具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物，该提取物来自西瓜藤醇沉水提的石油醚部位。研究发现，该提取物具有良好的抗炎镇痛活性，可应用在临床治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛等病症中。本发明充分利用了农作物废弃物——西瓜藤的丰富资源，为今后深入研究开发其药用价值和临床意义提供了有力理论基础，以期为临床提供一种新的具有良好抗炎镇痛作用的现代中药制剂。
【专利说明】具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药提取物【技术领域】，尤其涉及一种具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]风湿性疾病是一类严重危害人类健康的全身性疾病，除了关节疼痛以外，还会累及身体其他部位，轻者疼痛、活动困难，重者关节畸形功能受限，以致不能正常学习、工作和生活，甚至危及生命，给病人带来巨大的生理和心理痛苦，也给家庭和社会带来沉重的经济负担。最近的调研数据显示，全球风湿病患者约有4亿人，是医学领域中最为庞大的一个疾病族群。在中国，有2亿多人不同程度地患有风湿性关节炎或类风湿性关节炎，其中有8000万重症患者。30岁以后的人群中，超过80%的人都有风湿骨痛病史，而且随着年龄的增长，发生率会逐渐增加，因此，对风湿类疾病的治疗以及预防显得尤为重要。常见风湿类疾病主要包括风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛等。因其病因复杂，目前对该类疾病的治疗主要在于改善症状，对重症疗效较差。而中药在此方面展示了重要的前景，并逐渐被人们所重视。
[0003]西瓜藤，为葫芦科植物西瓜(Citrullus Ianatus)的藤茎，其作为一种农作物废弃物，资源非常丰富，世界各地均有产出。目前已经证明西瓜具有清热利湿之功效，主治水泻，痢疾，烫伤，萎缩性鼻炎等症。国内学者对西瓜瓤、西瓜皮临床疗效方面也做了大量的报道，表明其具有杀菌抗炎作用，可治疗尿毒症、肾盂肾炎、小儿鹅口疮、慢性腹泻等病症。迄今为止，尚未见有关西瓜藤治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛等病症有效部位的研究报道和专利。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用，以充分利用农作物废弃物——西瓜藤的丰富资源，便于今后深入研究开发其药用价值和临床意义。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物，该提取物来自西瓜藤醇沉水提的石油醚部位。
[0006]该提取物主要包括以下十种化合物:β_谷留醇(β-sitosterol)、胡萝卜苷(daucosterol)、豆留醇(stigmasterol)、肉豆蘧酸甘油酯(monomyristin)、十六烧酸(palmitic acid)、棕榈酸甘油酯(Monopalmitin)、二十二烧酸甘油酯(monobehenin)、熊果酸(ursolic acid)、二十一烧酸甘油酯(monoheneicosanoin)、硬脂酸(stearic acid)。
[0007]上述具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物的制备方法，包括以下步骤:取西瓜藤晒干粉碎，按重量体积比5:1用体积浓度80%的乙醇溶液超声2h，然后浸泡10d，过滤，合并滤液，减压浓缩，得墨绿色浸膏 ，冷冻干燥得绿色粉末；按重量体积比3:50将绿色粉末分散于去离子水中，静置过夜，离心分出不溶于水的绿色黏稠固体悬浮物和水溶液；取水溶液用3倍体积的石油醚萃取样品，萃取液减压浓缩，回收溶剂，蒸干，得到石油醚部位。
[0008]上述具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物在制备治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛的药物方面的应用。
[0009]药物为胶囊、颗粒剂、片剂、溶液剂、丸剂或者注射剂。
[0010]胶囊为软胶囊，颗粒剂为干混悬剂，片剂为分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片，溶液剂为糖浆，丸剂为浓缩丸、滴丸、微丸。
[0011]上述具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物在制备辅助治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛的保健食品方面的应用。
