启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用，可有效解决启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤何种部位具有治疗食管癌之功效和提高疗效的问题，方法是，对启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤水煎物进行梯度洗脱，制备不同浓度乙醇洗脱部分并作用与食管癌细胞，筛选启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱组分中抑制食管癌细胞增殖的有效作用部位，有效作用部位对食管癌细胞生长的影响，从而实现启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用；本发明原材料丰富，制备方法简单，其产品具有治疗食管癌之功效，疗效高，是中药上的创新。
【专利说明】启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药，特别是一种启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]食管癌(esophageal carcinoma)是消化系统一种常见的恶性肿瘤,全世界每年新增病例45万人，五年生存率不到10%，在世界范围恶性肿瘤中发病率居第八位，死亡率居第六位。我国是食管癌的高发地区之一，特别是河南的林州和河北的磁县，食管癌的发病率居全国各类恶性肿瘤第五位，死亡率居第4位，其中男女发病率比例为1.3~2.7:1，发病年龄多在40岁以上。手术治疗是可切除食管癌的患病部位，但70%~80%的患者就诊时已属中晚期，失去手术机会。目前食管癌的治疗主要是综合治疗，但总体预后仍然很差，因此寻找新的治疗方法和药物是目前治疗食管癌研究的难点。食管癌属于中医“噎嗝”范畴，临床分痰气交阻、津亏热结、瘀血内结和气虚阳微四型，对应方剂分别启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤，且四方在临床应用中已取得肯定疗效，实验研究也发现四方能够抑制肿瘤细胞生长，但四方的具体作用部位和作用机制目前仍不完全明了。而且，启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤水煎液治疗食管癌效果并不理想，因此如何进一步研究和提高启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤对治疗食管癌的效果是人们关心所要解决的技术问题。
【发明内容】
[0003]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用，可有效解决启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤何种部位具有治疗食管癌之功效和提高疗效的问题。
[0004]本发明解决的技术方案是，对启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤水煎物进行梯度洗脱，制备不同浓度乙醇洗脱部分并作用与食管癌细胞，筛选启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱组分中抑制食管癌细胞增殖的有效作用部位，有效作用部位对食管癌细胞生长的影响，从而实现启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用；所述的启膈散是由北沙参90g、丹参90g、茯苓30g、川贝母45g、郁金15g、砂仁壳12g制成；通幽汤由桃仁泥40g、当归身40g、升麻40g、生地黄20g、熟地黄20g、槟榔20g、红花4g、炙甘草4g制成；沙参麦冬汤由北沙参90g、麦冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g、生甘草30g制成；补气运脾汤由白术90g、人参60g、橘红45g、获茶45g、黄芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g制成。
[0005]本发明原材料丰富，制备方法简单，其产品具有治疗食管癌之功效，疗效高，有效解决了启膈散、沙参麦冬汤 、通幽汤和补气运脾汤何种部位治疗食管癌和提高食管癌疗效的问题，是中药上的创新。【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1为本发明启膈散水提物量效曲线图。
[0007]图2为本发明通幽汤水提物量效曲线图。
[0008]图3为本发明沙参麦冬汤水提物量效曲线图。
[0009]图4为本发明补气运脾汤水提物量效曲线图。
[0010]图5为本发明启隔散30%乙醇洗脱部位量效关系曲线图。
[0011]图6为本发明通幽汤50%乙醇洗脱部位量效关系曲线图。
[0012]图7为本发明沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位量效曲线图。
[0013]图8为本发明补气运脾汤无水乙醇洗脱部位量效曲线图。
[0014]图9为本发明食管癌四证方不同洗脱部位对EC9706细胞生长抑制作用时效关系曲线图。
[0015]图10为本发明空白对照组X 100。
[0016]图11为本发明启膈散30%乙醇洗脱相组X 100。
[0017]图12为本发明通幽汤50%乙醇洗脱相组X 100。
[0018]图13为本发明沙参麦冬汤50%乙醇洗脱相组X 100。
`[0019]图14为本发明补气运脾汤无水乙醇相组X 100。
[0020]图15为本发明空白对照组X 200。
[0021]图16为本发明启膈散30%醇相组X 200。
[0022]图17为本发明通幽汤50%醇相组X 200。
[0023]图18为本发明沙参麦冬汤50%醇相组X 200。
[0024]图19为本发明补气运脾汤50%醇相组X 200。
[0025]图20为本发明阴性对照组对照组。
[0026]图21为本发明启膈散30%乙醇洗脱部位组。
[0027]图22为本发明通幽汤50%乙醇洗脱部位组。
