一种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株及应用的制作方法
【专利摘要】本发明对屋尘螨（Dermatophagoides?pteronyssinus）的主要过敏原Derp2进行基因调整后得到修饰性过敏原基因xderp2，并构建了含有xderp2基因的重组质粒和重组乳酸乳球菌菌株L.lactis?XD（保藏号为CGMCC?No.8220）。Western?blot结果显示，修饰性过敏原XDerp2蛋白可以在重组乳酸乳球菌中表达；同时，动物实验结果显示，口服表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌可以明显抑制尘螨过敏反应。
【专利说明】—种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及遗传资源工程，特别涉及一种表达修饰性尘螨过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.1actisXD及应用。
【背景技术】[0002]过敏性哮喘是一类临床常见病、多发病，其诱发因素很多，包括花粉、毛发、尘螨等。其中，尘螨是一类最为主要的过敏原，人们已初步鉴定出几十种过敏原；80%-90%的尘螨过敏患者对Derp2产生过敏反应。目前，特异性免疫治疗(SIT)被认为是最为有效的治疗过敏的方法，但成功的免疫治疗取决于高质量的变应原。目前用于临床治疗的尘螨过敏原制剂，多为从自然界中分离获得的天然过敏原混合物，用于SIT治疗存在着不可避免的副作用:首先，对某一过敏患者而言，其存在着大量非过敏原成分，而这些非过敏原成分有时会造成新的过敏反应；其次，特异性免疫治疗的原理是使过敏机体不断接触逐渐增加剂量的过敏原,从而使机体产生耐受反应,而在治疗过程中，过敏机体与相应的过敏原接触会产生轻微的炎症反应，因此会对机体造成一定的损伤。
[0003]目前，已有研究报道指出通过构建天然过敏原的衍生物，在保留天然过敏原免疫原性的基础上消除其反应原性，可以增加特异性免疫治疗的安全性。由于过敏原的衍生物无法通过分离纯化的方法从自然界中获得，通过人为加工的方法成为获得过敏原衍生物的唯一方法。过敏原衍生物在体外的化学合成或在传统的表达系统大肠杆菌内表达，存在着安全性不高、成本较高、批次重复性差等缺点。乳酸菌作为肠道固有菌群的一部分，已被证明对人体的免疫起着非常重要的作用，包括维持肠道平衡和促进人体免疫系统的成熟。以乳酸菌作为表达系统在特定部位表达功能蛋白，对于某些肠道疾病及自身免疫性疾病具有很好的预防及治疗效果，其优势在于:可以选择性的表达单一抗原或几种抗原；由于乳酸菌的可食用性，避免了后续过敏原的纯化问题；其次，乳酸菌可以采用口服的方式进入机体，从接受程度上更为病人所接受。综上，我们构建了一株可以表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌，并通过动物实验对其预防尘螨过敏疾病的特性进行了研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种修饰性过敏原XDerp2，提供一种表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株Lactococcus lactis XD (保藏号CGMCC N0.8220)，提供将所述修饰性过敏原用于预防尘螨过敏疾病的用途，以及提供将所述重组乳酸乳球菌菌株用于预防尘螨过敏疾病的用途。
[0005]一方面，本发明提供了一种修饰性过敏原XDerp2，该修饰性过敏原的基因序列为SEQ ID N0.1。
[0006]所述屋尘螨修饰性过敏原XDerp2是对来源于屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2 (genebank:AF276239.1)进行基因调整后获得的。
[0007]另一方面，本发明提供了一种表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD (保藏号 CGMCC N0.8220)。
[0008]所述表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD是通过将修饰性过敏原基因xderp2克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒PNZ8148-XD，再将其电转入宿主乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000中而获得的。
[0009]另一方面，本发明提供了将所述修饰性过敏原XDerp2用于预防尘螨过敏疾病的用途。
[0010]再一方面，本发明提供了将所述重组乳酸乳球菌菌株用于预防尘螨过敏疾病的用途。[0011]本发明的优点是:在保留天然过敏原免疫原性的基础上消除其反应原性，可以增加特异性免疫治疗的安全性。由于过敏原XDerp2去除了反应原性，可以避免治疗过敏时带来的炎症反应，因此可以缩短尘螨过敏疾病的治疗时间。相比传统的疫苗，本发明所用的乳酸菌疫苗可以被制作成粉状制剂、胶囊等形式的药品，通过口服的方式用于尘螨过敏疾病的预防和替代现有的尘螨疫苗，更好的用于尘螨过敏疾病的治疗。由于微生物的培养具有操作简单、成本较低等特点，可以大大降低过敏疾病治疗的费用。此外，相比传统疫苗的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更容易使机体产生耐受反应。
[0012]本发明涉及的菌种包括:乳酸乳球菌Lactococcus lactis XD,于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究中心，保藏编号为CGMCC N0.8220。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1.表示重组乳酸乳球菌L.lactis XD表达XDerp2的Western blot检测结果。
[0014]其中:
[0015]Y:阳性对照:纯化的Derp2蛋白；
[0016]XD:菌株L.lactis XD培养基的上清成分；
[0017]C:阴性对照:L.lactis 8148(含空质粒)培养基的上清成分。
[0018]图2.表示小鼠免疫过程示意图。
[0019]其中，进行小鼠尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段:首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理(200 μ I菌体或生理盐水);在第17、24、31天进行腹腔注射Derp2/Alum (Pierce,美国)(200 μ I)的混合物,使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将溶解在PBS溶液中的Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。
