一种视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系的制作方法
【专利摘要】本发明属微生物动物细胞系领域，涉及一种视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系及其建立方法。本细胞系为鼠源性细胞，与原代培养的视网膜小胶质细胞有不到1%的基因差异且均不涉及主要功能蛋白；能自我增殖，连续传代；能表达单核-巨噬细胞表面抗原CD11b(OX42),ED1(OX6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF-а、IL-1β与iNOS等致炎因子；经体内移植后能被高效定向募集到视网膜损伤部位并存活，进一步促进光感受器存活。本发明细胞系可用于视网膜光感受器变性疾病的防治研究，并可作为从外周-中枢（视网膜）的药物载体。CGMCC No815820130903
【专利说明】一种视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系
【技术领域】
[0001]本发明属微生物动物细胞系领域，涉及大鼠视网膜小胶质细胞系，具体涉及一种视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系，尤其是一种能被高效募集到视网膜的大鼠视网膜小胶质细胞系及其建立方法。
【背景技术】
[0002]研究报道，视网膜退行性疾病是一大类严重的致盲性眼病，其中以视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)最为常见。随着角膜病、白内障等可预防性和可治疗性盲的减少，这一类疾病已成为世界范围内致盲的主要眼病。虽然近年来对其发病机制及病理生理过程的研究使得人们对这一类疾病形成了更为深刻的认知，并视网膜及干细胞移植等方面都取得了一定的进展，然而医疗实践中依然无法从根本上实现“对因治疗”。在致伤因素不能去除的情况下，如何延缓光感受器进行性变性、衰退的过程，依然是当今视网膜变性疾病防治研究领域中的热点。
[0003]近年来，作为CNS病理事件“传感器”的小胶质细胞(MG)的功能调控日益成为各国研究者关注的焦点。研究显示，在病理模型如脑缺血模型中，驻留型MG能够分泌转化生长因子-beta (TGF-beta)和胶质源性神经营养因子(⑶NF)，从而减轻神经元的缺血性损伤，给予外源性MG也能够增加缺血海马回部位⑶NF和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，对受损神经元产生营养因子依赖性的保护作用；尤其值得一提的是，作为CNS游走巨噬细胞，MG在病理状态下受到损伤信号的趋化能迅速聚集到受损的神经元周围甚至可以从外周途径穿越血屏障进入CNS。在本申请已公开的前期工作中，发现强光照射引起光感受器凋亡，凋亡信号诱导视网膜MG向光感受器层聚集，那么是否可以利用MG这一天然的行为特征将其作为活的生物学工具，从而为视网膜光感受器变性疾病创建一个新颖却又安全可靠的从外周——中枢的功能细胞转运体系？
单核吞噬细胞包括MG的定向迁移能力受归巢受体的调控，其中又以CC-趋化因子受体
2(CCR2)的作用最为重要。有研究在小鼠的多发性硬化的模型中发现，CCR2与单核巨噬细胞向脑内的浸润有关；CCR2对于巨噬细胞向海马回轴突损伤部位的募集是必需的；CCR2基因静默将阻碍MG的趋化聚集从而加速Alzheimer’ s病的进展。在已公开的体外研究中，成功构建了 Lent1-CCR2载体并将其转染原代培养的大鼠视网膜MG，被转染的MG能大量表达CCR2蛋白并在体外趋化实验中显示出对CCL2的高趋化性。而在视网膜中，光感受器是CCL2的主要来源，损伤状态下其表达明显上升，成为吸引外源性MG进入损伤部位发挥生物学作用的关键因子。尽管有研究表明在从外周途径进入CNS的过程中，成熟的MG较巨噬细胞而言对神经组织具有更高的亲和力，然而从可行性方面考虑，从患者自身的视网膜分离获取MG再进行外周移植是不现实的，因此需要寻找其他替代细胞来源。由于小胶质细胞在体外培养环境中无法自我增殖，建立功能细胞转运体系的另一个瓶颈就是缺乏足够的细胞数量，现有技术已公开的小胶质细胞系有BV2、N9等，但其来源均为大脑组织，因此建立可靠的视网膜来源的能自我增殖并向视网膜高趋化的小胶质细胞系是当务之急。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种能被高效募集到视网膜的鼠视网膜小胶质细胞系一T-MG。本发明的视网膜高趋化性的小胶质细胞系能用于视网膜光感受器变性疾病的防治研究。
[0005]本发明通过慢病毒转染的方法构建能自我增殖并向视网膜高趋化的小胶质细胞系(T-MG)。本发明基于成功构建了 Lent1-SV40-eGFP慢病毒载体的基础上，将病毒进行包装后转染原代培养的视网膜小胶质细胞(T-MG)，成功转染后采用基因芯片的方法比较转染前后的细胞其基因表达谱的变化，结果显示仅有1%为差异基因，其生长性、吞噬性、主要生物学功能(分泌致炎因子、神经营养因子等)与亲本细胞保持一致并能自我增殖。进一步对T-MG的趋化能力进行测定，将T-MG细胞置于趋化小室的上端，下端放置不同浓度的CCL2，结果显示T-MG细胞能被CCL2趋化进入下室其趋化效应呈一定的时间依赖性和浓度依赖性，并且与原代培养的MG相比其趋化性明显增强。在以上实验的基础上，本发明将16的T-MG细胞通过尾静脉注射和玻璃体腔注射的方式移植入光损伤大鼠模型，结果显示光照后3d，视网膜上可发现少量GFP (+)细胞，其数量逐渐增多于14d时达到高峰，28d时仍可见较多，T-MG移植组视网膜外核层厚度较对照组增厚，显示出初步的神经保护作用。
