一种展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种展毛翠雀提取物的新用途，该新用途是展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用。所述展毛翠雀提取物是按如下方法制备的：以展毛翠雀为原料，先提取挥发油，再用不同浓度乙醇提取，最后用低浓度盐酸水溶液提取制备得到。本发明所提供的展毛翠雀提取物对制备抗癌药物具有重要意义。
【专利说明】一种展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物在制备抗癌药物中的应用，具体是涉及一种展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]据2010年2月卫生部统计资料，每年全球癌症死亡人数达1000万。目前全球四分之一人口死亡的原因是癌症所致，并预测按目前的趋势发展下去，到2050年将有二分之一的死亡者是由于患了癌症。我国恶性癌发病率以每年2.5-5%速度增长，已成为严重危害人类生命的兀凶。在各种类型的癌症当中以肺癌、胃癌、肝癌等发病率较闻。
[0003]血管为正常组织器官的形成发生于功能维护所必需，它与人体发育失调和多种病因导致的种种疾病密切相关。肿瘤新血管形成在肿瘤发生、发展、转移和复发起举足轻重作用。一系列研究表明只要有效抑制肿瘤新血管形成，就能抑制肿瘤生成、转移和复发。此外，糖尿病和风湿性关节炎等疾病都有血管增生，其血管异常与肿瘤血管非常相似。因此，血管增生抑制剂也可用于治疗糖尿病和风湿性关节炎等血管增生性疾病。近年来，人们对肿瘤血管生成机制的研究不断深入，许多抗肿瘤血管生成的药物如Avastin、Angiostatin等相继被开发出来，已在临床上推广应用。这类药物不但可以用于大多数实体瘤的治疗，还可以用于肿瘤的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗，同时对其他与血管生成有关的疾病如糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗，都具有一定的理论和现实意义。
[0004]肿瘤中的肿瘤细胞可分为两类。一类为普通的肿瘤细胞,一类为肿瘤干细胞。普通的肿瘤细胞具有快速分裂，对抗肿瘤药敏感，没有自身更新能力等特点。因此普通的肿瘤细胞在分裂一定代数后会死亡。肿瘤干细胞则具有如下特点:通常情况下处于静止状态，及不分裂状态，对抗肿瘤药不敏感，具有自身更新能力，即具有无限繁殖的能力。在肿瘤化疗中，大量的肿瘤细胞被杀死(因为对化疗药敏感)，然而肿瘤干细胞会生存下来(因为对化疗药不敏感)。肿瘤的复发是由于肿瘤化疗药对肿瘤干细胞无效。找能有效治疗肿瘤干细胞的药物是当前的一个方向。能否根除肿瘤的关键不在于能否杀灭普通的肿瘤细胞，而在于根除肿瘤干细胞。
[0005]中医药治疗癌症的历史源远流长，迄今已有紫杉、喜树、砒霜、绿茶、灵芝、人参、长春花、天门冬、半枝莲、天葵子等用于临床治疗癌症，取得了一些较好的效果。长期以来，人们应用传统思维、理念和方法研发抗癌中草药，虽然已取得了进步，但收效甚微。迄今中草药尚未在国内外成为首选抗癌药物，现有临床中草药的抗癌疗效丞需进一步提高。因此，研发中草药抗癌药物是目前治疗恶性癌的当务之急，而阐明内源性低分子抑瘤物的化学本质是这一领域研究的核心问题。
[0006]展毛翠雀为为毛茛科植物展毛翠雀Delphinium kamaonense Huth var.glabrescens (W.T.Wang) W.T.Wang及同属数种植物的干燥地上部分。6~8月采集,晾干。收载于《中华人民共和国卫生部药品标准藏药(第一册)》，标准编号:WS3-BC-0088-95。性凉，味苦。具有清热，止泻痢，愈疮之功效。用于肠热腹泻，痢疾；外敷疮口。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关展毛翠雀的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明，展毛翠雀含有生物碱类成分；展毛翠雀药理作用研究未见报道。
[0007]国内专利检索结果，未见展毛翠雀相关专利。
[0008]上述文献及专利等，尚未见展毛翠雀或展毛翠雀提取物抗癌作用研究的报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用。
[0010]本发明是通过如下技术方案实现的:
本发明所用展毛翠雀为毛茛科植物展毛翠雀Delphinium kamaonense Huth var.glabrescens (ff.T.Wang) ff.T.Wang及同属数种植物的干燥地上部分。
[0011]本发明一种展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用，所述展毛翠雀提取物是按如下方法制备得到:
(1)展毛翠雀，粉碎，过10-50目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度400C -50°C、萃取压力20-30MPa、萃取时间l_2h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取 物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用；
(2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度30%-75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50°C-95°C，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的6-15倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度1%_5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60°C-80°C,提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的10-15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C，其中一种或两种或三种按一定比例混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
[0012]展毛翠雀提取物是按如下方法制备得到:
(1)展毛翠雀，粉碎，过10-50目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度400C -50°C、萃取压力20-30MPa、萃取时间l_2h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用；
(2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度30%-75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50°C-95°C，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的6-15倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度1%_5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60°C-80°C,提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的10-15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
