专利名称：叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物及其制备法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种叶酸与腺病毒的复合物:叶酸-腺病毒(FA-Ad5-TRAIL)。
背景技术：
腺病毒是一种无被膜的二十面体的病毒，约有50余种血清型，目前的研究比较集中在血清型2和血清型5上。其衣壳蛋白由240个六邻体、12个五邻体组成，介导腺病毒与受体细胞的接触和进入。其基因组为一个长约36Kb的双链DNA分子，由早期转录单位(E1A，ElB, E2，E3，E4)、主要晚期转录单位(L1-L5)、包装信号及两端的末端反向重复(inverted terminal repeat, ITR)序列组成,调节病毒的转录和病毒蛋白的形成。腺病毒进入宿主细胞进行复制分为4个阶段:感染，早期事件，晚期事件和包装。腺病毒感染细胞的第一步是通过纤维蛋白与细胞表面的柯萨奇病毒和腺病毒受体(cosakie andadenovirus receptor, CAR)结合。腺病毒粘附后，五邻体蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸(arginine-glycine.aspaarticacid,简称 RGD)与细胞表面的整合素(intergrin)a 3和a Vi3 5结合并相互作用使病毒进入细胞。腺病毒一旦进入胞浆，经外壳蛋白上的核定位信号入核，进行转录单位的表达。trail基因(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)作为TNF超家族成员由Wiley等在1995年根据TNF家族成员的同源性序列克隆并命名。已知trail的受体有五种:trail_RI/DR4、trail-R2/DR5、trail-R3/DcRl 和 trail-R4/DcR2 以及 0PG。其中 trail-Rl/R4 和trail-R2/R5包含细胞质的死亡区域及凋亡信号，而另两个诱骗受体trail_R3/DcRl和trail-R4/DcR2则缺少功能性死亡区域且不能介导凋亡。诱骗受体DcRl和DcR2在正常组织中有广泛的表达，而在肿瘤细胞系或新鲜分离的肿瘤组织中却未见表达，同时很多肿瘤细胞优先表达DR4和DR5。因此，正常细胞由于有诱骗受体与DcR4和DcR5竞争性结合trail而逃逸trail的杀伤，肿·瘤组织则由于缺乏诱骗受体的保护而易被trail杀伤。trail能够特异性地诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞，而对正常组织细胞没有杀伤作用，这是它不同于其它凋亡诱导分子的一个显著特征。正是这一特征，使其具有潜在的靶向抗癌前
旦
-5^ O目前，腺病毒载体的应用在肿瘤的临床基因治疗中占有很大地比例，作为一种高效侵染的基因载体，并不会把自身的基因组插入宿主染色体中，宿主细胞范围广泛而且经过基因敲除的腺病毒缺少相应的应答能力，大大降低其免疫毒性。作为载体常用的2型和5型腺病毒，其天然形式对细胞的感染是由纤维蛋白与细胞表面的CAR结合而介导的，腺病毒对组织的感染主要取决于CAR的表达水平。在人体中，CAR广泛表达于各种上皮组织，而在许多肿瘤组织中存在CAR不同程度的下调或缺失。因此，系统应用的腺病毒往往被截留在正常上皮细胞，尤其是肝细胞中，而感染肿瘤细胞的病毒量则明显减少，这样大大降低了Ad载体的转染效率。此外，为维持目的基因长时间表达，往往采用重复注射手段，引起宿主强烈地免疫性反应，诱发机体毒性。这些不利因素大大限制了 Ad载体在临床上的运用和发展。另外，腺病毒的感染谱很广，它可感染包括肺细胞，肝细胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等在内的各类分裂细胞和非分裂细胞。要想实现有效的抗肿瘤基因治疗，就必须构建肿瘤靶向性腺病毒载体，通过病毒对肿瘤细胞的靶向感染来实现对目的基因的靶向转移，这样不仅可以增加向靶组织的基因转移，同时也避免了病毒在非靶组织的截留，从而提高疗效，避免对全身系统和非靶向器官的毒性作用，降低免疫反应。为了克服上述限制因素，研究者设计很多策略用于改变Ad载体在体内的趋向性，增强其靶向性，主要基于改造Ad衣壳蛋白的活性位点，最常用的方法有基因工程改造法，物理修饰法和化学修饰法。其中，(I)对衣壳蛋白的基因修饰主要是:一个是遗传方法，就是对腺病毒外壳蛋白进行基因修饰以去除与天然受体的相互作用，同时装入新的靶向性配体以获得新的靶向性；一个是双组分法，即将一个双特异性分子结合到腺病毒上，通过这一双特异性分子阻断自然的受体结合，同时重新使腺病毒结合到肿瘤特异性受体上。(2)对衣壳蛋白的物理修饰主要是:利用Ad表面电荷和疏水性以及分子识别的相互作用来改变Ad的趋向性。(3)与用基因工程修饰Ad衣壳蛋白相比，其化学修饰方法更加简单易行，效果显著，不仅可改变Ad载体的趋向性，还可改变其理化性质和代谢动力学如粒径，ζ-电位的改变以及在血液中的清除率。Ad衣壳蛋白上拥有 1800个自由赖氨酸，主要分布在五邻体，六邻体和纤维蛋白上。这些自由的赖氨酸为共价偶联一些大分提供了许多活性位点，如聚合物，多糖，生物素，荧光基团，金属纳米颗粒和量子点等。1999年，O’ Riordan等首次报道了 PEG通过共价结合方式修饰腺病毒载体来降低其免疫性。经过修饰的腺病毒保持了病毒颗粒的完整性，同时覆盖了病毒载体的免疫结合位点，PEG而自身又无免疫原性，因此载体的免疫原性得到了有效的降低。