[0006]更具体的，本发明采用原代培养的SD大鼠视网膜小胶质细胞，通过构建Lent1-SV40-eGFP慢病毒载体进行转染并用有限稀释法挑取单克隆、体外扩增和传代等策略，分离得到了具有自我增殖能力并向视网膜高趋化的大鼠视网膜小胶质细胞系(T-MG)，已于2013年9月3日保藏，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号:CGMCC N0.8158,分类命名:大鼠视网膜小胶质细胞株Retinal microglia cell。
[0007]本细胞系具有以下生物学特性:经基因芯片检测(20，001 probes)，仅有不到200个基因(1%)与原代培养的视网膜小胶质细胞有差异且均不涉及主要功能蛋白；T-MG能表达单核-巨噬细胞表面抗原⑶Ilb (0X42)，EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF-a、IL-1 β与iNOS等致炎因子，这些小胶质细胞的主要功能并未受慢病毒转染的影响。最为关键的是T-MG能自我增殖，连续传代(验证了 10代)并未影响细胞性状；体外趋化实验显示T-MG能被CCL2趋化，并且其趋化能力较原代小胶质细胞明显增强；体内移植实验(尾静脉注射途径和玻璃体腔注射途径)证实T-MG能够进入视网膜并存活下来，并且视网膜切片的HE染色显示，光照后14d，T-MG移植组视网膜外核层厚度较对照组(Sham移植组)为厚，差异具有统计学意义，显示能自我增殖并向视网膜高趋化的小胶质细胞系(T-MG)的体内移植能延缓视网膜光感受器的变性过程。
[0008]本发明的细胞系具有以下特点:
1)遗传背景清楚，生物学特性稳定，
该细胞系来自于广泛使用的鼠视网膜小胶质细胞，其生长、吞噬能力、分泌致炎因子等基本生物学特性与原代细胞一致，经多次传代及修饰后仍保持稳定；
2)应用面宽，适用于多种视网膜光感受器变性模型，
该细胞系可用于延缓强光照射引起的光感受器变性实验，也可用于研究视网膜神经元损伤后趋化因子及其受体系统在调节小胶质细胞趋化中的作用； 3)该细胞系培养条件简单，趋化能力强，实验周期短，
该细胞系移植入光损伤大鼠模型后能够进入损伤部位存活，并表现出一定的神经保护作用。
[0009]本发明细胞系为视网膜光感受器变性疾病提供了一个新颖且安全可靠的从外周-中枢的功能细胞转运体系，可以方便的用于视网膜光感受器变性疾病的防治研究，并可作为从外周-中枢(视网膜)的药物载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1:显示了 Lent1-SV40-eGFP转染原代培养的视网膜小胶质细胞后7d，所得的细胞(T-MG)能自我增殖并传代，免疫荧光染色结果显示T-MG能表达小胶质细胞的标志物CDllb (0X42)， EDl (0X6)， Ibal。
[0011]图2:显示了免疫荧光染色显示光照后14d，视网膜上存在GFP(+)细胞(绿色)并表达了 MG标记物EDl (红色)，从垂直分布来看，GFP(+)细胞逐渐向光感受器层即损伤部位迁移，To-to-3复染。
【具体实施方式】
[0012]实施例1视网膜高趋化性的小胶质细胞的建系
本发明所涉及的细胞均培养于含10%胎牛血清(FCS)的Leibovitz’s L_15细胞培养基中。培养温度为37° C，气体环境为5% C02/95%空气，湿度为饱和湿度。传代时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，按1:3的比例传代。
[0013]1.原代视网膜小胶质细胞的培养:
取出生3d的SD乳鼠，无菌条件下取出眼球，置于盛有预冷的D-Hank’ s液体的平皿中，在组织显微镜下取出视网膜，小心剥除视网膜血管，加入适量0.25%胰蛋白酶，37°C孵育消化15 mir1加入等体积预冷的含血清培养液终止消化,I 000 r/min离心10 min,弃去上清液，沉淀物用适量含10% (体积分数)胎牛血清的培养液重新混悬，调整细胞密度至IXlO6 /mL，将10 mL细胞悬液接种到多聚赖氨酸(12.5 mg/L)包被过的T75细胞培养瓶中，置37°C，5% (体积分数)CO2孵箱中培养，静置2d后首次换液，以后每4d换液I次。细胞培养到14d时，将T75细胞培养瓶置于恒温摇床上，100 r/min的速度振摇I h，将上清液转移到50 mL离心管中，1500 r/min离心10 min,沉淀用含血清的培养液重新混悬，即可得到纯化的原代视网膜小胶质细胞。
[0014]2.按现有技术构建Lent1-SV40_eGFP慢病毒载体；
3.病毒感染原代培养的小胶质细胞
