用于治疗蓬佩氏病的方法和材料的制作方法

用于治疗蓬佩氏病的方法和材料的制作方法
【专利摘要】本文件涉及具有酸性alpha葡糖苷酶活性和至少一处修饰的分子复合物，所述修饰导致分子复合物被转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。
【专利说明】用于治疗蓬佩氏病的方法和材料
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年3月15日提交的美国临时申请流水号61/611，485的权益。认 为先前申请的公开内容是本申请的公开内容（并且通过提及并入其中）的一部分。 发明领域
[0003] 本发明涉及具有酸性alpha葡糖苷酶活性的分离的分子复合物，且更具体地涉及 包含通过蛋白水解从前体分子衍生的至少两个多肽的分子复合物，其中所述分子复合物包 含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。
[0004] 发明背景
[0005] 蓬佩（Pompe)氏病（又称为糖原I&积病（glycogen-storage disease) II 型或酸 性麦芽糖酶缺陷）是一种罕见的常染色体隐性病症，其由于酸性alpha葡糖苷酶（GAA)缺 陷而导致糖原在溶酶体中的积累。糖原的积累引起遍及全身的进行性肌无力（progressive muscle weakness)(肌病），并且影响各个身体组织，包括心脏、骨骼肌、肝、和神经系统。
[0006] 蓬佩氏病被宽泛地分成婴儿期发作性和迟发性形式。在婴儿期发作性形式中，婴 儿通常在婴儿期早期（4-8个月龄）期间呈现无力和懒散（floppiness)，并且不能举起他 们的手，而且不能进行对于其年龄而言常见的其他运动任务，诸如翻身。在不治疗的情况 下，具有蓬佩氏病的婴儿通常由于心力衰竭（heart failure)和呼吸虚弱（respiratory weakness)而在12个月龄前死亡。参见United Pompe Foundation。迟发性形式（包括青少 年和成年形式）比婴儿期形式具有更晚的发作并且更慢地进展。重组人GAA(Myozyme? 或Lumizyme?)用于治疗蓬佩氏病。然而，Myozyme?.或Lumizyme?:都是非常昂贵 的，每年费用完全超过300, 000美元。因而，需要改善的蓬佩氏病治疗。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个方面，本文件的特征在于一种分离的分子复合物，其具有酸性alpha葡糖 苷酶（GAA)活性，且包含至少两个多肽（例如至少三个或至少四个多肽），每个多肽与SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85% (例如至少90%、95%、99%、或100%) 序列同一性，每个区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之 间或氨基酸60和氨基酸65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序 列的蛋白水解衍生。所述分子复合物包含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被转运到 哺乳动物细胞内部的能力增强。对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解进一步可 以包括在SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个 位点处的切割或在SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之间的一 个或多个位点处的切割。蛋白水解进一步可以包括在SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的 氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个位点处的切割和在SEQ ID NO: 1中所列的氨基 酸序列的氨基酸137和氨基酸151之间的一个或多个位点处的切割。
[0009] 在本文中描述的任何分子复合物中，至少一个多肽可以包含一个或多个磷酸化的 N-聚糖，且所述修饰可以包含至少一个磷酸化的N-聚糖的脱帽（uncapping)和脱甘露糖基 化（demannosylation)。至少一个多肽上的至少40% (例如至少60%、80%、90%、95%、或 99%)的N-聚糖可以是脱帽且脱甘露糖基化的。
[0010] 在本文中描述的任何分子复合物中，对于所述至少两个多肽之一，所述区段包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,且其中对于所述至少两个多肽之一，所述区段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至896。
[0011] 在含有至少三个多肽的本文中描述的任何分子复合物中，对于所述至少三个多肽 之一，所述区段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,其中对于所述至少三个多肽之一，所述 区段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至726,且其中对于所述至少三个多肽之一，所述区段包 含SEQ ID NO: 1的氨基酸736至896。
[0012] 在含有至少四个多肽的本文中描述的任何分子复合物中，对于所述至少四个多肽 之一，所述区段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,其中对于所述至少四个多肽之一，所 述区段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至143,其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸158至726,且其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含 SEQ ID NO: 1 的氨基酸 736 至 896。
[0013] 在本文中描述的任何分子复合物中，所述至少一处修饰可以包括与分子复合物中 至少一个多肽融合的下列至少一种：胞外受体的配体，结合靶细胞表面上的受体胞外域的 靶向域，尿激酶型纤维蛋白溶酶原受体，或人胰岛素样生长因子II的识别域。
[0014] 本文件的特征还在于包含本文中描述的任何分子复合物的组合物，其中分子复合 物是冻干的。所述组合物可以以一次性管形瓶（Single use vial)包装。
[0015] 本文件的特征还在于药物组合物，其包含本文中描述的任何分子复合物和药学可 接受载体。所述组合物可以被配制用于静脉内或皮下施用。所述组合物可以被配制用于静 脉内输注。
[0016] 在另一个方面，本文件的特征在于治疗蓬佩氏病的方法。所述方法包括对诊断为 蓬佩氏病的患者施用本文中描述的任何组合物。所述患者可以诊断为婴儿期发作性蓬佩氏 病或迟发性蓬佩氏病。
[0017] 本文件的特征还在于生成分子复合物的方法。所述方法包括使与SEQ ID NO: 1中 所列的氨基酸序列具有至少85 %序列同一性的多肽与蛋白酶接触，所述蛋白酶与SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列具有至少85% (例如至少90%，至少95%，至少99%，或100% ) 序列同一性，其中所述蛋白酶在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68 之间或氨基酸60和氨基酸65之间）的一个或多个位点处切割所述多肽。可以在体外实施 接触步骤。
[0018] 本文件的特征还在于用于生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子 复合物的方法。该方法包括使分子复合物与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够（i)将 甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸及（ii)水解末端alpha-1，2甘露 糖，alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖连接，所述分子复合物具有GAA活性且包 含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序 列同一性，每个区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间 或氨基酸60和氨基酸65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序 列的蛋白水解衍生，其中在接触前，至少一个所述多肽包含含有一个或多个甘露糖-1-磷 酸-6-甘露糖模块的磷酸化N-聚糖。甘露糖苷酶可以是家族38糖基水解酶（例如直生刀 豆（Canavalia ensiformis)甘露糖苷酶或解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)甘露糖 苷酶）。可以在表达甘露糖苷酶的重组真菌细胞中发生所述接触。
