活化改性的处理方法。通过该方法在种植体表面构建的仿生涂层模拟了天然胞外基质的组织形式，既有生物大分子子构成其主体结构又负载了能调节细胞行为的生物活性因子，通过该涂层实现的一种或多种生物活性因子的缓释效应能促进种植体与骨组织之间的快速骨整合，也有利于种植体的长期稳定性。
背景技术：
由Branemark教授提出的骨整合(Osteointegration )理论是口腔种植领域的核心理论。种植体与周围骨组织实现骨性结合是是评价种植成功与否的重要标准之一。为了达到这一标准，许多学者在种植材料及表面处理方面做了大量的工作。这些种植体表面处理方法的实施，其基本原理都是通过干预种植体周围组织修复愈合的过程，来加快种植体周围骨组织的形成速度，从而缩短种植义齿的治疗周期。种植体植入体内到实现与周围骨组织的骨性结合一般会经历成骨源性细胞的募集、粘附、增殖和分化，最后是钙盐的沉积和骨质矿化成熟的过程。种植体与血液接触后在其表面吸附形成的蛋白层对成骨源性细胞对种植体表面的识别与粘附有重要作用，而成骨源性细胞的募集，增殖和分化以及随后的钙盐沉积过程受到种植体周围局部成骨微环境的影响，包括局部生物活性因子的种类和浓度等。基于对种植体周围组织修复愈合过程了解的加深，以及对于细胞在基底表面的粘附机制和生物活性分子在调节细胞分化和组织重建方面作用的最新认识，将有机分子引入种植体表面成为近年来种植体表面改性方法研究中的热点问题。一方面，这些有机分子模拟了胞外基质的主要成分，为成骨源性细胞在种植体表面生长提供了有利的环境；另一方面，选择性的使用一些已知功能的生物活性因子，特别是具有显著促进细胞和骨组织反应功能的生长因子，能更加有效的调节和控制种植体周围的组织愈合过程。将有机分子引入种植体表面的方法也被称之为表面生化改性。种植体表面生化改性中涉及的有机分子包括几类一类是大分子量的成分，主要是胞外基质成分如胶原和硫酸软骨素等；一类是小分子量的促粘附多肽如含RGD (Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的多肽序列；还有一类是具有很强生物活性的生长因子类成分如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs),成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)，转化生长因子(transform growth factors, TGFs)等。现有的体内体外研究证实，这些有机分子的应用，对种植体表面的细胞和组织反应都有积极的效应。特别是生长因子类成分的单独或者联合其他有机分子的应用，能为种植体表面的细胞生长提供额外的线索，从而增加种植体周围的骨组织再生。现在种植体表面生化改性中存在的瓶颈问题是缺乏有效的手段将这些有机分子引入到种植体表面，尤其是对于具有高生物活性的生长因子类成分。理想的将有机分子引入种植体表面的技术手段应该具有这样的特征在种植体表面构建的有机分子涂层不仅保留其生物学活性，而且其降解或者释放的动力学过程与组织愈合的过程相匹配。 显然现有的技术手段如物理吸附和化学偶联的方式满足不了这样的要求。前者引入的涂层分布不均、效率低下、稳定性差、重复性差以及结合力小容易在种植体植入过程中被擦掉。 而后者容易引起生物活性因子的构象而影响其生物学活性。在酶解，水解以及还原性物质的作用下，上述聚电解质复合涂层在生理条件下的降解还是相对比较快的(存在时间约4-7天)。调节其降解速率并实现负载在涂层内的生物活性因子的缓释作用依赖于对该聚电解质复合涂层稳定性的进一步调控。研究表明，二硫键(-S-S-)在维持生物大分子特别是蛋白质的天然构象和稳定性中发挥着重要作用，且二硫键可在还原条件下被打开形成巯基(-SH)，而巯基很容易被氧化成二硫键。这两者发生相互转化的反应条件相对温和，对生物大分子的活性损伤较小。
发明内容
本发明的目的是提供一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，通过以下步骤实现
(I)RGD接枝的聚电解质的制备
首先是合成含双硫键的RGD多肽链段甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-S-S-半胱氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸 (GRGDSPC(S-S)CPSDGRG),由 SciLight Biotechnology, LLC 公司合成，然后在碳化二亚胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl ami-nopropyl) carbodiimide, EDC] :N_ 羟基琥珀酰亚胺 (N-hydroxysuccinimide, NHS)催化体系存在的条件下，该多肽链段接枝到聚电解质上， 将所得到的产物透析纯化后，加入木苏糖或者谷胱甘肽与之进行反应，将多肽链段间的双硫键打开得到甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-SH (GRGDSPC-SH)接枝的聚电解质，从而实现聚电解质的改性。聚电解质为聚阳离子聚电解质和聚阴离子聚电解质。本发明所述的RGD是一种含精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸的线性七肽结构，其肽链结构为甘氨酸_精氨酸_甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-SH(GRGDSPC-SH)。本发明所述RGD接枝的聚电解质均指的是被修饰了甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸序列，并具有自由活泼巯基的聚电解质。所述的聚阴电解质选用透明质酸、碱溶明胶、聚谷氨酸、聚天冬氨酸中的一种或者几种，得到的产物是RGD接枝的聚阴离子电解质。聚阴离子电解质的分子量从 100-5000000D。所述聚阳电解质选用I型胶原、壳聚糖、酸溶明胶、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸中的一种或者几种，得到的产物是RGD接枝的聚阳离子电解质。聚阳离子电解质的分子量从 100-2000000D。所述聚电解质的浓度为0. l-50mg/ml，其中最佳浓度为5mg/ml ；所述的多肽链段的量与聚电解质中羧基含量的摩尔比例为1 :10000-1 :1，其中最佳浓度比率为1 :20-50 ； 所述的碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺(EDCNHS)的用量为1 :1_20 :1，其中最佳浓度比例为10-5 1 ；EDC的用量与多肽链段的用量的摩尔比例为1 :1_10 :1，其中最佳浓度比例为2-5 1 ；所用的木苏糖或者谷胱甘肽的浓度与EDC:NHS体系中双硫键的摩尔比例为1 1-50 :1，其中最佳摩尔浓度比例为5 :1。(2)聚电解质溶液的配制
添加有生物活性因子(BMP-2或bFGF)的聚阳离子电解质溶液的配制将经步骤(1)获得的RGD接枝的聚阳离子电解质或未改性的聚阳离子电解质配制成溶液，并在其中添加生物活性因子BMP-2或bFGF，配制成具有一定生物活性因子浓度的聚阳离子电解质溶液。生物活性因子(bmp-2或bFGF)只添加在聚阳离子电解质溶液里，因为两者在PH值在4. 0左右都带正电荷。聚阴离子电解质溶液的配制将经步骤(1)获得的RGD接枝的聚阴离子聚电解质或未改性的聚阴离子电解质配制成溶液。步骤(2)中各种聚电解质溶液的浓度范围均为0. lmg/ml-10mg/ml，其中最佳浓度范围为0. 5-lmg/ml，其中聚电解质溶液中NaCl浓度为0. 1-0. 2mol/L, pH值为4. O。BMP-2 的浓度为0. 5-100(^g/ml，其中最佳浓度范围为20_20(^g/ml，bFGF浓度为20_100(^g/ml， 其中最佳浓度为50_50(^g/ml。(3) RGD接枝的负载生物活性因子的仿生涂层的制备
