一种组合物及其制备和在制备抗抑郁症药物中的应用的制作方法
【专利摘要】一种组合物，由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇按1:1～4的比例组成，或由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇按1:1～4的比例组成。所述组合物是从中药柴胡中提取分离得到。采用体外单胺类神经递质再摄取抑制实验，结果显示上述组合物对5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NA）和多巴胺（DA）的再摄取具有三重抑制作用，抑制率均高于逍遥散石油醚有效部位和柴胡石油醚部位，且抑制效果高于阳性对照药物氟西汀、地昔帕明和6-羟多巴。两种组合物可在制备预防和治疗抑郁症药物中应用。
【专利说明】一种组合物及其制备和在制备抗抑郁症药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及多炔类化合物的组合物，具体属于一种组合物及其制备方法，以及在制备抗抑郁症药物中的应用。
【背景技术】 [0002]抑郁症是一种常见的精神疾病，具有发病率高、复发率高和高致残的特点。据WHO预测到2020年，单项抑郁症将成为第二大致残性疾病，其危害已越来越引起医药卫生界的重视。
[0003]现代医学研究表明，抑郁症发病机理复杂，诱发原因较多，临床症候多样。对于发病机制经近半个世纪的研究，最为人们所认同的是，抑郁症的单胺假说即抑郁症是由于人脑单胺类神经递质，5-HT.NA和/或DA缺损所致。现在临床上所用的主要的抗抑郁药物是通过抑制突触间隙5-HT和NA的再摄取增加突触间隙中单胺递质浓度。但合成抗抑郁药物存在抗抑郁谱窄，起效时间慢，以及毒副作用大等缺点。因此，国内外开始注意从传统药物和天然药物中研制与开发具有抗抑郁活性的药物。
[0004]逍遥散为经典名方，至今已有近千年的应用历史。现代临床与药理研究已证实其具有明显的抗抑郁作用，且未发现毒副作用。本课题组前期对逍遥散各部位进行了体外和体内药理活性研究，筛选出了石油醚活性部位，发现其抗抑郁疗效方面明显优于原复方，甚至超过了西药的活性，已申请专利(ZL201010110283.7)，但其仍存在物质基础不明确等问题。本研究基于对药效物质基础的研究，以血清药物化学为指导，对君药柴胡的化学成分进行研究，发现其中多炔类化合物的含量较高，且能够入血，可能为抗抑郁的有效成分，因此对其进行深入的研究。
[0005]目前，从其他属植物中分离得到的多炔类成分曾被研究者报道具有显著的活性作用。例如人参炔三醇具有的抗肿瘤细胞的作用；从苍术中已经分离得到20余种聚乙炔类化合物，具有防止胃损伤、抗炎、利胆及黄嘌呤氧化酶阻碍等作用。近年来报道，已从柴胡属的植物中提取分离得到17种多炔类的化合物，其中柴胡毒素和乙酰柴胡毒素具有显著的神经毒性和细胞毒性作用，其它化合物未见活性或毒性的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种组合物及其制备方法，以及该组合物在制备抗抑郁症药物中的应用。
[0007]本发明发明人在长期从事逍遥散研究和开发的基础上，采用传统的提取分离方法，同时采用血清药物化学与高效液相色谱跟踪法，从君药柴胡药材中提取分离得到4种多炔类化合物(命名为RB-1、RB-2、RB-3、RB-4)。这四个化合物的在自然条件下浓缩、放置均不稳定，12h内会发生互变现象，最终只能得到分别含RB-1和RB-2的组合物1、RB-3和RB-4的组合物2。这两个组合物具有抗抑郁活性。
[0008]一种组合物，即组合物1，由(2Z，8Z, 10E) -2, 8，10-十五烷三烯_4，6_ 二炔-1-醇和(2Z, 8E, 10E) -2, 8，IO-十五烷三烯_4，6- 二炔-1-醇组成。
[0009]一种组合物，即组合物2，由(2Z，8Z, 10E) -2, 8，10-十七烷三烯_4，6_ 二炔-1-醇和(2Z, 8E, 10E) -2, 8，10-十七烷三烯_4，6- 二炔-1-醇组成。