[0019] 本文件的特征还在于生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合 物的方法。该方法包括使分子复合物与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够水解末端 alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖连接，所述分子复合物具有 GAA活性且包含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至 少85%序列同一性，每个区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸 68之间或氨基酸60和氨基酸65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基 酸序列的蛋白水解衍生，其中至少一个多肽在接触前包含含有脱帽的甘露糖-6-磷酸模块 的磷酸化N-聚糖。甘露糖苷酶可以是家族47糖基水解酶（例如斋藤曲霉（Aspergillus satoi)甘露糖苷酶），家族92糖基水解酶（例如纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans)甘露糖苷酶），或家族38糖基水解酶（例如直生刀豆甘露糖苷酶）。可以在表 达甘露糖苷酶的重组真菌细胞中发生所述接触。
[0020] 本文件的特征还在于生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复 合物的方法。该方法包括使分子复合物与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够将甘露 糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸，所述分子复合物具有GAA活性并且包 含至少两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列 同一性，每个区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或 氨基酸60和氨基酸65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的 蛋白水解衍生，其中在接触前，至少一个多肽包含一个或多个甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模 块。甘露糖苷酶可以是家族38糖基水解酶（例如直生刀豆甘露糖苷酶或解脂耶氏酵母甘 露糖苷酶）。
[0021] 在另一个方面，本文件的特征在于生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚 糖的分子复合物的方法。该方法包括a)使分子复合物与能够将甘露糖-1-磷酸-6-甘露 糖模块水解成甘露糖-6-磷酸的甘露糖苷酶接触以使所述分子复合物中的至少一个多肽 上的甘露糖-6-磷酸模块脱帽，所述分子复合物具有GAA活性且包含至少两个多肽，每个多 肽与SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通过在 氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨基酸65之 间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生；并b)使所 述分子复合物与能够水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘 露糖连接的甘露糖苷酶接触。可以通过两种不同酶催化或者通过单一酶催化步骤（a)和步 骤（b)。接触步骤可以一起或分开且以任一次序实施。可以在重组真菌宿主细胞中发生接 触，所述真菌宿主细胞表达能够催化步骤（a)的甘露糖苷酶和能够催化步骤（b)的甘露糖 苷酶。可以在重组真菌宿主细胞中发生接触，所述真菌宿主表达能够催化步骤（a)和（b) 的甘露糖苷酶。
[0022] 可以使用包含至少一个脱帽且脱甘露糖基化的N-聚糖的本文中描述的任何分子 复合物接触哺乳动物细胞，其中在接触后，分子复合物以增强的效率转运到哺乳动物细胞 的内部。哺乳动物细胞可以是人细胞。
[0023] 本文件的特征还在于将具有GAA活性的分子复合物转运到细胞内部的方法。所述 方法包括使哺乳动物细胞与所述分子复合物接触，所述分子复合物包含至少两个多肽，每 个多肽与SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通 过在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨基酸 65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生；其中 至少一个所述多肽上的磷酸化N-聚糖已经如本文中描述的方法中所列的那样脱帽并脱甘 露糖基化。哺乳动物细胞可以在体外或在哺乳动物受试者中。哺乳动物细胞可以是人细胞。
[0024] 在另一个方面，本文件的特征在于将具有GAA活性的分子复合物转运到细胞内部 的方法。所述方法包括使哺乳动物细胞与所述分子复合物接触，所述分子复合物包含至少 两个多肽，每个多肽与SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性， 每个区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸 60和氨基酸65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水 解衍生，所述分子复合物包含至少一处修饰，其导致分子复合物被转运到哺乳动物细胞内 部的能力增强。哺乳动物细胞可以在体外或在哺乳动物受试者中。哺乳动物细胞可以是人 细胞。所述修饰可以包括与分子复合物中至少一个多肽融合的下列任一种：胞外受体的配 体，结合靶细胞表面上的受体胞外域的靶向域，尿激酶型纤维蛋白溶酶原受体，或人胰岛素 样生长因子II的识别域。
[0025] 在另一个方面，本文件的特征在于包含编码碱性蛋白酶的外源核酸的分离的真菌 细胞，所述碱性蛋白酶与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。
[0026] 本文件的特征还在于分离的真菌细胞，其包含编码SEQ ID NO: 1中所列的GAA氨 基酸序列的核酸和编码与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的碱 性蛋白酶的核酸。所述真菌细胞生成具有GAA活性且包含至少两个多肽的分子复合物，每 个多肽与SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通 过所述碱性蛋白酶在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基 酸60和氨基酸65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白 水解衍生。在一些实施方案中，真菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷 酶能够将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸。在一些实施方案中，真 菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解末端alpha-1，2甘露 糖，alpha-1，3甘露糖和/或alpha-1，6甘露糖连接。在一些实施方案中，真菌细胞进一步 可以包含编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够（i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖 模块水解成甘露糖-6-磷酸并（ii)水解末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3甘露糖和/或 alpha-1，6甘露糖连接。任何此类真菌细胞进一步可以包括编码能够促进甘露糖基磷酸化 的多肽的核酸和/或遗传工程化改造为OCHl活性缺陷。