将步骤(2)的溶液作如下组合(a)添加生物活性因子(BMP-2或bFGF)的RGD接枝的聚阳离子聚电解质溶液和未改性的聚阴离子电解质溶液可以作为一组溶液；(b) RGD接枝的聚阴离子聚电解质溶液和添加生物活性因子(BMP-2或bFGF)的未改性的聚阳离子电解质溶液可以作为一组溶液；(c)添加生物活性因子(BMP-2或bFGF)的RGD接枝的聚阳离子聚电解质溶液和RGD接枝的聚阴离子聚电解质溶液可以作为一组溶液。用(a)-(c)任一组溶液，利用静电自组装技术，首先在钛基种植体表面沉积聚阳离子电解质和生物活性因子，沉积一定时间后，充分水洗，然后沉积聚阴离子电解质层，沉积一定时间后，充分水洗；以上操作记为一次沉积循环，根据需要重复以上循环操作，最后得到需要的聚电解质复合层；然后，该聚电解质复合层在氯胺T溶液或者双氧水溶液中浸泡一段时间，迅速取出，充分水洗，得到负载生物活性因子的仿生涂层。即是一种RGD交联的具有生物活性因子缓释功能的聚电解质仿生涂层。其中沉积单一一层聚阴离子电解质层或聚阳离子电解质层所用的沉积时间为 5min-20min，沉积一层聚阳离子电解质层和一层聚阴离子电解质层称为一个沉积循环，构建聚电解质复合涂层所需的沉积循环为0. 5-50次，根据实际临床用途确定最后的沉积循环数，其中口腔用牙种植体的表面沉积最佳循环是4-10次，最外层为RGD修饰的聚电解质层。步骤(3)中聚电解质复合层在氯胺T中的浸泡时间为5-180秒，最佳时间为30_90 秒，氯胺T的浓度为0. 5-10 mM，其中最佳浓度为2mM，在双氧水中浸泡时间为5_60分钟，最佳时间为10-20分钟，双氧水的浓度为1-50 mM，其中最佳浓度为10_15mM。步骤(3)中所用的种植体表面为各种永久植入型种植体表面，可以选用经氧化性酸处理的纯钛或者钛合金表面、非氧化型酸处理的纯钛或者钛合金种植体表面、喷砂/酸处理的表面、各种碱热法得到的纯钛或者钛合金种植体表面、电化学得到的各种表面、各种羟基磷灰石涂层的纯钛或者钛合金种植体表面、钛或者羟基磷灰石喷浆表面的纯钛或者钛合金种植体表面、钛喷浆/酸处理的纯钛或者钛合金表面、离子注入的各种纯钛或者钛合金种植体表面、或激光处理的各种纯钛或者钛合金种植体表面。
本发明通过层层自组装技术(layer by layer technique, LBL技术)在种植体表面构建负载有生物活性因子的有机涂层。LBL技术最早由法国科学家G. Decher提出，该方法具有操作简单，制备条件温和，方便可控，能连续生产等特点。它的基本原理是在静电力作用下，带有相反电荷的聚电解质可以交替沉积在固体支持物表面，得到物理化学性质均一的聚电解质复合膜。研究发现，具有电荷性质的聚电解质和两性聚电解质如蛋白质、多肽、DNA等都可以利用LBL技术被引入到支持物表面，同时生物活性大分子在多层复合膜中活性几乎得到了全部保留，而且具有更强的对抗环境变化的能力。本发明所选用的聚阴离子电解质和聚阳离子电解质为天然或经RGD序列接枝改性的生物大分子。BMP-2或bFGF等生长因子被添加在聚阳离子电解质溶液中，在聚阳离子电解质沉积到种植体表面的过程中被同时装载到聚电解质复合涂层内。本发明中用于接枝生物大分子的RGD序列设计成末端带有巯基，在氯胺T/无水吗啉乙磺酸或过氧化氢存在的条件下，可以通过巯基与二硫键的相互转化来实现聚电解质复合涂层的交联，从而增加涂层的稳定性并实现生物活性因子的缓慢释放。同时，通过改变组装的层数和交联剂作用的时间来实现对涂层降解时间的调控。而且，由于双硫键的存在，又赋予聚电解质复合涂层对体内生物降解的响应性。本发明方法所构建的RGD交联的负载生物活性因子的聚电解质复合层，在成分上模拟了胞外基质的主要组成，RGD多肽的引入为细胞对基质的识别提供了更多的线索。功能性RGD多肽序列引入的另一个更要的作用是温和有效地特异性交联一个负载生物活性因子载体，解决了长期以来限制生物活性因子在种植体周围应用的瓶颈问题。期望可以促进种植体周围成骨的早期发生，可以早日实现骨整合。本发明是一种在钛种植体表面构建负载生物活性因子的仿细胞外基质有机涂层的方法。种植体表面聚电解质复合涂层的制备是通过层层自组装技术(layer by layer technique, LBL技术)实现的，而具有高生物活性的生长因子类成分(BMP_2或bFGF等)随着涂层的组装过程被携带入涂层中。构建涂层的聚电解质至少有一种是经末端带有巯基的 RGD序列接枝改性的。利用巯基经氧化生成双硫键的反应增加了聚电解质涂层的稳定性，而交联后涂层中的双硫键对生理环境下还原物质的响应性决定了涂层的降解具有生物响应性，也使得生物活性因子的释放具有缓释效应。RGD多肽序列的引入生物活性因子能稳定负载的前提条件，同时又与生物活性因子在生物学效应方面起到协同作用。该涂层的制备能实现种植体的早期骨整合，并有利于种植体的长期稳定性。
图1是聚电解质涂层中负载的BMP-2在磷酸盐缓冲液的缓释行为。图2是RGD交联的负载BMP-2的涂层对MC3T3细胞骨钙素(OC)表达的影响。图3是RGD交联的负载BMP-2的涂层对MC3T3细胞Runx2 mRNA表达的影响。图4是RGD交联的负载BMP-2的涂层对MC3T3细胞AKP-2 mRNA表达的影响。图5是不同组织愈合周期内，实验组和对照组的种植体的扭力大小。图6是聚电解质涂层中负载的bFGF在磷酸盐缓冲液的缓释行为。图7是RGD交联的负载bFGF的涂层对MC3T3细胞粘附、增殖行为的影响。图8是RGD交联的负载bFGF的涂层对MC3T3细胞骨钙素(OC)表达的影响。
图9是RGD交联的负载bFGF的涂层对MC3T3细胞Runx2 mRNA表达的影响。图10是RGD交联的负载bFGF的涂层对MC3T3细胞AKP-2 mRNA表达的影响。图11是不同组织愈合周期内，实验组和对照组的种植体的扭力大小。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明，由于本发明可以在所有体内永久性植入的种植体表面进行构建，从而可以实现植入体和硬组织间的快速骨整合和远期的种植成功率。实施例中只是以一种喷砂/酸处理表面作为说明，但是，其他体内永久性植入种植体表面上用本发明所构建的这种涂层都在本发明的保护范围之内。本发明的实施例只是为了更好说明本发明的特征，并不完全包含本申请的所保护内容。实施例一 RGD交联的负载生物活性因子的胶原/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的透明质酸溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的透明质酸钠。将RGD接枝的透明质酸和胶原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为 lmg/ml。在配好的胶原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为2(^g/ml (若加的是 bFGF,则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(胶原+ BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(胶原+ BMP-2);然后，再浸泡于R⑶修饰的透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸钠。重复以上操作，最后得到6个胶原/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的胶原/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例二 RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/透明质酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例一，区别在于将胶原更换为酸溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例三RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/透明质酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例一，区别在于将胶原更换为壳聚糖。实施例四RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸的制备
方法同实施例一，区别在于将胶原更换为聚精氨酸。实施例五RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸的制备