[0013]优选的展毛翠雀提取物是按如下方法制备得到:
(I)展毛翠雀，粉碎，过30目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度45°C、萃取压力25MPa、萃取时间1.5h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用；
(2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度60%乙醇溶液作为溶剂，提取温度70°C，提取次数为2次，每次提取时间为2.5小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的12倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度3%盐酸溶液作为溶剂，提取温度70°C，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的12倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。 [0014]本发明所述的展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用，尤其是在制备抗肝癌药物、抗肺癌药物、抗结肠癌药物中的应用。
[0015]本发明的展毛翠雀展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制备抗癌药物中的应用。
[0016]本发明的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制备抗肝癌药物、抗肺癌药物、抗结肠癌药物中的应用。
[0017]本发明的展毛翠雀提取物与化学药或中药或天然药物组成的抗癌药物。
[0018]本发明的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C与化学药或中药或天然药物组成的抗癌药物。
[0019]本发明的展毛翠雀提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
[0020]本发明的展毛翠雀各提取物对多种肿瘤细胞的抑制作用。实验结果表明，展毛翠雀各提取物对人肝癌细胞BEL-7402、人肝癌细胞H印G-2、结肠癌细胞HCT-8和肺癌细胞A-549均有一定程度的抑制作用。展毛翠雀提取物对人肝癌细胞BEL-7402、人肝癌细胞H印G-2、结肠癌细胞HCT-8和肺癌细胞A-549的抑制率分别为72.61%,43.86%,61.24%、
68.88%o
【具体实施方式】
[0021]下面通过具体实验例和实施例对一种展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。
[0022]实施例1:展毛翠雀提取物的制备
(1)展毛翠雀15kg，粉碎，过30目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度45°C、萃取压力25MPa、萃取时间1.5h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用；
(2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度60%乙醇溶液作为溶剂，提取温度70°C，提取次数为2次，每次提取时间为2.5小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的12倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度3%盐酸溶液作为溶剂，提取温度70°C，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的12倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
[0023]实施例2:展毛翠雀提取物的制备
(1)展毛翠雀20kg，粉碎，过10目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度50°C、萃取压力20MPa、萃取时间2h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用；
(2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度30%乙醇溶液作为溶剂，提取温度95°C，提取次数为I次，每次提取时间为4小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的15倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3 )将步骤(2 )得到的药渣B，用浓度5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60 V，提取次数为3次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的10倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
[0024]实施例3:展毛翠雀提取物的制备
(1)展毛翠雀18kg，粉碎，过50目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度40°C、萃取压力30MPa、萃取时间lh，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用；
(2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50°C，提取次数为3次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的6倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ；
(3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度1%盐酸溶液作为溶剂，提取温度80°C，提取次数为I次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ；
(4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
[0025]实施例4:展毛翠雀提取物片的制备
取实施例1展毛翠雀提取物345g，加入淀粉105g，混匀，制粒，干燥，过筛，加微晶纤维素35g，硬脂酸镁5g，混匀，压制成1000片，即得展毛翠雀提取物片。
[0026]实施例5:展毛翠雀提取物颗粒的制备
取实施例2展毛翠雀提取物345g，加入糊精95g，蔗糖65g，混匀，制粒，干燥，整粒，即得展毛翠雀提取物颗粒。
[0027]实施例6:展毛翠雀提取物胶囊的制备 取实施例3展毛翠雀提取物345g，加淀粉85g，混匀，制粒，干燥，整粒，装胶囊1000粒，即得展毛翠雀提取物胶囊。
[0028]实验例1:展毛翠雀各提取物在抑制肿瘤细胞生长中的应用
将对数生长的肿瘤细胞(人肝癌细胞H印G-2、人肝癌细胞BEL-7402、人结肠癌细胞HCT-8、人肺癌细胞A-549)用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用含10%(体积百分含量)胎血清的DMEM完全培养基悬浮细胞，制成细胞悬液，并分别将各肿瘤细胞稀释至1.0 X IO5个/ml,再将其接种至96孔培养板中，每孔200uL，各肿瘤细胞分别接种6个孔，于37°C，5%C02的培养箱内培养24h ;然后倾去各孔培养液。