[0010]组合物的制备方法，步骤包括:
[0011](I)柴胡石油醚部位制备:将柴胡用95%乙醇浸泡，回流提取，提取液浓缩得浸膏，浸膏用石油醚萃取，得到柴胡石油醚部位；
[0012](2)柴胡石油醚部位的粗分离:将柴胡石油醚部位，加入到硅胶层析柱，依次用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:8至100:20的部分，得到含目标化合物的粗品；
[0013](3)纯化:将粗品再经硅胶层析柱和Sephadex LH-20凝胶柱除杂,溶解于9:1的甲醇-氯仿溶剂中，滤膜过滤，备用；
[0014](4)制备:色谱条件:色谱柱 Agela (Venusil MP C18,10X 100mm, 1.d.10 μ m),流动相:甲醇:水=85:15，检测波长:315nm，柱温:25°C，流速:4.0ml/min，进样量:200 μ I ；得到4个化合物的色谱峰，保留时间分别是8.0-12.0、12.1-16.5、17.0-21.0,22.0-30.0分钟，收集保留时间为8.0-16.5分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物1，收集保留时间为17.0-30.0分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物2。
[0015]本发明所述的化合物及其组合物是从中药柴胡中提取分离得到。实验中发现:当RBl和RB2、RB3和RB4分别以1:1~4的比例组成组合物的状态存在时较稳定。
[0016]采用NMR (1H-NMR, 13C-NMR, 1H-1H COSY)、UV 和 MS 等方法，对组合物 I 和组合物2中化合物的结构进行鉴定，组 合物I由(2Z，8Z，10E)-2,8, 10-十五烷三烯-4，6-二炔-1-醇和(2Z，8E, 10E) -2，8，10-十五烷三烯-4，6- 二炔-1-醇组成；组合物2由(2Z, 8Z, 10E)-2, 8，10-十七烷三烯 _4，6- 二炔-1-醇和(2Z, 8E, 10E)-2, 8，10-十七烷三烯-4，6-二炔-1-醇组成。
[0017]经体外试验证明，组合物I和组合物2能有效抑制5_HT、NA和DA的再摄取行为，其抑制率高于逍遥散和柴胡的石油醚部位，甚至高于阳性对照药物氟西汀、地昔帕明和6-羟多巴。组合物I和组合物2均可以在制备预防和治疗抑郁症的药物中应用。
[0018]说明书附图
[0019]图1组合物I的1H-1HCOSY谱图
[0020]图2组合物2的1H-1HCOSY谱图
【具体实施方式】
[0021]实施例1:组合物的制备
[0022]( I)柴胡石油醚部位制备
[0023]柴胡药材5kg，用95%乙醇浸泡12h，回流提取三次，提取液浓缩得浸膏，浸膏按照逍遥散复方石油醚部位的制备方法，使用石油醚萃取，得到柴胡石油醚部位。
[0024](2)柴胡石油醚部位的粗分离
[0025]称取上述柴胡石油醚部位样品220g，加入层析柱，用石油醚:乙酸乙酯作为洗脱系统。将上述硅胶柱依次用石油醚:乙酸乙酯比例为100:0~100进行梯度洗脱。以硅胶GF254薄层层析板、石油醚-乙酸乙酯为展开系统检测流份，薄层色谱监测组份有明显变化时，更换下一浓度洗脱梯度。结合高效液相色谱跟踪结果，收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:8至100:20的部分，得到粗品C-H共17.7g。
[0026](3)纯化:
[0027]取上述粗品(C-H) 17.7g拌样，采用干法上样，置于干燥硅胶粉(200-300目)170g层析柱(层析柱规格:直径3cm，高45cm)，依次用石油醚:乙酸乙酯比例为100:0~100进行梯度洗脱，结合高效液相色谱跟踪结果，收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:4至100:6的部分，得到 C-H-X8.9g。