[0027] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术 人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材 料可以用于实施或测试本发明，下文描述了例示性的方法和材料。本文中提及的所有出版 物，专利申请，专利，Genbank?·登录号，和其它参考文献通过提及完整并入。在冲突的情 况下，应以本申请（包括定义）为准。材料，方法和例子仅仅是例示的，而并不意图为限制 的。
[0028] 本发明的其它特征和优点从以下详细描述及从权利要求书看会是显而易见的。
[0029] 附图简述
[0030] 图1是切割信号序列后人酸性alpha葡糖苷酶（GAA)的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1) 的图。
[0031] 图2A是DsbA-纤维化纤维微细菌甘露糖苷酶5 (CcMan5)的可读框（ORF)的核苷 酸序列（SEQ ID NO:2)的图。
[0032] 图2B是具有粗体的信号序列的CcMan5多肽的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)的图。
[0033] 图2C是没有信号序列的CcMan5多肽的氨基酸序列（SEQ ID N0:4)的图。没有信 号序列的CcMan5多肽的预测分子量是173kDa。
[0034] 图3A和3B是一系列电泳图，其描绘了用CcMan5和JbMan处理的rhGAA的N-聚糖 分析。使用DNA测序仪辅助的、荧光团辅助的碳水化合物电泳（DSA-FACE)实施分析。Y轴 代表相对荧光单位，作为每个N-聚糖结构的量的指示。X轴代表每个N-聚糖结构通过毛细 管的相对迁移率。在图3A和图3B两者中，小图A是含有用PNGaseF从RNaseB释放的N-聚 糖的参照样品。在图3A中，小图B和C含有分别用CcMan5和JbMan处理之前和之后来自 huGAA(76kD变体）的N-聚糖分析。在图3B中，小图B、C、和D分别含有来自huGAA76kD形 式、95kD形式、和IlOkD形式的N-聚糖分析。
[0035] 图4是使用家兔肝糖原作为底物用My〇Zyme( · )，76kDa GAA( ▲ )，95kDa GAA(V)，和IlOkDa GAA( ?)每分钟形成的葡萄糖量的线图。
[0036] 图5A含有心脏中各个小鼠的糖原水平（μ g/mg蛋白质）的两幅图。图5B含有骨 骼肌中各个小鼠的糖原水平（μ g/mg蛋白质）的两幅图。红色点是雌性，黑色点是雄性。线 代表每组的中值。
[0037] 图6含有解脂耶氏酵母AMSl甘露糖苷酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 5)的图。
[0038] 图7含有斋藤曲霉甘露糖苷酶的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)的图。
[0039] 图8含有纤维化纤维微细菌甘露糖苷酶4 (CcMan4, SEQ ID NO: 7)的氨基酸序列的 图，信号序列为粗体。没有信号序列的CcMan4多肽的预测分子量是184kDa。
[0040] 图9含有包含信号肽（21个氨基酸），前肽（pro-p印tide) (100个氨基酸）和成熟 蛋白质（282个氨基酸）的米曲霉（Aspergillus oryzae)碱性蛋白酶的氨基酸序列（SEQ ID N0:9)的图。
[0041] 图10含有融合构建体的核苷酸序列的图，所述融合构建体含有编码米曲霉碱性 蛋白酶的经解脂耶氏酵母密码子优化的序列（SEQ ID N0:10)。用于克隆的限制性位点加下 划线。编码接头的核苷酸序列为粗体，并且编码His标签（10个His残基）的核苷酸序列 为斜体。
[0042] 发明详述
[0043] 一般而言，本文件提供了分离的分子复合物，其具有酸性alpha-葡糖苷酶（GAA) 活性和至少一处修饰，该修饰导致被转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。GAA以含有 N-连接的聚糖的IlOkDa前体合成。前体被蛋白水解加工以除去信号序列，然后进一步蛋白 水解加工成95kDa，76kDa，和70kDa的主要种类。然而，从前体释放的至少一些肽仍然与主 要种类联合。参见例如Moreland等，J. Biol. Chem.，280:6780-6791 (2005)。如此，具有本 文中描述的GAA活性的分子复合物包含至少两个多肽（至少两个，三个，或四个多肽），其通 过在一个或多个位点处对前体分子的蛋白水解切割衍生。分子复合物中的至少两个多肽源 自前体中一个或多个位点处的蛋白水解切割。例如，SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的 蛋白水解可以介于氨基酸50和氨基酸74之间，例如在氨基酸56和氨基酸68之间或在氨 基酸60和氨基酸65之间，以生成至少两个多肽。含有两个多肽的分子复合物在本文中称 为95kDa形式。
[0044] 在一些实施方案中，分子复合物中的至少三个多肽源自前体中两个或更多个位点 的蛋白水解切割。例如，SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解在氨基酸50和氨基 酸74之间（例如氨基酸50和氨基酸74之间或氨基酸60和氨基酸65之间）的切割外可 以包括SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个位 点处的切割或氨基酸137和氨基酸151之间的一个或多个位点处的切割。含有三个多肽的 分子复合物在本文中称为76kDa形式。
[0045] 在一些实施方案中，分子复合物中的至少四个多肽源自前体中三个或更多个位点 处的蛋白水解切割。例如，SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解在氨基酸50和氨 基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨基酸65之间）的切割外 可以包括SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个 位点处的切割或SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之间的一个 或多个位点处的切割。含有四个多肽的分子复合物在本文中称为70kDa形式。
[0046] 应当领会，可以在一个分子中的一个或多个位点处发生切割，且切割位点在不同 分子中可以是不同的。
[0047] 可以使用含有来自米曲霉的蛋白酶的商品化蛋白酶混合物（例如来自Sigma或 NovozymesCorp)在氨基酸50和74之间，例如在氨基酸56和68之间或氨基酸60和65之间 切割SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列。或者，可以使用与来自米曲霉的碱性蛋白酶（SEQ ID N0:8)具有至少85% (例如，至少90%、95%、97%、98%、99%、或100%)序列同一性的 碱性蛋白酶。例如，如本文中描述的，可以使具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的GAA 多肽与蛋白酶接触，所述蛋白酶与SEQ ID N0:8或SEQ ID N0:9中所列的氨基酸序列具有至 少85%序列同一性。SEQ ID N0:8是成熟米曲霉碱性蛋白酶的氨基酸序列。SEQ ID N0:9 是包含信号肽、前肽和成熟蛋白的米曲霉蛋白酶的氨基酸序列。可以使用自米曲霉分离或 已经重组生成的蛋白酶在体外发生接触。或者，可以将真菌宿主工程化改造为使得GAA多 肽和碱性蛋白酶都被分泌到培养基中，其中碱性蛋白酶可以在氨基酸50和氨基酸74之间 (例如氨基酸56和68之间或氨基酸60和氨基酸65之间）切割SEQ ID NO: 1中所列的氨 基酸序列。
[0048] 本文中描述的分离的分子复合物具有至少一处修饰，该修饰导致被转运到哺乳动 物细胞内部的能力增强。增强复合物被转运到哺乳动物细胞内部的能力的修饰的非限制性 例子包括磷酸化的N-聚糖的脱帽和脱甘露糖基化或促进转运的肽标签。本文中描述了用 于制备含有标签或脱帽且脱甘露糖基化的N-聚糖的分子复合物的方法和材料。
[0049] 本文中描述的分离的分子复合物特别可用于治疗蓬佩氏病患者，包括诊断为蓬佩 氏病，即婴儿期发作性蓬佩氏病和迟发性蓬佩氏病两者的患者。蓬佩氏病由于GAA缺陷而 导致糖原在溶酶体中的积累。糖原的积累引起遍及全身的进行性肌无力（肌病），并且影响 各个身体组织，包括心脏、骨骼肌、肝、和神经系统。
