一种牛心朴子总生物碱及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛心朴子总生物碱，所述牛心朴子总生物碱是将牛心朴子的乙醇提取物用水溶解后，先以浓盐酸调节pH值，再以浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值，最后以有机溶剂萃取得到的，并提供了其制备方法和在制备预防和治疗肝癌或胃癌的药物中应用。本发明的有益效果为：本发明提供的一种牛心朴子总生物碱，是纯天然药物提取，取自天然的动植物，毒副作用相对较小，采用MTT法验证其体外对肝癌细胞和胃癌细胞的生长抑制作用，结果显示，牛心朴子总生物碱对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞BGC-823的体外增殖均表现出了较强的抑制作用，对BGC-823细胞比对HepG2细胞更为敏感；小鼠实验表明，不同剂量的牛心朴子总生物碱能明显抑制小鼠H22肝癌细胞的生长。
【专利说明】—种牛心朴子总生物碱及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中医药的提取和应用，具体涉及一种牛心朴子总生物碱及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]目前临床采用的治疗肝癌和胃癌的药物均呈现出不同程度的不良反应，如对造血系统的毒性作用，对胃肠道的强烈刺激作用等，致使患者难以接受，最终导致治疗失败。牛心子 Cynanchum komarovii Al Iljinski (Asclepiadaceae)属于萝摩科鹅绒藤属植物，其别名又称老瓜头、芦芯草等。生物碱是牛心朴子中的主要活性成分，从其中分离的7-脱甲氧基娃儿藤碱、氧化脱氧娃儿藤次碱，当浓度为lmg/ml时对P388白血病细胞的抑制率分别达到73.1%和87.5%，其生物碱在农业上对蚜虫、菜青虫也有一定防治作用，并对烟草花叶病毒(TMV)有特效。但到目前为止，尚未见牛心朴子总生物碱关于抗人肝癌和胃癌作用的报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种不良反应小，毒副作用低的牛心朴子总生物碱。
[0004]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种牛心朴子总生物碱，所述牛心朴子总生物碱是将牛心朴子的乙醇提取物用水溶解后，先以浓盐酸调节PH值，再以浓氨水或氢氧化钠水溶液调PH值，最后以有机溶剂萃取得到的。
[0005]进一步的，上述的一种牛心朴子总生物碱，所述牛心朴子的乙醇提取液是将牛心朴子以质量百分浓度为90%的乙醇回流提取后得到的。
[0006]进一步的，上述的一种牛心朴子总生物碱，所述浓盐酸调节pH值为1-2 ;所述浓氨水或氢氧化钠水溶液调节PH值为9-11 ;所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一种或几种。
[0007]进一步的，上述的一种牛心朴子总生物碱，所述浓盐酸调节pH值为2 ;所述浓氨水或氢氧化钠水溶液调节PH值为10 ;所述有机溶剂萃取为以等体积的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次。
[0008]本发明的第二个目的是提供了上述一种牛心朴子总生物碱的制备方法，包括以下步骤:
1)将牛心朴子以质量百分浓度为90%的乙醇溶液回流提取得到牛心朴子乙醇提取物；
2)将步骤I)得到的牛心朴子乙醇提取物以水溶解后，再以浓盐酸调节pH值为1-2，并过滤，得到酸性滤后牛心朴子乙醇提取物；
3)将步骤2)得到的酸性滤后牛心朴子乙醇提取物以浓氨水或氢氧化钠水溶液调节pH值为9-11，得到碱性牛心朴子乙醇提取物；
4)将步骤3)得到的碱性牛心朴子乙醇提取物以有机溶剂进行萃取，即得牛心朴子总生物碱。
[0009]进一步的，上述的一种牛心朴子总生物碱的制备方法，所述步骤I)中，牛心朴子的乙醇回流提取条件为以质量百分浓度为90%的乙醇，在温度75°C下提取4次；
所述步骤2)中，浓盐酸的质量百分浓度为36%，浓盐酸调节pH值为2 ;
所述步骤3)中，浓氨水的质量百分浓度为25%，氢氧化钠水溶液的质量百分浓度为4%，浓氨水或氢氧化钠水溶液调节pH值为10 ；
所述步骤4)中，有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一种或几种。