[0028]取150mg样品C-H-X分别经过氯仿:甲醇(1:1) Sephadex LH-20凝胶柱，氯仿Sephadex LH-20凝胶柱进行分离，共得到63.9mg样品C-H-X-LJ。然后将样品C-H-X-LJ溶解于甲醇:氯仿(9:1)的Iml溶剂中，0.45 μ m滤膜过滤，备用。
[0029](4)组合物的制备
[0030]色谱条件:色谱柱(VenusilC18IOX 100mm, 1.d.10 μ m)，流动相:甲醇:水=85:15，检测波长:315nm，柱温:25°C，流速:4.0ml/min，进样量:200 μ I。
[0031]共得到 4个化合物的色谱峰，保留时间分别是11.56、12.81、19.34,22.89分钟，收集保留时间为11.56和12.81分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物1，收集保留时间为19.34,22.89分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物2。4个化合物命名标号分别为RB_1、RB_2、RB-3 和 RB-4。
[0032](5)稳定性实验 [0033]将制备得到的4个化合物的色谱峰分别收集，在自然条件下浓缩、放置，结果显示这四个化合物不能单独稳定存在，浓缩过程中发生互变现象，RB-1会得到比例为1:1~1.5的组合物I，RB-2会得到比例为1:2~4的组合物I ;RB-3会得到比例为1:1~1.5的组合物2，RB-4会得到比例为1:2~4的组合物2。故将RB-1和RB-2、RB-3和RB-4分别混合收集浓缩得到比例为1:1~4的组合物I和组合物2，并对其稳定性进行考察。
[0034]经实验室多次试验考察发现，顺反式比例为1:1~4时，2个月内于4°C且避光条件下保存稳定。长时间放置时会发生继续互变及降解现象。具体结果如表1所示。
[0035]表1稳定性考察结果表
【权利要求】
1.一种组合物，特征在于，其由(2Z，8Z，10E)-2,8, 10-十五烷三烯-4，6-二炔-1-醇和(2Z, 8E, 10E) -2, 8，10-十五烷三烯_4，6- 二炔-1-醇按1:1~4的比例组成。
2.一种组合物，特征在于，其由(2Z，8Z，10E)-2,8, 10-十七烷三烯-4，6-二炔-1-醇和(2Z, 8E, 10E) -2, 8，10-十七烷三烯_4，6- 二炔-1-醇按1:1~4的比例组成。
3.一种组合物的制备方法，其特征在于，步骤包括: (1)柴胡石油醚部位制备:将柴胡用95%乙醇浸泡，回流提取，提取液浓缩得浸膏，浸膏用石油醚萃取，得到柴胡石油醚部位； (2)柴胡石油醚部位的粗分离:将柴胡石油醚部位，加入到硅胶层析柱，依次用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:8至100:20的部分，得到含目标化合物的粗品； (3)纯化:将粗品再经硅胶层析柱和S^hadexLH-20凝胶柱除杂，溶解于9:1的甲醇-氯仿溶剂中，滤膜过滤，备用； (4)制备:色谱条件:色谱柱Agela (Venusil MP C18, IOX 100mm, 1.d.10 μ m),流动相:甲醇:水=85:15，检测波长:315nm，柱温:25°C，流速:4.0ml/min，进样量:200 μ I ;得到4个化合物的色谱峰，保留时间分别是8.0-12.0、12.1-16.5、17.0-21.0,22.0-30.0分钟，收集保留时间为8.0~16.5分钟的色谱峰浓缩至干，得到如权利要求1所述的组合物。
4.如权利要求3所述的一种组合物的制备方法，其特征在于，收集保留时间为17.0~30.0分钟的色谱峰浓缩至干，得到如权利要求2所述的组合物。
5.如权利要求1或2所述的组合物在制备抗抑郁药物中的应用。
6.如权利要求1或2 所述的组合物在制备功能食品中的应用。
【文档编号】A61K31/045GK103565781SQ201310546136
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】高晓霞, 周玉枝, 秦雪梅, 刘佳丽, 李震宇, 张丽增, 田俊生 申请人:山西大学