方法同实施例一，区别在于将胶原更换为聚赖氨酸。实施例六RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸的制备
方法同实施例一，区别在于将胶原更换为聚组氨酸。
/透明质酸聚电解质复合层 /透明质酸聚电解质复合层 /透明质酸聚电解质复合层
实施例七RGD交联的负载生物活性因子的胶原/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的碱溶明胶溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的碱溶明胶。将RGD接枝的碱溶明胶和胶原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为 lmg/ml。在配好的胶原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是 bFGF,则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(胶原+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(胶原+BMP-2);然后，再浸泡于RGD修饰的碱溶明胶溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的碱溶明胶。重复以上操作，最后得到6个胶原/碱溶明胶聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的胶原/碱溶明胶聚电解质复合层涂层的种植体。实施例八RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例七，区别在于将胶原更换为酸溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例九RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例七，区别在于将胶原更换为壳聚糖。实施例十RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例七，区别在于将胶原更换为聚精氨酸。实施例十一 RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例七，区别在于将胶原更换为聚赖氨酸。实施例十二 RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例七，区别在于将胶原更换为聚组氨酸。实施例十三RGD交联的胶原/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚谷氨酸溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的聚谷氨酸。将RGD接枝的聚谷氨酸和胶原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为 lmg/ml。在配好的胶原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是 bFGF,则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(胶原+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(胶原+BMP-2);然后，再浸泡于R⑶修饰的聚谷氨酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的聚谷氨酸。重复以上操作，最后得到6个胶原/聚谷氨酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的胶原/聚谷氨酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例十四RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例十三，区别在于将胶原更换为酸溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例十五RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例十三，区别在于将胶原更换为壳聚糖。实施例十六RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸层的制备
方法同实施例十三，区别在于将胶原更换为聚精氨酸。实施例十七RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸层的制备
方法同实施例十三，区别在于将胶原更换为聚赖氨酸。实施例十八RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸层的制备
方法同实施例十三，区别在于将胶原更换为聚组氨酸。实施例十九RGD交联的负载生物活性因子的胶原/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚天冬氨酸溶于水中，随后加入EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖， 反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的聚天冬氨酸。将RGD接枝的聚天冬氨酸和胶原溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的胶原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂W2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(胶原+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(胶原+BMP-2);然后，再浸泡于R⑶修饰的聚天冬氨酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的聚天冬氨酸。重复以上操作，最后得到6个胶原/聚天冬氨酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的胶原/聚天冬氨酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例二十RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例十九，区别在于将胶原更换为酸溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例二i^一 =RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例十九，区别在于将胶原更换为壳聚糖。实施例二十二 RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚电解质
/聚谷氨酸聚电解质复合 /聚谷氨酸聚电解质复合 /聚谷氨酸聚电解质复合复合层的制备