[0012]发明人将农作物废弃物西瓜藤中进行醇沉水提，再由石油醚萃取获得石油醚部位的提取物。研究发现，该提取物具有良好的抗炎镇痛活性，可应用在临床治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛等病症中。发明人利用各种柱色谱等分离技术及重结晶等纯化手段对该提取物的化学成分进行分离，从中得到10个化合物，并综合利用现代波谱技术(IR，UV, MS, 1D.2D-NMR)对分离所得化合物的化学结构进行鉴定，首次获得西瓜藤醇沉水提的石油醚部位提取物的主要化学组成的信息。本发明充分利用了农作物废弃物——西瓜藤的丰富资源，为今后深入研究开发其药用价值和临床意义提供了有力理论基础，以期为临床提供一种新的具有良好抗炎镇痛作用的现代中药制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是西瓜藤提取物的制备工艺流程图。
[0014]图2是西瓜藤石油醚部位的化合物分离工艺流程图。
[0015]图3是对RAW264.7细胞LPS刺激模型NF- κ B的激活核转运的影响对比图。
【具体实施方式】
[0016]一、西瓜藤提取物的制备
[0017]如图1所示，取晒干粉碎的西瓜藤10kg，按重量体积比5:1用体积浓度80%的乙醇溶液超声2h，然后浸泡10d，过滤，合并滤液，减压浓缩，得墨绿色浸膏，冷冻干燥得300g绿色粉末；按重量体积比3:50将绿色粉末分散于5000mL去离子水中，静置过夜，离心(3000rpm.min—1)分出不溶于水的绿色黏稠固体悬浮物和水溶液；取水溶液依次用3倍体积的石油醚萃、乙酸乙酯、正丁醇萃取样品，萃取液分别减压浓缩，回收溶剂，蒸干，得到石油醚部位(30g)、乙酸乙酯部位(33g)、正丁醇部位(100g)。
[0018]二、西瓜藤石油醚部位的化合物分离
[0019]如图2所示，取石油醚部分通过MCI，除去色素得到样品20g，经硅胶(100-200目)柱层析，用石油醚-丙酮(98:2-0:100)(98: 2，96: 4，95:10，90:20，80:30，1: 1，2: 3，1: 3，丙酮)为梯度洗脱溶剂系统洗脱。石油醚-丙酮(98:2)洗脱部分，第2~5份，石油醚重结晶，得到化合物I (0.6g);第7~8份，吡啶重结晶，化合物2 (0.3g);石油醚-丙酮(96:4)洗脱部分，第11~25份，吡啶重结晶得化合物3(0.05g);石油醚-丙酮(95:10)洗脱部分，第2~7份，氯仿重结晶得化合物4 (0.1g);第13~18份，氯仿重结晶得化合物5 (0.04g),石油醚-丙酮(90:20)洗脱部分，第17~27份，氯仿重结晶得化合物6 (0.03g)，第22~39份,经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱(氯仿:甲醇=1:1),氯仿重结晶得化合物7(0.08g)和化合物8 (0.05g)。石油醚-丙酮(80:30)洗脱部分，第17~27份，吡啶重结晶得化合物9 (0.5g);第28~37份，吡啶重结晶得化合物10 (0.06g)。
[0020]利用现代波谱技术(IR，UV, MS, 1D.2D-NMR)对分离所得化合物的化学结构进行鉴定，证实西瓜藤石油醚部位的十种化合物分别为:β-谷留醇(化合物I)、胡萝卜苷(化合物2)、豆留醇(化合物3)、肉豆蘧酸甘油酯(化合物4)、十六烷酸(化合物5)、棕榈酸甘油酯(化合物6)、二十二烷酸甘油酯(化合物7)、熊果酸(化合物8)、二十一烷酸甘油酯(化合物9)、硬脂酸(化合物10)。
[0021]三、药效学实验:西瓜藤不同部位提取物抗炎活性筛选及其机理研究
[0022]I材料与仪器
[0023]1.1细胞来源
[0024]RAW264.7小鼠巨噬细胞购自中国科学院细胞库。
[0025]1.2实验材料
[0026]DMEM高糖培养基(北京Hyclone);胎牛血清(杭州四季青)；24孔、96孔细胞培养板(美国Corning); —氧化氮试剂盒(NO，江苏碧云天)；5个西瓜藤不同部位提取物(水溶部位、50%乙醇提取 部位、正丁醇萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、石油醚萃取部位)；脂多糖(lipopolysaccaride, LPS,美国Sigma-Aldrich)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,美国Sigma-Aldrich) ;二甲基亚砜(DMS0,分析纯,成都科龙);白介素-1 β (IL-1 β )、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α )、血红素氧合酶-1 (H0_1)、一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧合酶-2 (C0X-2)的ELISA试剂盒，购自Bio-Swamp ;核转录因子_ κ B (NF- κ B)激活-核转运检测试剂盒(江苏碧云天);荧光定量八连管(美国ABI);培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(北京天根)；β -巯基乙醇(美国Amresco) ;cDNA第一链合成试剂盒(北京天根)；突光定量预混试剂盒增强版(SYBR Green北京天根)。
[0027]1.3实验仪器
[0028]倒置荧光显微镜(DMI4000B，德国Leica) ；C02培养箱(BC-J80S50，上海博讯)；高压灭菌器(YXQ-LS-100SII，上海博讯)；生物安全柜(BHC-1100-1I A2，阿尔泰)；多功能酶标仪(Infinite F200pro,瑞士 Tecan);台式电动离心机(常州国华);PCR仪(TGradient,德国Biometra);实时荧光定量PCR仪(7500，美国ABI);冷冻离心机(3k30，德国Sartorius);紫外-可见分光光度计(Cary50，美国Varian);超声波细胞破碎仪(JYD-65，上海精密)。
[0029]1.4溶液配制
[0030]PBS缓冲液:取购买的PBS粉末，加2L超纯水溶解后，分装，高压灭菌后4°C保存备用。
[0031]MTT溶液:称取MTT固体粉末250mg，加入50mL的PBS缓冲液，温水辅助溶解后，用
0.22 μ m滤膜过滤除菌后分装，-20°c保存。
[0032]药物(西瓜藤5个不同部位提取物):每个药物均精确称取lOOmg，加入ImL DMSO后，超声辅助溶解，-20°C保存，使用解冻，用完全培养基稀释到需要的浓度。
[0033]2实验方法
[0034]2.1待试样品的制备
[0035]西瓜藤采自广西崇左，并经广西药用植物园马小军教授鉴定为葫芦科(Cucurbitaceae)植物西瓜(Citrullus Lanatus)的藤莖。取晒干粉碎的西瓜藤5kg,分别用10倍、8倍量水煮沸提取2h、1.5h，合并提取液，浓缩干燥，即得水提取浸膏(1.2kg)(每克浸膏相当于4.2g生药)。取晒干粉碎的西瓜藤5kg，加5倍量乙醇，回流提取2次，每次Ih,滤过，合并滤液，浓缩，于60°C干燥，称重，即得50%乙醇提取浸膏(1.5kg)(每克浸膏相当于5.25g生药)。
[0036]参照一、西瓜藤提取物的制备获得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位用于下述实验。
[0037]2.2细胞培养
[0038]RAW264.7细胞在37°C、5% CO2条件下，用含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(50 μ g/mL)的DMEM高糖培养基培养，待细胞生长至对数期。
[0039]2.3对RAW264.7细胞活力的影响
[0040]取处于对数生长期的RAW264.7细胞，胰酶消化，调整细胞悬液浓度为IO5个/mL，接种于96孔培养板中(IOOL每孔)，培养24h后，给药，空白组只加10%血清DMEM培养液，继续放入培养箱培养24h，取出培养板，各孔加入20 μ L MTT (5mg/mL)放入培养箱中孵育4h，弃上清，每孔加入DMS0150 μ L，把96孔培养板置于酶标仪中震荡IOmin后在492nm处测量各孔的吸光值，计算细胞相对抑制率。细胞相对抑制率) = (1-实验组OD均值/对照组OD 均值)X 100%ο
[0041]2.4炎症细胞模型的构建
[0042]将RAW264.7细胞接种在96孔细胞培养板上生长24h后，生长融合至70%时，分成4组:空白组，LPS低浓度组0.5 μ g/mL、中浓度组I μ g/mL、高浓度组5 μ g/mL。加药后继续培养24h，取培养基上清液测定一氧化氮(NO)水平(按试剂盒说明书进行)。培养板弃培养基后，加入100 μ L MTT溶液(lmg/mL)，继续培养4h，小心移除上清，每孔加入DMS0150 μ L，把96孔培养板置于酶标仪中震荡IOmin后在492nm处测量各孔的吸光值，计算细胞相对抑制率。
[0043]2.5抗炎活性馏分筛选