[0050] 分子复合物中的每个多肽与SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少 85%序列同一性（例如至少90%，95%，97%，98%，99%，或100% )，每个区段通过在氨基 酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨基酸65之间） 的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生。可以如下测定 特定的氨基酸序列和SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列之间的百分比同一性。首先，使用 来自含有BLASTP第2. 0. 14版的BLASTZ单机版本的BLAST 2 Sequences (B12seq)程序比 对氨基酸序列。BLASTZ的此单机版本可以获自Fish&Richardson站点（例如www. fr. com/ blast/)或美国政府的国立生物技术信息中心站点（www. ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使 用B12seq程序的指导可以参见BLASTZ所附的自述文件。B12seq使用BLASTP算法实施两 种氨基酸序列之间的比较。为了比较两种氨基酸序列，B12seq的选项如下设置：-i设置为 含有要比较的第一氨基酸序列的文件（例如C:\seql. txt) ;_j设置为含有要比较的第二氨 基酸序列的文件（例如C:\seq2. txt) ;_p设置为blastp ;_〇设置为任何期望的文件名称 (例如C:\output. txt);并且所有其他选项保留为其缺省设置。例如，可以使用以下命令来 产生含有两种氨基酸序列见的比较的输出文件：C:\B12seq - ic:\seql. txt - j c:\seq2. txt-p blastp-ο c:\output. txt。若两个比较序列共享同源性，则指定的输出文件会呈 现与比对序列的同源性的那些区域。若两个比对序列不共享同源性，则指定的输出文件不 会呈现比对序列。核酸序列可以遵循相似的规程，只是使用blastn。
[0051] 在比对后，通过计算两个序列中呈现相同氨基酸残基的位置的数目测定匹配数 目。通过用匹配的数目除以全长多肽氨基酸序列的长度，接着用所得的数值乘以100测定 百分比同一性。
[0052] 注意到，百分比同一性数值四舍五入到最近的十分位。例如，78. 11，78. 12, 78. 13， 和78. 14向下四舍五入到78. 1，而78. 15, 78. 16, 78. 17, 78. 18,和78. 19向上四舍五入到 78.2。还注意到长度数值会总是整数。
[0053] 应当领会，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是 本领域公知的；即对于许多氨基酸，存在有超过一个充当氨基酸密码子的核苷酸三联体。例 如，可以修饰给定GAA多肽的编码序列中的密码子，使得特定物种（例如细菌或真菌）中的 最佳表达使用适合于所述物种的密码子偏爱表获得。
[0054] 在一个实施方案中，分子复合物可以包含至少两个多肽，其中一个多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57,且另一个多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至896。
[0055] 在一个实施方案中，分子复合物可以包含至少三个多肽，其中一个多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57, 一个多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至726,且一个多肽包 含SEQ ID NO: 1的氨基酸736至896。
[0056] 在一个实施方案中，分子复合物可以包含至少四个多肽，其中一个多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸22至57, 一个多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸66至143, 一个多肽包含 SEQ ID NO: 1的氨基酸158至726,且一个多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸736至896。
[0057] 相对于SEQ ID NO: 1中所列的序列，GAA的生物学活性变体可以含有添加，缺失， 或取代。具有取代的GAA蛋白一般会具有不超过10个（例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、 或10)个保守氨基酸取代。保守取代是用一个氨基酸取代具有相似特征的另一个。保守取 代包括下组内的取代：缬氨酸，丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和 谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸，半胱氨酸，和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸 和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬 酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的 (酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。将上文提及的极性、碱性或酸性组的一个成员用相 同组的另一成员的任何取代可以视为保守取代。比较而言，非保守取代是用一个氨基酸取 代具有不同特征的另一个。
[0058] 在一些实施方案中，GAA多肽可以是与异源氨基酸序列的融合蛋白，所述异源氨 基酸序列诸如用于纯化重组蛋白的序列（例如FLAG，多组氨酸（例如六组氨酸），血凝素 (hemagluttanin) (HA)，谷胱甘肽-S-转移酶（GST)，或麦芽糖结合蛋白（MBP))。
[0059] 在一些实施方案中，使用异源氨基酸序列增强将分子复合物转运到哺乳动物细胞 中的效率。例如，可以将复合物中的至少一个多肽与胞外受体的配体，结合靶细胞表面上的 受体的胞外域的靶向域，尿激酶型纤维蛋白溶酶原受体，或结合甘露糖-6-磷酸受体的人 胰岛素样生长因子II的结构域（例如人胰岛素样生长因子的氨基酸1-67或1-87 ;至少氨 基酸48-55 ;至少氨基酸8-28和41-61 ;或至少氨基酸8-87 ;人胰岛素样生长因子III的 其序列变体（例如R68A)或人胰岛素样生长因子的截短形式（例如从第62位起的C端截 短））融合。异源氨基酸序列可以在多肽的N端或C端融合。在一个实施方案中，通过间隔 物（例如5-30个氨基酸或10-25个氨基酸）将肽标签与多肽的N或C端融合。参见例如 美国专利 No. 7, 785, 856。
[0060] 异源氨基序列还可以是可用作诊断或可检测标志物的蛋白质，例如萤光素酶，绿 色荧光蛋白（GFP)，或氯霉素乙酰基转移酶（CAT)。
[0061] 在某些宿主细胞（例如酵母宿主细胞）中，可以通过使用异源信号序列提高靶蛋 白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引发免疫应答以 生成抗体的载体（例如KLH)或内质网或高尔基体保留信号。异源序列可以具有不同的长 度，并且在一些情况下可以是比与异源序列附接的全长靶蛋白更长的序列。
[0062] 使糖蛋白脱甘露糖基化，或脱帽并脱甘露糖基化的方法
[0063] 可以使含有磷酸化的N-聚糖的糖蛋白脱甘露糖基化，并且可以使含有含甘露 糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块的磷酸化的N-聚糖的糖蛋白脱帽并脱甘露糖基化，其通 过使糖蛋白与甘露糖苷酶接触进行，所述甘露糖苷酶能够（i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露 糖连接或模块水解成甘露糖-6-磷酸及（ii)水解末端alpha-1，2甘露糖，alpha-1，3甘露 糖和/或alpha-1，6甘露糖连接或模块。每个甘露糖苷酶的非限制性例子包括直生刀豆 (刀豆（Jack bean))甘露糖苷酶和解脂耶氏酵母甘露糖苷酶（例如AMSl)。刀豆和AMSl 甘露糖苷酶两者是家族38糖苷水解酶。
[0064] 刀豆甘露糖苷酶以硫酸铵悬浮液（产品目录编号M7257)和蛋白质组学级制剂 (产品目录编号M5573)可购自例如Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。此类商业制剂可以例 如通过凝胶过滤层析进一步纯化以除去污染物，诸如磷酸酶。刀豆甘露糖苷酶含有具有以 下氨基酸序列 NKIPRAGWQIDPFGHSAVQG(SEQ ID N0:11)的区段。参见 Howard 等，J. Biol. Chem.，273(4):2067 - 2072, 1998。