方法同实施例十九，区别在于将胶原更换为聚精氨酸。实施例二十三RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例十九，区别在于将胶原更换为聚赖氨酸。实施例二十四RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例十九，区别在于将胶原更换为聚组氨酸。实施例二十五RGD交联的负载生物活性因子的胶原/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC(S-S)CPSDGRG和一定量的胶原溶于水中，随后加入EDC/ NHS,反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4 小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的胶原。将该RGD接枝的胶原和透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的胶原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂W2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的胶原+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD接枝的胶原+BMP-2)；然后，再浸泡于透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。 重复以上操作，最后得到6个胶原/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的胶原/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例二十六RGD交联的负载生物活性因子的胶原/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例二十五，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例二十七RGD交联的负载生物活性因子的胶原/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例二十五，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例二十八RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例二十五，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例二十九RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG和一定量的壳聚糖溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的壳聚糖。将该RGD接枝的壳聚糖和透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的壳聚糖溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的壳聚糖+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD 接枝的壳聚糖+BMP-2);然后，再浸泡于透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个壳聚糖/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD 交联的负载生物活性因子的壳聚糖/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例三十RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例二十五，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例三i^一 =RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例二十五，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例三十二 RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例二十五，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例三十三RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的酸溶明胶溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的酸溶明胶。将该RGD接枝的酸溶明胶和透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的酸溶明胶溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂W2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的酸溶明胶+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的 (RGD接枝的酸溶明胶+BMP-2)；然后，再浸泡于透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个酸溶明胶/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。 得到RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例三十四RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例三十三，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例三十五RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例三十三，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例三十六RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例三十三，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例三十七RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/透 明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚精氨酸溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的聚精氨酸。将该RGD接枝的聚精氨酸和透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的聚精氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2S04和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的聚精氨酸+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的 (R⑶接枝的聚精氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个聚精氨酸/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。 得到RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例三十八RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例三十七，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例三十九RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例三十七，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例四十RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例三十七，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例四i^一 RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚赖氨酸溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的聚赖氨酸。将该RGD接枝的聚赖氨酸酸和透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的聚赖氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为