体外实验表明，PEG修饰后的载体对CAR阳性的细胞的转染量下降了约99%，证实PEG修饰能有效阻断载体与细胞CAR结合[7]。PEG有效地阻断CAR受体与腺病毒的结合，这就需要引入新的靶向结构来解决靶向性的问题。Ji等利用肿瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)较多的特点，以表皮生长因子(EGF)作为靶向材料，连接在PEG修饰的载体上。与不含EGF的载体相比，表达效率明显提升。经过EGF修饰的载 体在含有EGFR细胞中的转染量比在不含EGFR细胞中转染量可高出约6倍，表现出了很好的靶向性。利用肿瘤细胞表面叶酸受体过表达这一特点，用用小分子叶酸为靶配体，连接在PEG修饰后的腺病毒载体末端，不仅降低了载体免疫原性，靶向性也显著提高。目前对腺病毒载体衣壳蛋白质进行修饰的方法主要有两类。第一类是化学方法，如采用低毒性的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等生物化学试剂包裹腺病毒,改变其天然嗜性，介导腺病毒高效靶向。第二类是通过分子生物学手段进行的遗传学修饰，即在腺病毒载体衣壳蛋白质结构中的纤维蛋白、六邻体蛋白、PlX等的DNA序列中嵌入外源小肽的DNA片段，使外源小肽与衣壳蛋白质融合表达于病毒颗粒表面；这些外源小肽可以提高腺病毒对细胞的靶向性及感染效率。近年来叶酸靶向性药物的研究得到广泛性开拓。叶酸进入细胞主要是由高亲和力的糖蛋白受体即叶酸受体(folate receptor, FR)介导内吞和内化作用。在正常细胞和组织，叶酸受体表达量很低，而在一些恶性肿瘤中细胞异常的分裂和生长，导致对叶酸需求量大大地增加。研究表明，FR在一些肿瘤，如肝癌，肺癌，卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾丸癌、脑瘤、结肠癌等高水平表达，这样FA可作为肿瘤的监测、影像及治疗的靶向性配体。
权利要求
1.叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物，其特征是为FA-Ad5-TRAIL，FA是叶酸，Ad5-TRAIL为用于肿瘤治疗的腺病毒Ad5-TRAIL，叶酸分子通过酯键与腺病毒Ad5_TRAIL的衣壳蛋白表面连接。
2.根据权利要求I所述的叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物，其特征是结构式为
3.如权利要求I或2所述叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物的制备方法，其特征是 FA在N，N’ - 二环己基碳二亚胺的催化下与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成活化后的叶酸FA-NHS ;活化后的叶酸FA-NHS与腺病毒Ad5_TRAIL在缓冲溶液中搅拌反应，使活化后的叶酸FA-NHS与腺病毒Ad5-TRAIL衣壳蛋白的氨基反应构成叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物，即 FA-Ad5-TRAIL。
4.根据权利要求3所述叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物的制备方法，其特征是包括以下步骤 I)、称取叶酸溶于无水二甲基亚砜中，加入N, N’ - 二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，叶酸N，N’ - 二环己基碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺=1 :1. I I. 3 :1. 8 2. 2的摩尔比，避光40 50°C搅拌10 14小时； 反应结束，离心；所得的上清用丙酮萃取活化的叶酸，离心，所得的沉淀为活化的叶酸FA-NHS ； .2 )、将活化的叶酸FA-NHS溶于Tris缓冲液中，并加入Ad5_TRAIL的Tris溶液，叶酸Ad5-TRAIL的摩尔比=IO9:0. 95 I. 05 ；3 5°C搅拌2. 5 3. 5h，将反应液经G50纯化，得到纯化的FA-Ad5-TRAIL。
全文摘要
本发明公开了一种叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物，为FA-Ad5-TRAIL， FA 是叶酸，Ad5-TRAIL为用于肿瘤治疗的腺病毒Ad5-TRAIL，叶酸分子通过酯键与腺病毒Ad5-TRAIL的衣壳蛋白表面连接。本发明还同时提供了上述叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物的制备方法，FA 在N,N'-二环己基碳二亚胺的催化下与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成活化后的叶酸FA-NHS；活化后的叶酸FA-NHS与腺病毒Ad5-TRAIL在缓冲溶液中搅拌反应，从而生成FA-Ad5-TRAIL。本发明提高了腺病毒的靶向性，增加腺病毒对肿瘤的杀伤作用。
文档编号A61K39/235GK103251942SQ20131016006
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月3日 优先权日2013年5月3日
发明者徐涛, 陈文铎, 贾晓渊, 周伟 申请人:浙江理工大学