[0065] 解脂耶氏酵母AMSl甘露糖苷酶可以是重组生成的。AMSl多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:5中列出（还可见图6)。
[0066] 在一些实施方案中，脱帽和脱甘露糖基化步骤通过两种不同的酶催化。例如，可以 使用来自纤维化纤维微细菌的甘露糖苷酶（例如CcMan5)实施甘露糖-1-磷酸-6甘露糖 连接或模块的脱帽。编码CcMan5多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO:2中列出（参见图2A)。 含有信号序列的CcMan5多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO: 3中列出（参见图2B)。没有信号 序列的CcMan5多肽的氨基酸序列在SEQ ID N0:4中列出（参见图2C)。在一些实施方案 中，使用CcMan5多肽的生物学活性片段。例如，生物学活性片段可以包含SEQ ID N0:4中 所列的氨基酸序列的残基1-774。还可见WO 2011/039634。CcMan5甘露糖苷酶是家族92 糖苷水解酶。
[0067] 可以使用来自斋藤曲霉（As)(又称为海麥曲霉（Aspergillus phoenicis))的甘 露糖苷酶或来自纤维化纤维微细菌的甘露糖苷酶（例如CcMan4)催化脱帽的糖蛋白或糖蛋 白的分子复合物的脱甘露糖基化。斋藤曲霉甘露糖苷酶是家族47糖苷水解酶，而CcMan4甘 露糖苷酶是家族92糖苷水解酶。斋藤曲霉甘露糖苷酶的氨基酸序列在图7(SEQ ID N0:6) 和GenBank登录号BAA08634中列出。CcMan4多肽的氨基酸序列在图8(SEQ ID N0:7)中列 出。
[0068] 还可以使用来自家族38糖苷水解酶的甘露糖苷酶，诸如直生刀豆（刀豆）甘露糖 苷酶或解脂耶氏酵母甘露糖苷酶（例如AMSl)催化脱帽的糖蛋白或糖蛋白的分子复合物 的脱甘露糖基化。例如，可以使用CcMan5使糖蛋白（或糖蛋白的分子复合物）上的甘露 糖-1-磷酸-6甘露糖模块脱帽，并且可以使用刀豆甘露糖苷酶使脱帽的糖蛋白（或糖蛋白 的分子复合物）脱甘露糖基化。
[0069] 为了生成脱甘露糖基化的糖蛋白（或糖蛋白的分子复合物），或脱帽并脱甘露糖 基化的糖蛋白（或糖蛋白的分子复合物），在合适的条件下使含有甘露糖-1-磷酸-6甘露 糖连接或模块的靶分子（或分子复合物）与合适的甘露糖苷酶和/或含有合适的重组生成 的甘露糖苷酶的细胞裂解物接触。上文描述了合适的甘露糖苷酶。细胞裂解物可以来自任 何遗传工程细胞，包括真菌细胞，植物细胞，或动物细胞。动物细胞的非限制性例子包括线 虫、昆虫、植物、禽、爬行动物、和哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、沙鼠、犬、猫、山羊、猪、 牛、马、鲸、猴、或人。
[0070] 在使靶分子（例如分子复合物）与纯化的甘露糖苷酶和/或细胞裂解物接触后， 可以将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块水解成磷酸-6-甘露糖，并可以水解此类含 有磷酸根的聚糖的末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖连 接或模块以生成脱帽并脱甘露糖基化的靶分子。在一些实施方案中，使用一种甘露糖苷酶， 其催化脱帽和脱甘露糖基化步骤两者。在一些实施方案中，使用一种甘露糖苷酶催化脱帽 步骤，并使用不同甘露糖苷酶催化脱甘露糖基化步骤。在甘露糖苷酶处理后，可以分离靶分 子或分子复合物。
[0071] 保持裂解物中甘露糖苷酶活性的活性或完整性的适合于获得细胞裂解物的方 法可以包括使用合适的缓冲液和/或抑制剂，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制剂，其 保持细胞裂解物中的N-糖基化活性或者使细胞裂解物中的N-糖基化活性的变化最小 化。此类抑制剂包括例如螯合剂诸如乙二胺四乙酸（EDTA)、乙二醇二（P-氨乙基醚） N，N，N1，N1-四乙酸（EGTA)、蛋白酶抑制剂诸如苯甲磺酰氟（PMSF)、抑肽酶、亮抑酶肽 (Ieupeptin)、抗蛋白酶（antipain)等等，及磷酸酶抑制剂诸如磷酸盐、氟化钠、f凡酸盐， 等等。适合于获得包含酶促活性的裂解物的缓冲液和条件记载于例如Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John ffiley&Sons, New York (1999)； Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) ；Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry,3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. ff. B. Saunders, Philadelphia, (1999)〇
[0072] 在适当时，可以将细胞裂解物进一步加工以消除干扰性物质或使干扰性物质的存 在最小化。若想要的话，可以通过本领域技术人员公知的多种方法将细胞裂解物分级，所述 方法包括亚细胞分级、和层析技术诸如离子交换、疏水性和反相、大小排阻、亲和、疏水性电 荷诱导层析，等等。
[0073] 在一些实施方案中，可以制备细胞裂解物，其中整个细胞细胞器保持完整和/或 功能性。例如，裂解物可以含有下列一种或多种：完整的糙面内质网、完整的光面内质网、 或完整的高尔基体。适合于制备含有完整细胞细胞器的裂解物及测试细胞器功能性的方法 记载于例如 Moreau 等（1991) J. Biol. Chem. 266(7) :4329-4333 ;Moreau 等（1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328 ;Rexach 等（1991)J. Cell Biol. 114(2):219-229 ;and Paulik 等 (1999)Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273。
[0074] 在哺乳动物细胞与含有脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物接触 后，分子复合物可以被转运到哺乳动物细胞（例如人细胞）内部。具有脱帽的，但未脱甘露 糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物实质上不结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受 体，并且因此没有被有效转运到细胞的内部。如本文中使用的，"实质上不结合"意指小于 15% (例如小于 14%，12%，10%，8%，6%，4%，2%，1%，0.5%，或更小，或0%)的糖蛋 白分子结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受体。然而，若使此类分子复合物与能够在 下层甘露糖被磷酸化时水解末端alpha-1，2甘露糖连接连接或模块的甘露糖苷酶接触，生 成脱甘露糖基化的糖蛋白，其实质上结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受体，并且被 有效转运到细胞内部。如本文中使用的，"实质上结合"意指15%或更多（例如大于16%， 18 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%或95%)的分子复合物结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受体。应当理解，含有 使磷酸化的N-聚糖脱帽但不脱甘露糖基化的酶的制备物（例如重组宿主细胞或无细胞制 备物）可以被使磷酸化N-聚糖脱甘露糖基化的酶污染。与此类制备物接触后的靶蛋白样 品可以含有具有仅脱帽的一些磷酸化N-聚糖和脱帽并脱甘露糖基化的其它磷酸化N-聚糖 的蛋白质分子。自然地，含有脱帽并脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的那些蛋白质分子实际 上可以结合甘露糖-6-磷酸受体。"实际上不结合"的上述定义不适用于此类靶蛋白样品， 因为蛋白质分子上的磷酸化N-聚糖不能表征为脱帽但未脱甘露糖基化的。