[0020]图3.表示口服重组乳酸乳球菌对小鼠体内过敏原特异性抗体的影响。
[0021]其中:
[0022]Positive:阳性对照组小鼠模型，
[0023]XD: 口服重组乳酸菌L.lactis XD组小鼠模型，
[0024]Control:阴性对照组小鼠模型(口服生理盐水)。
[0025]图4.表示肺部的组织形态观察。[0026]其中:
[0027]Positive:阳性对照组小鼠模型，
[0028]XD: 口服重组乳酸菌L.lactis XD组小鼠模型，
[0029]Control:阴性对照组小鼠模型(口服生理盐水)。
实施例
[0030]下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
[0031]1、根据乳酸乳球菌基因组数据，分析乳酸乳球菌的密码子偏好性、GC含量等参数，将来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2 (genebank:AF276239.1)进行基因调整，得到修饰性过敏原基因xderp2的序列 SEQ ID N0.1 ；
[0032]2、将修饰性过敏原基因xderp2克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148 (中国科学院钟瑾研究员惠赠)上，获得重组质粒PNZ8148-XD，再将其电转入宿主乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000中，得到重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD (保藏号CGMCC N0.8220)，该菌株已于2013年9月18日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；
[0033]3、用Western blot检测重组乳酸乳球菌L.lactis XD中重组过敏原XDerp2的表达情况，发现过敏原XDerp2可在重组乳酸乳球菌内成功表达；
[0034]4、动物实验结果说明，口服重组乳酸乳球菌L.lactis XD可明显降低小鼠体内Derp2特异性IgE的水平；此外·，实验小鼠肺部组织学的分析结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis XD可明显抑制尘螨过敏原Derp2所引起的肺部炎症反应。
[0035]具体技术细节如下:
[0036]1、尘螨过敏原Derp2的基因调整
[0037]参照derp2 基因序列 SEQ ID N0.2 (genebank:AF276239.1),基于乳酸乳球菌基因组的特点，根据GC含量、稀有密码子使用情况等对其进行基因优化，得到优化后的基因序列mderp2，人工合成后克隆到质粒pUC57 (生工生物工程(上海)有限公司)上，得到pUC57-mderp2质粒；然后根据已有的文献报道和实验数据进行分析，对所述序列进行调整和重排，在保留过敏原Derp2免疫原性的基础上，消除其反应原性，基因调整后的序列命名为 xderp2。
[0038]尘螨过敏原修饰后的基因序列xderp2:SEQ ID N0.1。
[0039]尘螨过敏原Derp2 的原始序列 AF276239.1:SEQ ID N0.2。
[0040]尘螨过敏原Derp2的修饰后氨基酸序列XDerp2:SEQ ID N0.3
[0041]尘螨过敏原Derp2的原始氨基酸序列:SEQ ID N0.4
[0042]2、重组表达质粒的构建
[0043]以人工合成的质粒pUC57-mderp2为模板，采用融合PCR (PCR程序为:95 0C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 30s, 30 个循环；PCR 反应体系(50 μ I):5 μ IdNTPs (2mM), 5 μ 110XBuffer, I μ I Taq E，3 对融合引物(表 I)各 I μ 1，模板 I μ I)的方法扩增基因xderp2，并通过1%琼脂糖凝胶电泳分离回收目的片段，然后经内切酶KpnI和XbaI处理后得到目的片段-xderp2 ；以乳酸乳球菌菌株L.lactis NZ9000(中国科学院钟瑾研究员惠赠)的基因组为模板，以SPusp45-F和SPusp45-R(表1)为引物，采用PCR的方法扩增信号肽序列 SPusp45CGeneBank:EU382094.1)(PCR程序为:95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；PCR反应体系:5 μ I dNTPs (2mM), 5 μ 110 XBuffer, I μ I Taq E,上下游引物各 I μ 1，模板I μ I )，目的产物经PCR产物纯化试剂盒回收得到目的片段后，以内切酶NcoI和KpnI在37°C条件下反应3小时，再经PCR产物纯化试剂盒回收目的片段-SPusp45 ;然后与酶切处理的质粒PNZ8148片段进行连接得到表达质粒pNZ8148-XD，电转入乳酸乳球菌菌株L.1actisNZ9000中，得到重组乳酸乳球菌菌株L.lactis XD。
[0044]表1 (如 SEQ ID N0.5-12)
【权利要求】
1.一种屋尘螨修饰性过敏原XDerp2，该修饰性过敏原的基因序列为SEQ ID N0.1。
2.如权利要求1所述的屋尘螨修饰性过敏原XDerp2，其特征在于该修饰性过敏原是通过对来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2进行基因调整后获得的。
3.一株表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis XD,于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8220。
4.如权利要求3所述的表达修饰性过敏原XDerp2的重组乳酸乳球菌菌株L.1actisXD，其特征在于所述菌株是通过将修饰性过敏原基因Xderp2克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-XD，再将其电转入宿主乳酸乳球菌菌株L.1actisNZ9000中而获得的。
5. 将权利要求1或2所述修饰性过敏原用于预防尘螨过敏疾病的用途。
6.将权利要求3或4所述重组乳酸乳球菌菌株用于预防尘螨过敏疾病的用途。
【文档编号】A61K39/35GK103626862SQ201310645991
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】陈卫, 张秋香, 艾春青, 王刚, 田丰伟, 刘小鸣, 赵国忠, 赵建新, 张灏, 郭敏 申请人:江南大学