ml (若加的是bFGF，则终浓度为0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。 种植体表面经大颗粒喷砂、H2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面， 然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的聚赖氨酸+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚赖氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个聚赖氨酸/透明质酸聚电解质复合层。 将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺Τ。得到RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例四十二 RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十一，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例四十三RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十一，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例四十四RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十一，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例四十五R⑶交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S)CPSDGRG和一定量的聚组氨酸溶于水中，随后加入 EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的聚组氨酸。将该RGD接枝的聚组氨酸和透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的聚组氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2S04和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的聚组氨酸+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的 (R⑶接枝的聚组氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个聚组氨酸/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。 得到RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例四十六RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十五，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例四十七RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十五，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例四十八RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施 例四十五，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例四十九RGD交联的负载生物活性因子的胶原/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分别和一定量的胶原和透明质酸溶于水中，随后加入EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，力口入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的胶原和具有自由巯基的RGD接枝的透明质酸。将 RGD接枝的胶原和RGD接枝的透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的胶原溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0.1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2S04和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的胶原+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD 接枝的胶原+BMP-2);然后，再浸泡于透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个胶原/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的胶原/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例五十RGD交联的负载生物活性因子的胶原/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十九，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例五十一 RGD交联的负载生物活性因子的胶原/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十九，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例五十二 RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例四十九，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例五十三RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分别和一定量的壳聚糖和透明质酸溶于水中，随后加入EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中， 加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，分别得到具有自由巯基的RGD接枝的壳聚糖和 RGD接枝的透明质酸。将该RGD接枝的壳聚糖和RGD接枝的透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 两者的浓度都为lmg/ml。