病毒感染前24小时将细胞置于6孔板,每孔细胞量约为5X 105。加入2 ml适当的完全培养基(含有血清和抗生素)孵育过夜。在转染当天细胞应该达到约50 — 70%平铺；在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混勻，准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene终浓度为:8 Pg/ml。胰酶消化每孔细胞，收集细胞后用1.5ml培养基混合物溶于每孔中，加入病毒液(梯度为10，20，50ul/孔)感染细胞，轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜，待细胞贴壁。
[0015]4.挑选克隆在显微镜下确定克隆的位置后用marker笔在培养器皿的外部底面划圈,先PBS洗漆一次后，再加入37度预热的5% tripsin-PBS溶液(即Iml标准trypsin-EDTA溶液与19mlPBS混合而成)，后用200ul灭菌黄枪头直接在标记的克隆位置反复洗吹使细胞完全消化后转移至事先已加入培养液的24孔板内，将所得到的细胞进行传代，体外长期培养逾10代，成为连续传代的细胞系，命名为T-MG。
[0016]本发明通过构建慢病毒载体转染原代培养的视网膜小胶质细胞并通过克隆挑选策略，分离得到了能自我增殖并向视网膜高趋化的小胶质细胞系(T-MG)，该细胞系体外培养生长良好，每4天传代一次。
[0017]T-MG经基因芯片检测(20，001 probes)，仅有不到200个基因(1%)与原代培养的视网膜小胶质细胞有差异且均不涉及主要功能蛋白，T-MG能自我增殖，在体外连续传代及培养过程中具有遗传稳定性。
[0018]本发明采用ELISA、吞卩遼实验、Real-time PCR、Western_blot等分子生物学检测方法证实T-MG能表达单核-巨噬细胞表面抗原⑶IIb (0X42)，EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF- a、IL_1 β与iNOS等致炎因子；体外趋化实验显示T-MG能被CCL2趋化，并且其趋化能力较原代小胶质细胞明显增强。
[0019]实施例2，T-MG细胞的体内移植
1.大鼠视网膜光损伤模型的建立:
所有实验用大鼠均在12h明(20?50 Lux)以及12h暗(O?10 Lux)的循环光环境下适应7d，光照组大鼠予缝线开睑，I %阿托品扩瞳，经24h暗适应后，放入光照箱中接受24h2500Lux宽谱蓝光照射,光照结束后置于黑暗中恢复24h后送回原正常环境饲养；
2.T-MG细胞在光损伤大鼠模型中的体内移植:
①光照后ld，将SD大鼠麻醉后，通过尾静脉注射和玻璃体腔注射两种方法将16个T-MG细胞进行体内移植，移植后的7d、14d、28d常规处理大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，制作双眼眼球切片及视网膜铺片；由于T-MG细胞携带GFP基因，因此在荧光显微镜下可以观察到绿色的阳性细胞；光照后3d，视网膜上发现少量GFP (+)细胞，其数量逐渐增多于14d时达到高峰，28d时仍可见较多；结果显示，从水平空间分布来看，GFP (+)细胞主要围绕血管分布，其密度在各象限之间无明显差别；从垂直分布来看，GFP(+)细胞逐步向ONL层迁移，能够进入视网膜损伤部位；
②视网膜切片的HE染色显示，光照后2周，T-MG移植组的视网膜外核层厚度较对照组明显增厚，表明T-MG细胞的体内移植能促进光感受器的存活。
【权利要求】
1.一种视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系，其特征在于，所述的细胞系为能被高效募集到视网膜的大鼠视网膜小胶质细胞系，其保藏编号=CGMCC N0.8158，具有以下生物学特性:为鼠源性细胞，经基因芯片检测(20，OOl probes)，仅有不到200个基因(1%)与原代培养的视网膜小胶质细胞有差异且均不涉及主要功能蛋白；能表达单核-巨噬细胞表面抗原⑶I Ib (0X42)，EDl (0X6)、具有吞噬能力并且在LPS的刺激下能分泌TNF- a、IL-1 β与iNOS等致炎因子；能自我增殖，连续传代；其趋化能力较原代小胶质细胞明显增强；能通过体内移植实验进入视网膜并存活。
2.按权利要求1所述的视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系，其特征是所述的细胞系其生物学特性经多次传代及修饰后保持稳定。
3.按权利要求1所述的视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系，其特征是所述细胞系在体外趋化实验中能被CCL2高效趋化。
4.按权利要求1所述的视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系，其特征是所述细胞系体内移植后能被高效定向募集到视网膜损伤部位并存活，具有促进光感受器存活作用。
5.权利要求1的视网膜高趋化性的大鼠视网膜小胶质细胞系在制备从外周-中枢(视网膜)的药物载体中的用途。
【文档编号】A61K47/46GK104513808SQ201310459318
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】倪颖勤, 徐格致, 蒋小爽, 张萌, 江睿, 刘天津 申请人:复旦大学附属眼耳鼻喉科医院