[0028]图23为本发明沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位组。
[0029]图24为本发明补气运脾汤无水乙醇洗脱部位组。
【具体实施方式】
[0030]以下结合具体情况对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0031]本发明在具体实施中，是由以下技术方案给出。
[0032]首先分别选取启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的原料药物，启膈散是由北沙参90g、丹参90g、茯苓30g、川贝母45g、郁金15g、砂仁壳12g组成；通幽汤由桃仁泥40g、当归身40g、升麻40g、生地黄20g、熟地黄20g、槟榔20g、红花4g、炙甘草4g组成；沙参麦冬汤由北沙参90g、麦冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g、生甘草30g组成；补气运脾汤由白术90g、人参60g、橘红45g、茯苓45g、黄芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g组成；启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤组成后，分别用超纯水洗去杂质，分别加启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤原料药物重量15倍的超纯水浸泡2小时，煎煮2小时，滤去残渣，滤液浓缩至含生药量为0.5g/ml ;再分别5000r/min的转速离心lOmin，取上清液,过滤,滤液缓慢加入处理好的树脂柱中，上样体积为柱体积的1/5 (200ml),以0.5BV/h的速度通过树脂进行缓慢吸附，然后依次应用IOBV (8000ml)的超纯水、体积浓度为30%的乙醇(简称30%乙醇，以下同)、体积浓度为50%的乙醇(简称50%乙醇，以下同)、体积浓度为70%的乙醇(简称70%乙醇，以下同)、无水乙醇通过树脂柱，通过树脂柱的前5BV以IBV/h的速度进行洗脱，后5BV以2BV/h速度进行洗脱。分别收集不同洗脱液，回收溶剂，干燥，得启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位，有效用于制备治疗食管癌的药物，实现启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用；
[0033]所述的处理好的树脂柱是，大孔吸附树脂DlOl用无水乙醇浸泡24h，装柱，以2BV/h (IBV=I个柱体积)速度无水乙醇洗冲柱子至洗脱液液与水1: 5不浑浊，同样的洗脱速度水洗至流出液无醇味，4BV的质量浓度为5%的HCl和以质量浓度为2%的Na0H2BV/h的速度依次通过树脂柱，浸泡2h，水洗至中性。 [0034]本发明的启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位，经测试和实验，具有抑制食管癌细胞EC9706生长的作用，有效用于治疗食管癌，其疗效明显优于启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的水煎液，并经实验得到了有效证明，有关实验资料如下:
[0035]1.实验药物
[0036]本发明的启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位。
[0037]对比药物:启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤的水提物，所述的启膈散水提物、沙参麦冬汤水提物、通幽汤水提物和补气运脾汤水提物是分别按组方称取原料后，分别用超纯水洗去杂质，加30倍超纯水浸泡2小时，煎煮30min，浓缩至100ml，5000r/min离心15min取上清液,用滤纸过滤后浓缩至20ml。
[0038]2.主要试剂和仪器
[0039]大孔吸附树脂DlOl (天津市光复精细化工研究所，HG2-885-76);胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清(PAA) ；DMEM 培养基干粉(GIBCO) ；MTT (Sigma) DMSO (Amresco);细胞周期检测试剂盒(南京凯基)；Heraeus细胞培养箱(Kendro公司)；倒置显微镜(Zeiss公司)；ELx800型酶标仪(ΒΙ0-ΤΕΚ公司)；BioMate紫外可见分光光度计(Thermo公司)；pH测定仪(HANNA公司)；FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)。
[0040]3.实验方法
[0041]细胞培养
[0042]从液氮中取出细胞株EC9706，Imin内迅速解冻。将细胞悬液移入15ml离心管，补加IOmlDMEM培养基，离心1000r/min，IOmin0弃上清，加入不含血清的DMEM培养基10ml，吹打混匀，1000rmplOmin离心，用含10%胎牛血清的DMEM培养基以I X IO6个细胞/皿接种于0 IOOmm培养皿中，置37°C、5%C02饱和湿度的培养箱中培养，每2~3天传代I次。
[0043]MTT法测定启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱部位及其水提物对EC9706细胞的量效关系
[0044]以I X IO4个细胞/孔的密度接种于96孔平面培养板，200 μ I/孔，培养24h。分别加入含启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同乙醇洗脱部位的10%小牛血清DMEM培养基200 μ 1，浓度设6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μ g/ml8个梯度，每个浓度梯度设