在配好的壳聚糖溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为 5μδ/πι1 (若加的是bFGF，则终浓度为0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到 4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(R⑶接枝的壳聚糖+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD接枝的壳聚糖+BMP-2)；然后，再浸泡于RGD接枝的透明质酸溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的RGD接枝的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个壳聚糖/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例五十四RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例五十三，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例五十五RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例五十三，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。 实施例五十六RGD交联的负载生物活性因子的壳聚糖/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例五十三，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例五十七R⑶交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分别和一定量的酸溶明胶和透明质酸溶于水中，随后加入EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的酸溶明胶和 RGD接枝的透明质酸。将该RGD接枝的酸溶明胶和RGD接枝的透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 两者的浓度都为lmg/ml。在配好的酸溶明胶溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到 4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的酸溶明胶+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD接枝的酸溶明胶+BMP-2 )；然后，再浸泡于RGD接枝的透明质酸溶液中IOmin， 去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个酸溶明胶/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例五十八R⑶交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例五十七，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例五十九R⑶交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例五十七，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例六十RGD交联的负载生物活性因子的酸溶明胶/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例五十七，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例六i^一 RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分别和一定量的聚精氨酸和透明质酸溶于水中，随后加入EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的聚精氨酸和 RGD接枝的透明质酸。将该RGD接枝的聚精氨酸和RGD接枝的透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 两者的浓度都为lmg/ml。在配好的聚精氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到 4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的聚精氨酸+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚精氨酸+BMP-2 )；然后，再浸泡于RGD接枝的透明质酸溶液中IOmin， 去离子水洗去物理吸附的RGD接枝的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个聚精氨酸/ 透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例六十二 RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十一，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例六十三RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十一，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例六十四RGD交联的负载生物活性因子的聚精氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十一，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例六十五RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分别和一定量的聚赖氨酸和透明质酸溶于水中，随后加入EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，得到具有自由巯基的RGD接枝的聚赖氨酸和 RGD接枝的透明质酸。将该RGD接枝的聚赖氨酸酸和RGD接枝的透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，两者的浓度都为lmg/ml。在配好的聚赖氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0. 1 mg/ml )。配制完成的上述溶液的pH值调整到4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的聚赖氨酸+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚赖氨酸+BMP-2)；然后，再浸泡于RGD接枝的透明质酸溶液中 lOmin，去离子水洗去物理吸附的R⑶接枝的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个聚赖氨酸/透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30 秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例六十六RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十五，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例六十七RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十五，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例六十八RGD交联的负载生物活性因子的聚赖氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十五，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例六十九RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/透明质酸聚电解质复合层的制备