[0044]细胞培养至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，完全培养基稀释至IO5个/mL，接种于96孔培养板中(100 μ L每孔)，培养24h后，加入含药(各萃取部位)的DMEM培养基(终浓度分别为50，100，200 μ g/mL,每个剂量组复孔为8个)，并加入LPS (终浓度为I μ g/mL)，同时设定空白组(加培养基)、模型组(加培养基和LPS)继续孵育24h，收集细胞培养的上清液，测定一氧化氮(NO)水平(按试剂盒说明书进行)。
[0045]2.6活性馏分抗炎作用机理
[0046]2.6.1ELISA法测定促炎细胞因子的变化
[0047]RAW264.7细胞接种在24孔细胞培养板上生长24h后，分为空白组，模型组(LPS0.5 μ g/mL)，高剂量组(LPS0.5 μ g/mL+石油醚馏分200 μ g/mL)，中剂量组(LPS0.5 μ g/mL+石油醚馏分100 μ g/mL)，低剂量组(LPS0.5 μ g/mL+石油醚馏分50 μ g/mL)，阳性药组(LPS0.5 μ g/mL+塞来昔布2 μ g/mL)，给药24h后，收集上清液，按ELISA试剂盒说明书操作测定TNF-a，IL-6，IL-1 β的浓度。
[0048]2.6.2 实时荧光定量 PCR 检测 IL-1 β、IL-6, TNF- α、COX-2, iNOS 和 HO-lmRNA 水平。[0049]2.6.2.1RNA 提取
[0050]RAW264.7细胞接种在24孔细胞培养板上生长24h后，分为空白组，模型组(LPS0.5 μ g/mL)，高剂量组(LPS0.5 μ g/mL+石油醚馏分200 μ g/mL)，中剂量组(LPS0.5 μ g/mL+石油醚馏分100 μ g/mL)，低剂量组(LPS0.5 μ g/mL+石油醚馏分50 μ g/mL),阳性药组(LPS0.5 μ g/mL+塞来昔布2 μ g/mL),经过6h的干预后。按下列步骤提取细胞总RNA。
[0051]a.每孔加入PBS清洗I次后，加入裂解液350 μ L，涡旋震荡Imin。
[0052]b.将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm离心2min,收集滤液。
[0053]c.向滤液中加入I倍体积70%乙醇，混匀后一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0054]d.向吸附柱CR3中加入350μ L去蛋白液RWl, 12000rpm离心lmin,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0055]e.向吸附柱CR3中央加入80 μ L的DNase I工作液，室温放置15min。
[0056]DNase I 储存液配制:将 DNase I 干粉(1500U)溶解在 550 μ L RNase-Free dd H2O中，轻柔混匀，分装后_20°C贮存(可保存9个月)。
[0057]DNase I工作液的配制:取10 μ L DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μ L RDD缓冲溶液，轻柔混匀。
[0058]f.向吸附柱CR3中加·入350μ L去蛋白液RW1，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中
的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0059]g.向吸附柱CR3中加入500 μ L漂洗液RW,室温放置2min后12000rpm离心lmin,
倒掉废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复I次。
[0060]h.12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于超净台吹晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0061]1.将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，加入δΟ μ L RNase-Free ddH2O,室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。置_70°C保存。
[0062]2.6.2.2测定RNA浓度和纯度
[0063]取10 μ LRNA样品，用ρΗ7.4的TE (或无菌蒸馏水)稀释100倍。以TE为空白，用紫外分光光度计测定260nm和280nm的OD值。RNA含量(μ g/mL) =OD260值X 40 μ g/mLX稀释倍数。并根据0D26(lnm/0D28(lnm比值估计RNA纯度。RNA样品纯度以OD26tl:OD28tl=L 8-2.0之间可以认为RNA抽提成功。