[0010]进一步的，上述的一种牛心朴子总生物碱的制备方法，所述步骤4)中的萃取步骤，具体操作为:常温下，用等体积的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次，或用其中的一种或几种有机溶剂依次萃取，合并萃取液，浓缩至无水分，再以无水乙醇洗涤，蒸干得到的浸膏，即为牛心朴子总生物碱。
[0011]本发明的第三个目的是提供了上述牛心朴子总生物碱在制备预防和治疗肝癌或胃癌的药物中应用。
[0012]本发明的有益效果为:本发明提供的一种牛心朴子总生物碱，是以西部广泛生长的草原植物牛心朴子为主体，采用乙醇提取，酸溶碱沉，有机溶剂萃取的方法分离得到，是纯天然药物提取，取自天然的动植物，毒副作用相对较小，采用MTT法验证其体外对肝癌细胞和胃癌细胞的生长抑制作用，结果显示，牛心朴子总生物碱对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞BGC-823的体外增殖均表现出了较强的抑制作用，对BGC-823细胞比对H印G2细胞更为敏感；同时，本发明还利用了鼠源性肝癌小鼠为研究对象，验证牛心朴子总生物碱对其肿瘤生长的影响，结果显示:不同剂量的牛心朴子总生物碱能明显抑制小鼠H22肝癌细胞的生长，其抑瘤率分别达到了 51.7%,46.6%和42%，为临床治疗肝癌和胃癌药物的研制奠定了坚实的基础。`
【具体实施方式】
[0013]实施例1:
1、牛心朴子总生物碱的制备:
首先将牛心朴子草粉碎成粉末状。第一次采用牛心朴子质量5-8倍的比例加入90%乙醇热回流提取l_3h ;第二次按照牛心朴子质量2-5倍的比例加入90%乙醇热回流提取l_2h。两次的提取液合并浓缩至干，加适量水溶解，用IM的浓盐酸调pH值到1-2，静置12-18h后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9-11，然后用有机溶剂(氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚的一种或几种混合)萃取2-3次，萃取液合并浓缩至干，得到牛心朴子总生物碱提取物。
[0014]2、牛心朴子总生物碱提取物抗肝癌和胃癌的体、内外药理学试验:
本发明首先采用经典的MTT方法(李仪奎.中药药理实验方法学，2006，10:783)研究了牛心朴子总生物碱提取物在体外条件下对2种肿瘤细胞(HepG2细胞和BGC-823细胞)的抑制活性，结果表明，牛心朴子总生物碱提取物均具有良好的抑制HepG2和BGC-823肿瘤生长的活性。为了进一步证实牛心朴子总生物碱提取物的抗肝癌肿瘤生长作用，本发明研究了牛心朴子总生物碱提取物对小鼠H22肝癌肿瘤生长的影响(李仪奎.中药药理实验方法学，2006，10:778-779)。结果显示，牛心朴子总生物碱提取物能明显抑制H22肿瘤的生长。以上结果提示，牛心朴子总生物碱提取物可以用于制备抗肿瘤药物。
[0015]具体操作过程如下:
1、制备牛心朴子总生物碱:
称取牛心朴子草0.5kg置于圆底烧瓶中，加入90%乙醇3L热回流提取2h，抽滤得滤液；再加入90%乙醇2L热回流提取lh，再抽滤，得滤液。两次的滤液合并浓缩至干，加0.5L蒸馏水溶解，用浓盐酸调pH值到1-2，静置15h后抽滤。滤液用IM氢氧化钠水溶液或浓氨水调PH值到9-11。每次加入0.6L氯仿萃取，共萃取3次，萃取液合并浓缩至干，得到牛心朴子总生物碱6.2g。
[0016]2、MTT法测定牛心朴子总生物碱对人HepG2细胞和BGC-823细胞生长的抑制作用:
利用经典的MTT方法(李仪奎.中药药理实验方法学，2006，10:783)分别测定了牛心朴子总生物碱对人肿瘤细胞(HepG2细胞和BGC-823细胞)的抑制率，以丝裂霉素作为阳性对照药。具体实验过程如下:
分别取对数生长期的ifepG2细胞和BGC-823细胞，弃去旧的培养液，加入0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液消化，加入完全培养液，轻轻吹打，使其形成单细胞悬液。收集细胞至离心管中，1000r/min,离心5min。弃去上清,沉淀加入培养基悬浮混勻，台盼蓝排斥法进行细胞计数，调整细胞密度为5 X IOVmL的细胞悬液。取96孔板，每孔加入细胞悬液100 μ L，使每孔细胞数为5X IO3个。混匀后置37°C、5%C02、饱和湿度培养箱培养24h后，每孔再加入用完全培养液配制的不同浓度的总生物碱溶液100 μ L，共设5个浓度梯度，由小到大依次为62.5 μ g/mL、125 μ g/mL、250 μ g/mL、500 μ g/mLUOOO μ g/mL，细胞对照组加 100 μ L 的完全培养液，阳性对照组加入不同浓度的丝裂霉素100 μ L(6.25 μ g/mL、12.5 μ g/mL,25 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL),`每个浓度设3个复孔。混匀后置37°C /5%C02、饱和湿度培养箱培养48h后，直接加入浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μ L，37°C /5% CO2、饱和湿度条件下培养4h，吸去上清液，每孔加入150 μ L DMS0，在水平摇床上充分振荡IOmin溶解，酶标仪490nm测定各孔OD值，每组实验重复三次。按下式计算牛心朴子总生物碱对各肿瘤细胞的抑制率,并计算半数抑制浓度(IC50)。