将含RGD的多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG分别和一定量的聚组氨酸和透明质酸溶于水中，随后加入EDC/NHS，反应4小时，反应产物透析1周，冻干；反应产物直接溶解于水中，加入木苏糖，反应4小时，透析一周，冻干，分别得到具有自由巯基的RGD接枝的聚组氨酸和RGD接枝的透明质酸。将该RGD接枝的聚组氨酸和RGD接枝的透明质酸溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中， 两者的浓度都为lmg/ml。在配好的聚组氨酸溶液中加入BMP-2，使其在溶液中的最终浓度为5Pg/ml (若加的是bFGF，则终浓度为0. 1 mg/ml)。配制完成的上述溶液的pH值调整到 4. 0。种植体表面经大颗粒喷砂、H2SO4和HCl混酸溶液处理1分钟，大量纯净水洗净种植体表面，然后将该种植体浸泡于(RGD接枝的聚组氨酸+BMP-2)溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附的(RGD接枝的聚组氨酸+BMP-2 )；然后，再浸泡于RGD接枝的透明质酸溶液中IOmin， 去离子水洗去物理吸附的RGD接枝的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个聚组氨酸/ 透明质酸聚电解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于氯胺T中30秒钟，立即拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/透明质酸聚电解质复合层涂层的种植体。实施例七十RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/碱溶明胶聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十九，区别在于将透明质酸更换为碱溶明胶(其来源为猪源，牛源或者鼠源)。实施例七i^一 RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/聚谷氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十九，区别在于将透明质酸更换为聚谷氨酸。实施例七十二 RGD交联的负载生物活性因子的聚组氨酸/聚天冬氨酸聚电解质复合层的制备
方法同实施例六十九，区别在于将透明质酸更换为聚天冬氨酸。实施例七十三聚电解质涂层中负载的BMP-2在磷酸盐缓冲液的缓释行为
使用(胶原+BMP-2)和具有巯基末端RGD接枝改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的RGD交联的负载有BMP-2的聚电解质涂层(BEC-CL-TI group)(交联组)。使用(胶原+BMP-2)和未带末端巯基的RGD接枝改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的负载有BMP-2的聚电解质涂层(BEC- TI group)(未交联组)。将覆盖两种不同涂层的钛片分别置于磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，使用酶联免疫吸附的方法检测这两种涂层中BMP-2的释放行为。结果参见图1，显示了未交联组涂层中的BMP-2的释放只持续了 3天，第一天的释放量很高，呈爆发性释放，接下来的释放量就急剧下降。而交联组BMP-2的释放缓慢而持久， 到了第十天还有少量的BMP-2被释放出来。实施例七十四RGD交联的负载BMP-2的涂层对MC3T3细胞骨钙素(OC)表达的影响
使用胶原和透明质酸在钛片上制备6个双层的聚电解质涂层(CHC-TI group)(对照组)。使用胶原和RGD改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的聚电解质涂层(CHRC-TI group)(实验组)。使用(胶原+BMP-2)和具有巯基末端R⑶接枝改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的RGD交联的负载有BMP-2的聚电解质涂层(BEC-CL-TI group)(实验组)。 小鼠成骨前体细胞细胞系MC3T3-E1 (中国科学院细胞库)用来评价涂层的对细胞分化行为的影响。骨钙素的表达是成骨前体细胞分化的重要指标之一。测定的2周时四个组别间细胞骨钙素表达量的结果显示(参见图2)，RGD多肽序列改性的组(CHRC-TI组)对细胞分化的促进作用要高于没有RGD改性组(CHC-TI组)。BMP-2作为具有强烈诱导骨形成能力的生长因子，其对细胞分化的促进作用是非常明显的，因此在BEC-CL-TI组显示了最高的OC 表达量，体现了交联作用带来的生物活性因子的缓释效应的优势。(“*”代表P<0.05，实验组与对照间的差异具有统计学意义；“#”代表P<0.05，实验组与实验组间的差异具有统计学意义)。实施例七十五RGD交联的负载BMP-2的涂层对MC3T3细胞成骨相关基因表达的影响
实验分组和使用的细胞系同实施例七十四。采用实时定量RT-PCR的方法来分析不同组别间成骨相关基因的表达变化。检测了碱性磷酸酶(AKP-2 mRNA)及RunX2 mRNA的表达情况。Rimx2的表达是启动成骨前体细胞向成骨细胞分化的重要转录因子，而碱性磷酸酶 (ALP)是成骨细胞早期分化的标志。结果显示，在细胞培养的早期，在BEC-CL-TI组Runx2 和ALP mRNA表达的上调的就明显高于其他两个组。而在7天和14天时，BEC-CL-TI组的优势就更加明显了。(“*”代表P<0.05，实验组与对照间的差异具有统计学意义；“#”代表 P<0. 05,实验组与实验组间的差异具有统计学意义)。参见图3、图4。实施例七十六体内试验
新西兰兔作为实验动物，在成年雄性兔子的双侧股骨远心端植入种植体用于评价经涂层改性后的种植体的体内生物学效应。对照组(Contro 1)为经喷砂酸蚀表面处理处理的种植体(SLA)。实验组(Test)为6个双层的RGD交联的负载有BMP-2的聚电解质涂层改性的SLA种植体。分别在种植体植入后的2、4和8周，采用便携式数字扭力测试仪分析种植体和骨组织的结合力。扭力值大小代表结合力大小。实验结果显示，在种植体植入后的2 周，实验组的种植体骨结合力要大于对照组，而到了 4和8周，实验组的优势则更加明显，也证实了在种植体表面制备的涂层具有在早期促进骨组织-种植体结合的能力。(“*”代表 P<0. 05,实验组与对照间的差异具有统计学意义)。参见图5。实施例七十七聚电解质涂层中负载的bFGF在磷酸盐缓冲液的缓释行为
使用(胶原+bFGF)和具有巯基末端RGD接枝改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的RGD交联的负载有生物活性因子的聚电解质涂层(Crossliked)(交联组)。使用(胶原 + bFGF)和未带末端巯基的RGD接枝改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的负载有生物活性因子的聚电解质涂层(Ti-[(Col+bFGF)/HA-RGD])(未交联组)。将覆盖两种不同涂层的钛片分别置于磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，使用酶联免疫吸附的方法检测这两种涂层中生物活性因子(bFGF)的释放行为。结果显示，未交联组涂层中的bFGF在前4天就释放完毕，且释放的速率非常快，在前两天释放的量非常大。而交联组bFGF的缓释效应可以持续 14天左右。参见图6。实施例七十八RGD交联的负载bFGF的涂层对MC3T3细胞粘附、增殖行为的影响使用胶原和透明质酸在钛片上制备6个双层的聚电解质涂层(CHC-Ti)(对照组)。使
