专利名称：一种肝脏组织脱细胞液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物支架，特别是一种可作为肝脏组织工程中生物支架材料的肝脏组织脱细胞液。
背景技术：
重症肝衰竭及肝硬化等终末期肝病已严重影响了人们的生存质量，成为全世界死亡率最高的疾病之一。目前，肝移植是公认的唯一有效的治疗方法。但供体肝的短缺使这一技术的推广受到限制，使很多患者失去了最佳的治疗时机。组织工程学综合运用生物学和工程学的基本原理、基本理论、基本技术和方法，研究如何在体外条件下构建有生物活性的组织器官，用以替代病损的组织器官的学科。理想的组织工程组织或器官应具有生命活力，能够在形态、结构和功能上重建并达到永久性替代病损组织或器官的标准。组织工程组织器官与以往的修复方式相比具有多重优点:无异体排斥反应，生物相容性好，可以克服器官来源不足的问题。要构建理想的组织工程化人工肝脏，需要研究三个关键性的问题:种子细胞的来源、支架材料和能够为细胞支架复合物提供接近生理环境的生物反应器。目前认为最接近生理状态的支架材料为全器官脱细胞支架。它是运用各种手段，将整个器官内所有的细胞成份去掉，保留器官外包膜、原有细胞外基质及血管网络得到的生物支架。该支架具有诸多人工支架所不具备的优点:保留原有的血管网络解决了人工器官血管化的难题，维持细胞外基质成份及三维立体结构利于细胞粘附生长，其构成为天然基质材料有良好的生物相容性同时又克服了其它天然基质材料的缺点。现在采用的脱细胞手段主要是使用两种去垢剂:SDS (十二烷基硫酸钠)和Triton-X 100[1，2]。将这两种去垢剂(1%SDS或l%Triton_X100)通过血管持续灌流到全肝的各个部位，从而达到全 肝脱细胞化的目的。但现有的方法有如下缺点:
1、必须采用活体取组织的方法，若动物已死亡，约10分钟后肝内血管就形成广泛、弥漫的血栓，致使去垢剂难以到达脱细胞部位，去垢剂只作用于细胞膜表面的脂质成份，因而脱细胞效率不高，达不到脱细胞效果。2、采用活体取组织的方法，对供肝来源要求较高，若应用于临床，则肝脏支架供体来源受到限制，难以推广、临床实用性不强。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝脏组织脱细胞液，在脱细胞液的成份中引入了重组人组织纤溶酶原激活剂和tween 80这两种成份。其配置使用容易，脱细胞效率高，对肝脏的热缺血时间要求不高，大大增加了脱细胞肝脏支架在临床应用的潜在可能。具体内容:
一种肝脏组织脱细胞液，是在动物全肝脏脱细胞技术中引入一种两种成份制成的新型脱细胞液。该脱细胞液是由0.01%-0.05%重组人组织纤溶酶原激活剂rt-PA和0.5-2%tween 80,用无菌生理盐水配置而成。重组人组织纤溶酶原激活剂本来是用于溶解血管内血栓的临床用药，但因其采用基因重组技术生产可大量获得，具有选择性溶解血栓的作用，不影响血循环中纤溶系统，溶栓过程不需要活体内各种因子的参与，因而使其在体外条件下溶解血栓得以实现。TweenSO是一种非离子型去垢剂，可以破坏细胞膜，对红细胞的破坏尤为显著，但对蛋白的影响较小，可增强前期溶栓的效果，使整个肝脏的脉管系统通畅，提高后期脱细胞效率。另外，TweenSO是一种增溶剂可通过乳化作用提高重组人组织纤溶酶原激活剂的溶解性，从而间接提高其活性。本发明巧妙的在原有肝脏组织脱细胞技术中引入了一种含两种成份的新型脱细胞液，利用重组人组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)的强溶栓作用和tween 80增溶、红细胞破坏作用，使得肝脏组织脱细胞液具有配置使用容易，脱细胞效率高，对肝脏的热缺血时间要求不高的特性，大大增加了脱细胞肝脏支架在临床应用的潜在可能。