[0064]2.6.2.3RNA 逆转录成 cDNA
[0065]采用天根FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)，操作按说明进行,步骤如下:
[0066]a.将样品 RNA 在冰上解冻；5Xg DNA Buffer、FQ-RT Primer MixUOXFast RTBuffer、RNase-Free dd H2O在室温解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
[0067]b.以下操作步骤请在冰上进行，按照的基因组DNA的去除体系配制混合液:5XgDNA Buffer2y L，样本 RNA5y L，R Nase-Free dd H2O 补足到 10 μ L。彻底混匀。简短离心，并置于42°C,孵育3min。然后置于冰上放置。
[0068]c.配制反转录反应体系合液:10XFast RT Buffer2 μ L, RT Enzyme Mixl μ L，FQ-RT Primer Mix2 μ L, RNase-Free dd H2O 补足到 10 μ L。按此比例先预配 26 份，混匀。
[0069]d.将反转录混合液IOyL加到b步骤的反应液中，充分混匀。
[0070]e.42O,孵育 15min。
[0071]f.950C，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA置_20°C保存。
[0072]2.6.2.4实时荧光定量PCR检测
[0073]在扩增仪上进行real time PCR,米用 Fast Start DNA Master SYBR Green Ikit检测,结果采用相对定量中的Δ ACt法计算mRAN表达，内参为PActin。反应体系采用25 μ L 体系，IL-1 β ,IL-6, TNF-a、C0X_2、iN0S 和 HO-1 的 cDNA 引物由 invitrogen 上海公司设计合成引物如下表:
[0074]表1引物信息
[0075]
11的⑴物.印列(5
【权利要求】
1.一种具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物，其特征在于该提取物来自西瓜藤醇沉水提的石油醚部位。
2.根据权利要求1所述的具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物，其特征在于该提取物主要包括以下十种化合物:β-谷留醇、胡萝卜苷、豆留醇、肉豆蘧酸甘油酯、十六烷酸、棕榈酸甘油酯、二十二烷酸甘油酯、熊果酸、二十一烷酸甘油酯、硬脂酸。
3.权利要求1所述具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤:取西瓜藤晒干粉碎，按重量体积比5:1用体积浓度80%的乙醇溶液超声2h，然后浸泡10d，过滤，合并滤液，减压浓缩，得墨绿色浸膏，冷冻干燥得绿色粉末；按重量体积比3:50将绿色粉末分散于去离子水中，静置过夜，离心分出不溶于水的绿色黏稠固体悬浮物和水溶液；取水溶液用3倍体积的石油醚萃取样品，萃取液减压浓缩，回收溶剂，蒸干，得到石油醚部位。
4.权利要求1所述具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物在制备治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛的药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述药物为胶囊、颗粒剂、片剂、溶液剂、丸剂或者注射剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述胶囊为软胶囊，所述颗粒剂为干混悬剂，所述片剂为分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片，所述溶液剂为糖浆，所述丸剂为浓缩丸、滴丸、微丸。
7.权利要求1所述具有抗炎镇痛作用的西瓜藤提取物在制备辅助治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、骨关节痛、颈椎腰椎痛、软组织痛、扭伤痛的保健食品方面的应用。
【文档编号】A61P19/04GK103623029SQ201310546203
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】邓家刚, 王硕, 龚小妹, 周小雷, 周丹丹, 戴航 申请人:广西中医药大学, 广西壮族自治区药用植物园