[0017]抑制率(％)=(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值X 100%
结果表明，不同浓度的牛心朴子总生物碱对HepG2细胞和BGC-823细胞的体外增殖均显示出了一定的抑制作用。其抑制率与牛心朴子总生物碱浓度呈现明显的剂量依赖关系。在牛心朴子总生物碱浓度为0.5mg/mL时，对H印G2和BGC-823这2种肿瘤细胞株的抑制率分别达到79.8%和82.7%，但均低于5-氟尿嘧啶的抑制率(牛心朴子总生物碱对肿瘤细胞的抑制率数据如表I所示)，并且对H印G2细胞和BGC-823细胞的体外增殖抑制IC50值分别为163.0 μ g/mL和117.4 μ g/mL(牛心朴子总生物碱对肿瘤细胞抑制作用的IC50数据如表2所示)，由此结果可以看出，牛心朴子总生物碱对胃癌细胞BGC-823比对肝癌H印G2细胞更
加敏感。
[0018]
【权利要求】
1.一种牛心朴子总生物碱，其特征在于，所述牛心朴子总生物碱是将牛心朴子的乙醇提取物用水溶解后，先以浓盐酸调节pH值,再以浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值，最后以有机溶剂萃取得到的。
2.根据权利要求1所述的一种牛心朴子总生物碱，其特征在于，所述牛心朴子的乙醇提取液是将牛心朴子以质量百分浓度为90%的乙醇回流提取后得到的。
3.根据权利要求2所述的一种牛心朴子总生物碱，其特征在于，所述浓盐酸调节pH值为1-2 ;所述浓氨水或氢氧化钠水溶液调节pH值为9-11 ;所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的一种牛心朴子总生物碱，其特征在于，所述浓盐酸调节pH值为2 ;所述浓氨水或氢氧化钠水溶液调节pH值为10 ;所述有机溶剂萃取为以等体积的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种牛心朴子总生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将牛心朴子以质量百分浓度为90%的乙醇溶液回流提取得到牛心朴子乙醇提取物； 2)将步骤I)得到的牛心朴子乙醇提取物以水溶解后，再以浓盐酸调节pH值为1-2，并过滤，得到酸性滤后牛心朴子乙醇提取物； 3)将步骤2)得到的酸性滤后牛心朴子乙醇提取物以浓氨水或氢氧化钠水溶液调节pH值为9-11，得到碱性牛心朴子乙醇提取物； 4)将步骤3)得到的碱性牛心朴子乙醇提取物以有机溶剂进行萃取，即得牛心朴子总生物碱。
6.根据权利要求5所述的一种牛心朴子总生物碱的制备方法，其特征在于， 所述步骤I)中，牛心朴子的乙醇回流提取条件为以质量百分浓度为90%的乙醇，在温度75°C下提取4次； 所述步骤2)中，浓盐酸的质量百分浓度为36%，浓盐酸调节pH值为2 ； 所述步骤3)中，浓氨水的质量百分浓度为25%，氢氧化钠水溶液的质量百分浓度为4%，浓氨水或氢氧化钠水溶液调节pH值为10 ； 所述步骤4)中，有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的一种牛心朴子总生物碱的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的萃取步骤，具体操作为:常温下，用等体积的二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯依次各萃取3次，或用其中的一种或几种有机溶剂依次萃取，合并萃取液，浓缩至无水分，再以无水乙醇洗涤，蒸干得到的浸膏，即为牛心朴子总生物碱。
8.根据权利要求1-4任一所述的牛心朴子总生物碱在制备预防和治疗肝癌或胃癌的药物中应用。
【文档编号】A61K36/27GK103446211SQ201310436974
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】蒲秀瑛, 王鸣刚, 王恒瑞, 樊文博, 于双 申请人:兰州理工大学