具体实施例方式实施例1:
一种肝脏组织脱细胞液，是在动物全肝脱细胞技术中引入两种成份制成的新型脱细胞液，该脱细胞液是由0.01%重组人组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)和2%tween80，用无菌生理盐水配置。具体操作:
1、全肝获取: 将大鼠安乐死后，沿纵向切开腹部，暴露大鼠肝脏。近心端腔静脉、门静脉和肝动脉置20G的套管(BD Intima)标记后离断，分离镰状韧带和心形韧带横切后，轻轻移动肝脏，使下腔静脉暴露于视野中，结扎、分离远心端腔静脉及任何粘附于肝上的附件。2、脱细胞准备:
(I)脱细胞液(配比:0.01% rt-PA, 2%tween 80)37°C脱细胞液经门静脉推注，夹闭肝动脉套管和近心端腔静脉，维持30min。然后夹闭肝动脉套管，开放近心端腔静脉，连接门静脉于蠕动泵上，用脱细胞液通过门静脉以4ml/min速率进行灌注。(2)灌注含1%SDS的生理盐水。连接门静脉于蠕动泵上，开放近心端腔静脉和肝动脉，通过门静脉以4ml/min速率进行灌注,持续30min。(3)灌注含l%Triton_X100的生理盐水，灌注体积大概为全肝体积的50倍。最后，再用生理盐水冲洗未流尽的脱细胞液。3、大鼠全肝脱细胞支架鉴定方法及结果:
(I)大体形态学观察:脱细胞后，肉眼观察大鼠全肝脱细胞肝脏支架呈白色半透明、海绵状，外部包膜完好，透过胞膜可看到肝脏内清晰的血管网络。在低倍显微镜下，血管树清晰可见。(2)显微观察:
扫描电镜观察:
脱细胞肝脏支架的基质，放大倍数8000倍时，可看到胶原蛋白纤维网孔径保留良好，孔径间有便于细胞爬行、附着的连接。放大倍数4000倍时，可看到肝板结构样的纤维排列。
HE及三色法观察:
脱细胞后的肝脏支架，石蜡包埋、切片后行HE染色和Trichrome染色，未看到细胞残留，胶原支架的蛋白保留完好。HE染色后可见清晰的胶原支架网络，但未看到细胞。三色法染色可见获得的的支架主要由胶原蛋白和糖粘连蛋白组成。DNA残留量检测(反应细胞残留量):
用DNeasy组织试剂盒(购于Qiagen Inc, Valencia, CA)按试剂盒操作说明书抽提不同大鼠(n=6)脱细胞肝支架的DNA成分后，用紫外分光光度计(美国Thermo)做DNA定量，未检测到DNA，而对照组(正常肝组织)可检测到DNA含量。实施例2:
一种肝脏组织脱细胞液，是在动物全肝脱细胞技术中引入两种成份制成的新型脱细胞液，该脱细胞液是由0.02%重组人组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)和l%tWeen80，用无菌生理盐水配置。具体操作:
1、全肝获取:与实施例1相同。2、脱细胞准备:
(I)脱细胞液(配比:0.02% rt-PA, l%tween 80)37°C脱细胞液经门静脉推注，夹闭肝动脉套管和近心端腔静脉，维持30min。然后夹闭肝动脉套管，开放近心端腔静脉，连接门静脉于蠕动泵上，用脱细胞液通过门静脉以4ml/min速率进行灌注。
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(2)后期处理方法与实施例1相同。3、大鼠全肝脱细胞支架鉴定方法及结果:
(I)大体形态学观察:脱细胞后，肉眼观察大鼠全肝脱细胞肝脏支架呈白色半透明、海绵状，外部包膜完好，透过胞膜可看到肝脏内清晰的血管网络。在低倍显微镜下，血管树清晰可见。(2)显微观察:
扫描电镜观察:
脱细胞肝脏支架的基质，放大倍数8000倍时，可看到胶原蛋白纤维网孔径保留良好，孔径间有便于细胞爬行、附着的连接。放大倍数4000倍时，可看到肝板结构样的纤维排列。HE及三色法观察:
脱细胞后的肝脏支架，石蜡包埋、切片后行HE染色和Trichrome染色，未看到细胞残留，胶原支架的蛋白保留完好。HE染色后可见清晰的胶原支架网络，但未看到细胞。三色法染色可见获得的的支架主要由胶原蛋白和糖粘连蛋白组成。DNA残留量检测(反应细胞残留量):
用DNeasy组织试剂盒(购于Qiagen Inc, Valencia, CA)按试剂盒操作说明书抽提不同大鼠(n=6)脱细胞肝支架的DNA成分后，用紫外分光光度计(美国Thermo)做DNA定量，未检测到DNA，而对照组(正常肝组织)可检测到DNA含量。实施例3:
一种肝脏组织脱细胞液，是在动物全肝脱细胞技术中引入两种成份制成的新型脱细胞液，该脱细胞液是由0.05%重组人组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)和0.5%tWeen80，用无菌生理盐水配置。
具体操作:
1、全肝获取:与实施例1相同。2、脱细胞准备:
(I)脱细胞液(配比:0.05% rt-PA,0.5%tween 80)37°C脱细胞液经门静脉推注，夹闭肝动脉套管和近心端腔静脉，维持30min。然后夹闭肝动脉套管，开放近心端腔静脉，连接门静脉于蠕动泵上，用脱细胞液通过门静脉以4ml/min速率进行灌注。(2)后期处理方法与实施例1相同。3、大鼠全肝脱细胞支架鉴定方法及结果:
(I)大体形态学观察:脱细胞后，肉眼观察大鼠全肝脱细胞肝脏支架呈白色半透明、海绵状，外部包膜完好，透过胞膜可看到肝脏内清晰的血管网络。在低倍显微镜下，血管树清晰可见。(2)显微观察:
扫描电镜观察:
脱细胞肝脏支架的基质，放大倍数8000X时，可看到胶原蛋白纤维网孔径保留良好，孔径间有便于细胞爬行、附着的连接。放大倍数4000X倍时，可看到肝板结构样的纤维排列。HE及三色法观察: 脱细胞后的肝脏支架，石蜡包埋、切片后行HE染色和Trichrome染色，未看到细胞残留，胶原支架的蛋白保留完好。HE染色后可见清晰的胶原支架网络，但未看到细胞。三色法染色可见获得的的支架主要由胶原蛋白和糖粘连蛋白组成。DNA残留量检测(反应细胞残留量):
用DNeasy组织试剂盒(购于Qiagen Inc, Valencia, CA)按试剂盒操作说明书抽提不同大鼠(n=6)脱细胞肝支架的DNA成分后，用紫外分光光度计(美国Thermo)做DNA定量，未检测到DNA，而对照组(正常肝组织)可检测到DNA含量。
权利要求
1.一种肝脏组织脱细胞液，其特征在于:在全肝脱细胞技术中引入一种由两种成份制成的新型脱细胞液，该脱细胞液是由0.01%-0.05%重组人组织纤溶酶原激剂rt-PA和.0.5-2% tween 80,用 无菌生理盐水配置。
全文摘要
本发明公开一种肝脏组织脱细胞液，是在动物全器官脱细胞技术中引入由两种成份制成的新型脱细胞液。该脱细胞液是由0.01%-0.05%重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)和0.5-2%tween80，用无菌生理盐水配置。利用重组组织纤溶酶原激活剂rt-PA的强溶栓作用和tween80的增溶、红细胞破坏作用，使得肝脏组织脱细胞液具有配置实施相对容易，脱细胞效率高，对肝脏的热缺血时间要求不高的特性，大大增加了脱细胞肝脏支架在临床应用的潜在可能。
文档编号A61L27/36GK103083726SQ20131006761
公开日2013年5月8日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者张蕾 申请人:昆明市第一人民医院