用胶原和末端带巯基的RGD改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的RGD交联的聚电解质涂层(CHC-RGD-Ti )(实验组)。使用(胶原+bFGF)和具有巯基末端RGD接枝改性的透明质酸在钛片上制备6个双层的R⑶交联的负载有bFGF的聚电解质涂层(CC-Ti)(实验组)。小鼠成骨前体细胞细胞系MC3T3-E1用来评价涂层的对细胞增殖行为的影响。DNA含量的多少代表了细胞数目的多少。在Ih时CHC-RGD-Ti和CC-Ti组粘附的细胞量是最多的，显示了 RGD多肽对细胞粘附的促进作用。由于bFGF具有促进细胞有丝分裂的作用，在3d时，CC-Ti 组的细胞较之于其它两组是显著增加的。(“*”代表P<0.05，实验组与对照间的差异具有统计学意义；“#”代表P<0.05，实验组与实验组间的差异具有统计学意义)。参见图7。实施例七十九RGD交联的负载bFGF的涂层对MC3T3细胞骨钙素(OC)表达的影响实验分组和用于检测分化行为的细胞系同实施例七十八。测定的2周时四个组别间
细胞骨钙素表达量的结果显示，RGD多肽序列改性的组(CHC-RGD-Ti组)对细胞分化的促进作用要高于没有R⑶改性组(CHC-TI组)。CC-Ti上培养的细胞表达的OC量最高表明， bFGF对细胞分化的促进作用也是非常明显的。(“*”代表P<0.05，实验组与对照间的差异具有统计学意义；“#”代表P<0.05，实验组与实验组间的差异具有统计学意义)。参见图8。实施例八十RGD交联的负载bFGF的涂层对MC3T3细胞成骨相关基因表达的影响实验分组和用于检测基因表达的细胞系同实施例七十八。采用实时定量RT-PCR的方
法来分析不同组别间成骨相关基因的表达变化。检测了碱性磷酸酶(AKP-2 mRNA)及Rimx2 mRNA的表达情况。Rimx2的表达是启动成骨前体细胞向成骨细胞分化的重要转录因子，而碱性磷酸酶是成骨细胞早期分化的标志。每种生长因子的生物学效应是有差异的。与BMP-2 强烈的促进成骨细胞分化的效应明显不同的是，bFGF对Runx2和AKP_2mRNA表达的上调作用在2W的时候显现出最明显的优势来。(“*”代表P<0.05，实验组与对照间的差异具有统计学意义；“#”代表P<0. 05，实验组与实验组间的差异具有统计学意义)。参见图9、图10。实施例八i^一 体内试验
新西兰兔作为实验动物，在成年雄性兔子的双侧股骨远心端植入种植体用于评价经涂层改性后的种植体的体内生物学效应。对照组(Contro 1)为经喷砂酸蚀表面处理处理的种植体(SLA)。实验组(Test)为6个双层的RGD交联的负载有不FGF的聚电解质涂层改性的 SLA种植体。分别在种植体植入后的2、4和8周，采用便携式数字扭力测试仪分析种植体和骨组织的结合力。扭力值大小代表结合力大小。实验结果显示，在种植体植入后的2和 4周，实验组的种植体骨结合力要大于对照组。到了 8周时，两者的扭力值都较之前稍减小， 且两者值比较接近。“*”代表P<0.05，实验组与对照间的差异具有统计学意义)。参见图11。
权利要求
1.一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，通过以下步骤实现(1)RGD接枝的聚电解质的制备将含双硫键的RGD多肽链段GRGDSPC (S-S) CPSDGRG在碳化二亚胺N_羟基琥珀酰亚胺催化体系存在的条件下，接枝到聚电解质上，将所得到的产物透析纯化后，加入木苏糖或者谷胱甘肽与之反应，得到甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-SH接枝的聚电解质，聚电解质分别为聚阳离子聚电解质和聚阴离子聚电解质；所述的RGD是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的线性七肽结构，其肽链结构为甘氨酸-精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-SH ；所述聚电解质的浓度为0. l-50mg/ml，多肽链段的量与聚电解质中羧基含量的摩尔比为1 :10000-1 :1，碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺的用量为1 :1-20 :1，碳化二亚胺的用量与多肽链段的用量的摩尔比为1 :1_10 :1，木苏糖或者谷胱甘肽的浓度与催化体系中双硫键的摩尔比为1 1-50 1 ；(2)聚电解质溶液的配制聚阳离子电解质溶液配置将步骤(1)获得的RGD接枝的聚阳离子聚电解质或未改性的聚电解质阳离子配制成溶液，并在其中添加生物活性因子BMP-2或bFGF ；聚阴离子电解质溶液的配制将步骤(1)获得的RGD接枝的聚阴离子聚电解质或未改性的聚阴离子电解质配制成溶液；其中各种聚电解质溶液的浓度范围为0. lmg/ml-10mg/ml，聚电解质溶液中NaCl浓度为 0. 1-0. 2mol/L, pH 值为 4. 0，BMP-2 的浓度为 0. 5-1000μδ/πι1, bFGF 浓度为 20-1000μδ/ ml ；(3)仿生涂层的制备将步骤(2)配置的溶液作如下组合(a)添加生物活性因子BMP-2或bFGF的RGD接枝的聚阳离子聚电解质溶液和未改性的聚阴离子电解质溶液；(b) RGD接枝的聚阴离子聚电解质溶液和添加生物活性因子BMP-2或bFGF的未改性的聚阳离子电解质溶液；(c)添加生物活性因子BMP-2或bFGF的RGD接枝的聚阳离子聚电解质溶液和RGD接枝的聚阴离子聚电解质溶液；用(a)-(c)任一组溶液，首先在钛基种植体表面沉积聚阳离子电解质和生物活性因子，沉积一定时间后，充分水洗，然后沉积聚阴离子电解质层，沉积一定时间后，充分水洗， 以上操作记为一次沉积循环，根据需要重复以上循环操作，最后得到需要的聚电解质复合层，然后，在浓度为0. 5-10 mM的氯胺T溶液或者浓度为1-50 mM的双氧水溶液中浸泡，取出，充分水洗，得到负载生物活性因子的仿生涂层；在氯胺T中的浸泡时间为5-180秒，在双氧水中浸泡时间为5-60分钟。
2.根据权利要求1所述的一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的所述聚阳电解质选用I型胶原、壳聚糖、酸溶明胶、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸中的一种或者几种，得到的产物是RGD接枝的聚阳离子电解质，聚阳离子电解质的分子量为100-2000000D ；聚阴电解质选用透明质酸、碱溶明胶、聚谷氨酸、聚天冬氨酸中的一种或者几种，得到的产物是RGD接枝的聚阴离子电解质，聚阴离子电解质的分子量为 100-5000000D。
3.根据权利要求1所述的一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，其特征在于，步骤(3)中一层聚阴离子电解质层或聚阳离子电解质层所用的沉积时间为 5min-20min，所需的沉积循环为0. 5-50次。
4.根据权利要求1所述的一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所用的种植体表面为各种永久植入型种植体表面，选用经氧化性酸处理的纯钛或者钛合金表面、非氧化型酸处理的纯钛或者钛合金种植体表面、喷砂/酸处理的表面、 碱热法得到的纯钛或者钛合金种植体表面、电化学得到的表面、羟基磷灰石涂层的纯钛或者钛合金种植体表面、钛或者羟基磷灰石喷浆表面的纯钛或者钛合金种植体表面、钛喷浆/ 酸处理的纯钛或者钛合金表面、离子注入的纯钛或者钛合金种植体表面、或激光处理的纯钛或者钛合金种植体表面。
全文摘要
本发明提供一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，通过在碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺催化体系下，将含双硫键的RGD多肽链段接枝到聚电解质上，再配制成RGD接枝的聚阴离子电解质溶液和RGD接枝的负载生物活性因子聚阳离子电解质溶液，将聚阴离子电解质溶液和负载生物活性因子的聚阳离子电解质溶液组合，利用静电自组装技术，在种植体表面构建负载有生物活性因子的有机复合涂层。该复合涂层解决了长期以来限制生物活性因子在种植体周围应用的瓶颈问题，可促进种植体周围成骨的早期发生，早日实现骨整合，有利于种植体的长期稳定性。该方法操作简单，制备条件温和，方便可控，能连续生产。
文档编号A61K6/04GK102327645SQ201110288240
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者李晓东, 李晓军, 黄颖 申请人:浙江大学