3个复孔，空白对照组加含10%小牛血清的培养基200 μ 1，继续培养48h。每孔加150 μ I含10%ΜΤΤ的无血清DMEM培养基，继续培养4h。每孔加入200 μ I DMSO,溶解ΜΤΤ，酶标仪上以570nm/630nm测定光吸收值(0D)，按照肿瘤细胞生长抑制率(％) = (1_用药组OD值/对照组OD值)X 100%公式计算各药物组对细胞EC9706增殖的抑制率。找出对细胞抑制作用明显的组分，运用SPSS13.0进行曲线拟合，绘制量效关系曲线图，求出各抑制作用明显组分的半数抑制率IC5tl值。 [0045]按照同样的方法测定测定四方水提物25μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400 μ g/ml、800 μ g/ml、1600 μ g/ml、3200 μ g/ml8 个梯度，对 EC9706 细胞的量效关系，
并计算其IC5tl值。
[0046]MTT法测定启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同洗脱部位对EC9706细胞的时效关系
[0047]取抑制作用明显的组分的IC5tl浓度，同时设4个加药组和对照组，每组3个复孔，通过MTT法检测12h、24h、36h、48h四个时间点药物对细胞的抑制率，确定时间一药效关系，绘制时效关系曲线。
[0048]倒置显微镜下观察启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位对细胞EC9706形态的影响
[0049]以I X IO6细胞/ml接种Φ IOcm培养皿，于37°C，5%C02培养箱培养24h，设空白对照组、启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位5组。24h后，按各治法药物组的IC5tl值的药物浓度作用细胞，空白对照组加入新的含10%胎牛血清的DMEM培养基。继续培养48小时，倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态。
[0050]启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同乙醇浓度洗脱部位对食管癌细胞EC9706周期的影响
[0051]以lXlO6cells/皿细胞密度种细胞EC97O6于0 IOOmm培养皿中，培养24h后，弃上清，设空白对照组、启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位5组，每组重复三个皿。各药物组分别加入含各IC5tl药物浓度的10%小牛血清培养基10ml，空白对照组加等量含血清培养基，继续培养48h。胰酶消化收集细胞，将细胞悬液转至15ml离心管中，2000r/min离心5min，弃上清，4°C PBS (2ml)洗，混匀，2000rpm，5min离心，弃液。4°C PBS (2ml)洗，混匀，计数取I X 106个细胞于流式管中，2000rpm, 5min离心，弃液；先用4°C PBS悬浮细胞，大约1ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞之后，缓慢加入_20°C无水乙醇2.4ml，终浓度为70%乙醇。4°C固定24h以上。离心，1500rpm, 5min 弃固定液；4°C PBSlml 洗，混匀后，离心 1500rpm, 5min 弃液，4°C PBSlml洗，混匀，离心，1500rpm, 5min弃液。分别加入100 μ I RNAase, 37 °C水浴30min ;再加入400 μ I ΡΙ，染色液混匀，4°C避光30min。300目的尼龙滤膜直接过滤到流式检测管中，每样本获取IO4个细胞荧光信号，激发波长488nm，用CellQuest Pro获取、MODFIT软件检测EC9706细胞周期分布。周期分布用G0/G1%，S%，G2/M%表示。
[0052]统计学分析方法:采用SPSS 13.0统计软件，F检验，曲线拟合
[0053]4.结果[0054]启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤和补气运脾汤不同梯度浓度乙醇洗脱部位分析
[0055]经过大量预实验发现，实验中所采用的打孔吸附树脂洗脱条件下，得到的各组出膏率均较大且比较稳定。不同组分洗脱液进行浓缩烘干后得到不同组分的药物干粉，各四方各组分出膏率大小顺序一致:纯水部位> 30%乙醇洗脱部位> 50%乙醇洗脱部位> 70%乙醇洗脱部位>无水乙醇洗脱部位，见表1。
[0056]表1食管癌证方不同乙醇浓度洗脱部位出膏分析
[0057]
【权利要求】
1.一种启膈散、通幽汤、沙参麦冬汤、补气运脾汤不同洗脱部位在治疗食管癌药物中的应用，所述的启膈散由北沙参90g、丹参90g、茯苓30g、川贝母45g、郁金15g和砂仁壳12g组成；所述的通幽汤由桃仁泥40g、当归身40g、升麻40g、生地黄20g、熟地黄20g、槟榔20g、红花4g和炎甘草4g组成；所述的沙参麦冬汤由北沙参90g、麦冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g和生甘草30g组成；所述的补气运脾汤由白术90g、人参60g、橘红45g、获茶45g、黄芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g组成；启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤组成后，分别用超纯水洗去杂质，分别加启膈散、沙参麦冬汤、通幽汤和补气运脾汤原料药物重量15倍的超纯水浸泡2小时，煎煮2小时，滤去残渣，滤液浓缩至含生药量为0.5g/ml ;再分别以5000r/min的转速离心IOmin,取上清液,过滤,滤液缓慢加入处理好的树脂柱中，上样体积为柱体积的1/5，以0.5BV/h的速度通过树脂进行缓慢吸附，然后依次应用IOBV的超纯水、体积浓度为30%的乙醇、体积浓度为50 %的乙醇、体积浓度为70%的乙醇、无水乙醇通过树脂柱，通过树脂柱的前5BV以lBV/h的速度进行洗脱，后5BV以2BV/h速度进行洗脱，分别收集不同洗脱液，回收溶剂，干燥，得启膈散30%乙醇洗脱部位、通幽汤和沙参麦冬汤50%乙醇洗脱部位、补气运脾汤无水乙醇洗脱部位。
【文档编号】A61K36/8969GK103550706SQ201310548117
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】司富春 申请人:河南中医学院