[0075] 如此，本文件提供了将分子复合物从不结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受 体的第一种形式转化为确实结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受体的第二种形式的 方法。如下的分子复合物为第一种形式，其中复合物中的至少一个多肽包含含有一个或多 个甘露糖残基的一个或多个N-聚糖，所述甘露糖残基在1位与在6位含有磷酸根残基的甘 露糖残基连接。在此类方法中，使分子复合物的第一种形式与使末端甘露糖残基脱甘露糖 基化的甘露糖苷酶接触，从而导致在6位含有磷酸根的甘露糖变为末端甘露糖。在一些实 施方案中，甘露糖苷酶具有脱帽和脱甘露糖基化活性两者（例如直生刀豆（Jack bean)或 解脂耶氏酵母AMSl甘露糖苷酶）。在一些实施方案中，甘露糖苷酶没有脱帽活性（例如来 自斋藤曲霉的甘露糖苷酶或来自纤维化纤维微细菌的甘露糖苷酶（例如CcMan4))。
[0076] 可以使用细胞摄取测定法评估糖蛋白或分子复合物对细胞内部的转运。例如，可 以使哺乳动物细胞和含有脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物温育，然后 将细胞清洗并裂解。细胞裂解物可以评估GAA复合物的存在（例如通过Western印迹）或 通过细胞裂解物中的GAA活性评估。例如，可以在酸性alpha葡糖苷酶活性缺陷的成纤维 细胞中评估摄取。可以使用4-甲基伞形酮基-alpha-D-葡糖批喃糖苷（4-methylumbellif eryl-alpha-D-glucopyranoside，4_MUG)测定法评估alpha葡糖苷酶的胞内活性。葡糖苷 酶对底物4-MUG的切割导致产生荧光生成性产物4-MU，其可以通过用UV光照射显现或检 测。
[0077] 多肽的重组生成
[0078] 可以通过标准技术生成编码多肽（例如甘露糖苷酶、碱性蛋白酶、或GAA或其片 段）的分离的核酸分子。术语"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互换使用，指RNA和DNA两 者，包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA、和含有核酸类似物的DNA (或RNA)。多核苷酸可以 具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链（即，有义链或反义链）。多核苷酸的非限制性 例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、s i RNA、微 小RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何 序列的分离的RNA、核酸探针、和引物，以及核酸类似物。
[0079] "分离的核酸"指与存在于天然存在的基因组的其它核酸分子分开的核酸，包括通 常在天然存在的基因组（例如，酵母基因组）中的核酸的一侧或两侧侧翼的核酸。如本文 中所使用的，术语"分离的"就核酸而言还包括任何非天然存在的核酸序列，因为此类非天 然存在的序列不存在于自然界，并且在天然存在的基因组中没有刚好连续的序列。
[0080] 分离的核酸可以是例如，DNA分子，只要通常刚刚在天然存在的基因组中的DNA分 子侧翼找到的核酸序列之一被除去或缺乏。如此，分离的核酸包括但不限于作为不依赖于 其它序列的不同分子（例如，化学合成的核酸、或通过PCR或限制性内切核酸酶处理生成的 cDNA或基因组DNA片段）存在的DNA分子以及掺入载体、自主复制型质粒、病毒（例如，任 何副粘液病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、或疱疹病毒）中，或掺入原核生物或真核生物 的基因组DNA中的DNA。另外，分离的核酸可以包括经工程化改造的核酸诸如作为杂合或融 合核酸的一部分的DNA分子。认为存在于例如cDNA文库或基因组文库，或含有基因组DNA 限制性消化物的凝胶切片内的数百至数百万个其它核酸间的核酸不是分离的核酸。
[0081] 如本文中所使用的，术语"外源的"就核酸和特定宿主细胞而言意指不存在于（并 且不能获自）如自然界中找到的所述特定细胞的任何核酸。如此，认为一旦导入宿主细胞 中，非天然存在的核酸对于宿主细胞而言是外源的。重要的是，注意到非天然存在的核酸可 以含有自然界中找到的核酸亚序列或核酸序列片段，只要整个核酸不存在于自然界中。例 如，在表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，并且如此一旦导 入宿主细胞中，对于宿主细胞而言是外源的，因为整个核酸分子（基因组DNA加载体DNA) 不存在于自然界中。如此，认为作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制型质粒、 或病毒（例如，逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒）是非天然存在的核酸。由此可见，认为通 过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段及cDNA是非天然存在的核酸，因为 它们以自然界中找不到的分开的分子存在。由此还可见，以自然界中找不到的排列含有启 动子序列和多肽编码序列（例如，cDNA或基因组DNA)的任何核酸是非天然存在的核酸。天 然存在的核酸可以是特定细胞外源的。例如，一旦自酵母X细胞分离的整个染色体被导入 酵母细胞中，所述染色体对于酵母y细胞而言是外源核酸。
[0082] 可以使用聚合酶链式反应（PCR)技术来获得含有本文中所描述的核苷酸序列的 分离的核酸。可以使用PCR从DNA及RNA (包含来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列） 扩增特定序列。一般地，采用来自感兴趣区域末端或之外的序列信息来设计与要扩增的模 板的相反链在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。多种PCR策略也是可用的，通过所述PCR 策略可以将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中。分离的核酸也可以作为单一核酸 分子（例如使用亚磷酰胺（phosphoramidite)技术以3'至5'方向使用自动化DNA合成） 或者作为一系列寡核苷酸化学合成。例如，可以合成含有期望序列的一对或多对长的寡核 苷酸（例如，大于100个核苷酸），其中每对含有短的互补性区段（例如，约15个核苷酸）， 使得在寡核苷酸对退火时形成双链体。使用DNA聚合酶来延长寡核苷酸，每个寡核苷酸对 生成单一的、双链核酸分子，然后，可以将其连接到载体中。也可以通过例如对天然存在的 DNA的诱变来获得分离的核酸。
[0083] 为了重组生成多肽（例如甘露糖苷酶，碱性蛋白酶，或GAA或其片段），使用含有与 编码多肽的核酸可操作连接的启动子的载体。如本文中所使用的，"启动子"指使基因能够 得到转录的DNA序列。RNA聚合酶识别启动子，然后其启动转录。如此，启动子含有由RNA 聚合酶直接结合的，或者牵涉RNA聚合酶募集的DNA序列。启动子序列还可以包含"增强子 区"，其是一种或多种可以与蛋白质（即，反式作用因子，很像一组转录因子）结合以增强基 因簇中基因的转录水平（因此得名）的DNA区。虽然通常在编码区的5'端，增强子也可以 与启动子序列分开，并且可以例如在基因的内含子区内或在基因编码区的3'。
[0084] 如本文中所使用的，"可操作连接"意指掺入遗传构建体（例如，载体）中，使得表 达控制序列有效控制感兴趣的编码序列表达。
[0085] 可以将表达载体导入宿主细胞中（例如，通过转化或转染来进行）以表达编码 的多肽，然后，可以将所述编码的多肽纯化。可以用于多肽（例如甘露糖苷酶，碱性蛋白 酶，或GAA或其片段）的小规模或大规模生成的表达系统包括但不限于微生物体，诸如 用含有核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA、或粘粒DNA表达载体转化的细菌（例如， 大肠杆菌（E. coli))，和用含有核酸分子的重组真菌表达载体转化的真菌（例如解脂耶 氏酵母、Arxula adeninivorans、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)、多形汉森酵母 (Hansenula polymorpha)、Ogataea minuta、甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica)、黑曲 霉（Aspergillus niger)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))。有用的表达系统还包括用含有核酸分子的重组病毒表达载体（例如杆状病 毒）感染的昆虫细胞系统、和用重组病毒表达载体（例如，烟草花叶病毒）感染或用含有核 酸分子的重组质粒表达载体（例如Ti质粒）转化的植物细胞系统。也可以使用哺乳动物表 达系统来生成甘露糖苷酶或碱性蛋白酶多肽，所述哺乳动物表达系统包括含有重组表达构 建体的细胞（例如，永生化细胞系诸如COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、人胚肾293 细胞、和3T3L1细胞），所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组（例如，金属硫蛋 白启动子）或哺乳动物病毒（例如腺病毒晚期启动子和巨细胞病毒启动子）的启动子。