[0029]将按实施例1方法制得的展毛翠雀提取物、展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C(批号分别为20110506、20110507、20110508、20110509)分别溶解于DMSO中，然后用DMEM完全培养基进行稀释，得到展毛翠雀各提取物的溶液，展毛翠雀各提取物的终浓度为50ug/mL，其中，DMSO的浓度为10%(体积百分含量)。
[0030]实验组:将展毛翠雀各提取物溶液依次分别加入上述肿瘤细胞IfepG-2，BEL-7402, HCT-8, A-549的培养孔内，各自接种3个孔，每孔加入200ul ;对照组:向上述各肿瘤细胞的培养孔内加入含10%(体积百分含量)DMS0的DMEM完全培养基，各自接种3个孔，每孔加入200ul ;将以上各组的培养板同时置于37°C，5% CO2的培养箱内培养2天。2天后向每孔加入20ul新鲜配制的5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液，并在37°C、5%C02的条件下继续培养4h ;小心弃上清，每孔加入200ul DMSO,室温放置15-20min，每5min振荡一次；在酶标仪上测定各孔在波长490nm处的光密度值(0D值)，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。
[0031 ] 抑制率(%) = (0D对照一OD实验)/OD对照X100%。
[0032]实验设三次重复，结果取平均数。展毛翠雀各提取物对人不同肿瘤细胞H印G-2、BEL-7402、HCT-8、A-549的抑制作用的结果如表1所示。
[0033]表1展毛翠雀各提取物对人不同肿瘤细胞的抑制作用。
【权利要求】
1.一种展毛翠雀提取物在制备抗癌药物中的应用，所述展毛翠雀提取物是按如下方法制备得到: (1)展毛翠雀，粉碎，过10-50目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度400C -50°C、萃取压力20-30MPa、萃取时间l_2h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用； (2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度30%-75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50°C-95°C，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的6-15倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ； (3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度1%_5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60°C-80°C,提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的10-15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ； (4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C，其中一种或两种或三种按一定比例混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
2.根据权利要求1所述展毛翠雀提取物是按如下方法制备得到: (I)展毛翠雀，粉碎，过10-50目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度400C -50°C、萃取压力20-30MPa、萃取时间l_2h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用； (2 )将步 骤(1)得到的药渣A用浓度30%-75%乙醇溶液作为溶剂，提取温度50°C -95°C，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的6-15倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ； (3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度1%-5%盐酸溶液作为溶剂，提取温度60°C-80°C,提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的10-15倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ； (4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
3.根据权利要求1所述展毛翠雀提取物是按如下方法制备得到: (1)展毛翠雀，粉碎，过30目筛，采用超临界二氧化碳萃取技术，萃取温度45°C、萃取压力25MPa、萃取时间1.5h，萃取挥发油，收集挥发油，即得展毛翠雀提取物A，超临界二氧化碳萃取后的药渣A备用； (2)将步骤(1)得到的药渣A用浓度60%乙醇溶液作为溶剂，提取温度70°C，提取次数为2次，每次提取时间为2.5小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的12倍；滤过，得提取液B和药渣B ;提取液B，回收乙醇，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物B ； (3)将步骤(2)得到的药渣B，用浓度3%盐酸溶液作为溶剂，提取温度70°C，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为展毛翠雀重量的12倍；滤过，合并提取液，浓缩干燥，即得展毛翠雀提取物C ； (4)上述展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C混匀，即得本发明的展毛翠雀提取物。
4.根据权利要求1所述的展毛翠雀提取物与化学药或中药或天然药物组成的抗癌药物。
5.根据权利要求1所述的一种展毛翠雀提取物在制备抗肝癌药物、抗肺癌药物、抗结肠癌药物中的应用； 根据权利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制备抗癌药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C在制备抗肝癌药物、抗肺癌药物、抗结肠癌药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的展毛翠雀提取物A、展毛翠雀提取物B、展毛翠雀提取物C与化学药或中药或天然药物组成的抗癌药物。
8.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3所述的展毛翠雀提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制 成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
【文档编号】A61K9/48GK103585292SQ201310525404
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】孔倩倩 申请人:济南星懿医药技术有限公司