[0086] 通常，可以用异源氨基酸序列诸如FLAG、多组氨酸（例如，六组氨酸）、血凝素 (HA)、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)或麦芽糖结合蛋白（MBP)给重组多肽诸如甘露糖苷酶 加标签以帮助纯化蛋白质。用于纯化蛋白质的其它方法包括层析技术诸如离子交换、 疏水性和反相、大小排阻、亲和、疏水性电荷诱导层析，等等（参见例如Scopes, Protein Purification!Principles and Practice,third edition,Springer-Verlagj New York(1993) ；Burton and Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81(1998)) 〇
[0087] 使糖蛋白脱帽和脱甘露糖基化的体内方法
[0088] 可以使用本文中描述的遗传工程化细胞生成具有GAA活性的分子复合物。例如， 可以使用遗传工程化细胞生成分子复合物，该分子复合物具有GAA活性并且包含至少两个 多肽，每个多肽与SEQ ID N0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个 区段通过在氨基酸50和氨基酸74之间（例如氨基酸56和氨基酸68之间或氨基酸60和氨 基酸65之间）的一个或多个位点处对SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的蛋白水解衍生。 例如，真菌细胞可以工程化改造为包含编码SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的核酸和编 码与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的碱性蛋白酶的核酸，使 得每个编码的多肽被分泌到培养基中，其中碱性蛋白酶可以切割SEQ ID NO: 1中所列的氨 基酸序列。如实施例12中描述的，在重组GAA被分泌到具有碱性蛋白酶的培养基中时，完 成将IlOkDa前体加工成95kDa形式，即没有检出IlOkDa前体。
[0089] 还可以使用本文中描述的遗传工程化细胞生成脱帽且脱甘露糖基化的分子复合 物。此类遗传工程化细胞可以包含编码具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的多肽的核 酸，编码如本文中描述的甘露糖苷酶的核酸，和任选编码碱性蛋白酶的核酸，所述碱性蛋白 酶与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。
[0090] 生成脱帽且脱甘露糖基化的分子复合物的基于细胞的方法可以包括导入真菌细 胞中，所述真菌细胞经遗传工程化改造以包含编码能够将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接 或模块水解成磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸，编码具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基 酸序列的多肽的核酸和任选编码与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列 同一性的碱性蛋白酶的核酸，其中所述细胞生成包含脱帽的磷酸化N-聚糖的本文中描述 的分子复合物。如上文描述的，可以使此类磷酸化N-聚糖脱甘露糖基化。在一些实施方案 中，编码甘露糖苷酶和GAA的核酸含有分泌序列，使得甘露糖苷酶和GAA被共分泌。在包含 编码碱性蛋白酶的核酸的遗传工程化细胞中，分子复合物可以被加工成95kDa形式。
[0091] 另一种基于细胞的方法可以包括导入真菌细胞中的步骤，所述真菌细胞经遗传工 程化改造以包含编码甘露糖苷酶的核酸，编码具有SEQ ID NO: 1中所列的氨基酸序列的多 肽的核酸，和任选编码与SEQ ID N0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的碱 性蛋白酶的核酸，其中所述细胞生成脱帽的且脱甘露糖基化的分子复合物，所述甘露糖苷 酶能够（i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块水解成磷酸-6-甘露糖，并（ii)水解 含有磷酸根的聚糖的末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖 连接或模块。在一些实施方案中，编码甘露糖苷酶和GAA的核酸含有分泌序列，使得甘露糖 苷酶和靶分子被共分泌。在包含编码碱性蛋白酶的核酸的遗传工程化细胞中，分子复合物 可以被加工成95kDa形式。
[0092] 适合于靶分子或分子复合物的体内生成的细胞可以是真菌起源的，包括解脂 耶氏酵母、Arxulaadeninivorans、甲基营养酵母（methylotrophic yeast)(诸如念 珠菌属（Candida)、汉森酵母属（Hansenula)、0ogataea、毕赤酵母属（Pichia)或球拟 酵母属（Torulopsis)的甲基营养酵母）或曲霉属、木霉属（Trichoderma)、脉孢菌属 (Neurospora)、镰孢菌属（Fusarium)、或金孢子菌属（Chrysosporium)的丝状真菌。例 示性真菌物种包括但不限于异常毕赤酵母（Pichia anomala)、异常毕赤酵母（Pichia anomala)、牛毕赤酵母（Pichia bovis)、加拿大毕赤酵母（Pichia canadensis)、卡 氏毕赤酵母（Pichia carsonii)、粉状毕赤酵母（Pichiafarinose)、发酵毕赤酵母 (Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens)、 膜購毕赤酵母（Pichia membranaefaciens)、粗状假丝酵母（Candida valida)、白念珠 菌（Candida albicans)、Candida ascalaphidarum、Candida amphixiae、南极假丝酵母 (Candida Antarctica)、大西洋假丝酵母（Candida atlantica)'Candida atmosphaerica、 虫章鄉假丝酵母（Candida blattae)、果生假丝酵母（Candida carpophila)、Candida cerambycidarum、Candida chauliodes、延古月索假丝酵母（Candida corydalis)、Candida dosseyi、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)、Candida ergatensis、Candida fructus、光滑假丝酵母（Candida glabrata)、发酵假丝酵母（Candida fermentati)、吉 利蒙假丝酵母（Candida guiIliermondii)、黑马朗假丝酵母（Candida haemulonii)、 Candida insectamens、Candida insectorum、中型假丝酵母（Candida intermedia)、 Candida jeffresii、乳酒假丝酵母（Candida kefyr)、克鲁斯氏念珠菌（Candida krusei)、 葡萄牙假丝酵母（Candida lusitaniae)、Candida lyxosophila、麦芽糖假丝酵母（Candida maltosa)、膜醭假丝酵母（Candida membranifaciens)、梅林假丝酵母（Candida milleri)、 撤揽假丝酵母（Candida oleophila)、俄勒同假丝酵母（Candida oregonensis)、近平滑 念珠菌（Candida parapsilosis)、桔假丝酵母（Candida quercitrusa)、休哈塔假丝酵 母（Candida shehatea)、Candida temnochilae、纤维假丝酵母（Candida tenuis)、热 带假丝酵母(Candida tropicalis)、Candida tsuchiyae、Candida sinolaborantiu、 大显假丝酵母（Candida sojae)、维斯假丝酵母（Candida viswanathii)、产I元假丝酵 母（Candida utilis)、Oogataea minuta、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens)、 Pichia silvestris、膜醭毕赤酵母、Pichia chodati、膜醭毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、 Pichia minuscule、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)、Pichia pseudopolymorpha、 Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichia silvestrisi、Pichia strasburgensis、陆生毕赤酵母(Pichia terricola)、Pichia vanriji、Pseudozyma Antarctica、圆红冬抱酵母菌（Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母（Rhodotorula glutinis)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、 Saccharomyces momdshuricus、葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum)、贝酵母、酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)、二抱酵母（Saccharomyces bisporus)、谢瓦利埃酵 母（Saccharomyces chevalieri)、德尔布酵母（Saccharomyces delbrueckii)、少抱 酵母（Saccharomyces exiguous)、发酵性酵母（Saccharomyces fermentati)、脆壁酵 母（Saccharomyces fragilis)、Saccharomyces marxianus、蜂蜜酵母（Saccharomyces mellis)、罗斯酵母（Saccharomyces roseii)、鲁酵母（Saccharomyces rouxii)、葡萄 汁酵母（Saccharomyces uvarum)、魏氏酵母（Saccharomyces willianus)、路氏类酵母 (Saccharomycodes Iudwigii)、荚复膜抱酵母（Saccharomycopsis capsularis)、扣囊复膜 酵母（Saccharomycopsis fibuligera)、扣囊复膜酵母、Endomyces hordei、Endomycopsis fobuligera. Saturnispora saitoi、八抱裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus)、 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis)、德尔布有抱圆酵母（Torulaspora delbrueckii)、德尔布有抱圆酵母、 Saccharomyces dairensis、德尔布有抱圆酵母、Torulaspora fermentati、发酵性酵 母（Saccharomyces fermentati)、德尔布有抱圆酵母、罗斯有抱圆酵母（Torulaspora rosei)、罗斯有孢圆酵母、德尔布有孢圆酵母、罗斯酵母、德尔布有孢圆酵母、德尔布酵 母、德尔布有抱圆酵母、德尔布酵母、Zygosaccharomyces mongolicus、Dorulaspora globosa、球形德巴利酵母（Debaryomyces globosus)、球拟圆酵母（Torulopsis globosa)、 皮状丝抱酵母（Trichosporon cutaneum)、三角酵母（Trigonopsis variabilis)、 Williopsis californica、土 星拟威尔酵母（Williopsis saturnus)、二抱接合酵 母(Zygosaccharomyces bisporus)、二抱接合酵母、Debaryomyces disporua、二抱 酵母（Saccharomyces bisporas)、二抱接合酵母、二抱酵母、Zygosaccharomyces mellis、Zygosaccharomyces priorianus、Zygosaccharomyces rouxiim、鲁氏接合酵 母（Zygosaccharomyces rouxii)、巴格式结合酵母(Zygosaccharomyces barker i)、 鲁酵母、鲁氏接合酵母、酱醒接合酵母（Zygosaccharomyces majori)、Saccharomyces rousii、异常毕赤酵母（Pichia anomala)、牛毕赤酵母（Pichia bovis)、加拿大毕赤酵 母（Pichia Canadensis)、卡氏毕赤酵母（Pichia carsonii)、粉末毕赤酵母（Pichia farinose)、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans)、Pichia fluxuum、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens)、Pichia pseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、 Pseudozyma Antarctica、圆红冬抱酵母菌（Rhodosporidium toruloides)、圆红冬抱酵 母菌、胶红类酵母菌（Rhodotorula glutinis)、贝酵母（Saccharomyces bayanus)、贝酵 母、二孢酵母、酿酒酵母、谢瓦利埃酵母、德尔布酵母、发酵性酵母、脆壁酵母、路氏类酵母 (Saccharomycodes Iudwigii)、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母、德尔布有孢圆酵母、球有孢 圆酵母（Torulaspora globosa)、变异三角酵母（Trigonopsis variabilis)、Williopsis californica、土星拟威尔酵母、二孢接合酵母、Zygosaccharomyces mellis、鲁氏接合酵 母。例示性的丝状真菌包括曲霉属（Aspergillus)的多种物种，包括但不限于浅蓝灰曲霉 (Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉（Aspergillus candidus)、肉色曲霉（Aspergillus carneus)、棒曲霉（Aspergillus clavatus)、弯头曲霉（Aspergillus deflectus)、黄曲 霉（Aspergillus flavus)、烟曲霉（Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉（Aspergillus glaucus)、构巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉、赫曲霉（Aspergillus ochraceus)、 米曲霉（Aspergillus oryzae)、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)、帚状曲霉 (Aspergillus penicilloides)、局限曲霉（Aspergillus restrictus)、酱油曲霉 (Aspergillus sojae)、聚多曲霉（Aspergillus sydowi)、溜曲霉（Aspergillus tamari)、 土曲霉（Aspergillus terreus)、焦曲霉（Aspergillus ustus)、或花斑曲霉（Aspergillus versicolor)。在如本文中规定的遗传工程前，此类细胞可以获自多种商业来源和研究资源 机构，诸如例如，美国典型培养物保藏中心（Rockville, MD)。
[0093] 在编码甘露糖苷酶、GAA、和/或碱性蛋白酶的外源核酸外，细胞的遗传工程可以 包括一处或多处遗传修饰，诸如：（i)编码外部链延长（Outer CHain elongation, 0CH1)蛋 白的内源基因的缺失；（ii)引入编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽（例如来自解脂耶氏 酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、巴斯德毕赤酵母、或白念珠菌的MNM多肽，或来自巴斯 德毕赤酵母的PNOl多肽）的重组核酸以提高甘露糖残基的磷酸化；（iii)干扰OCHl蛋白 的功能性表达的RNA分子的引入或表达；（iv)引入编码具有N-糖基化活性的野生型（例 如内源或外源）蛋白质的重组核酸（即表达具有N-糖基化活性的蛋白质）；或（V)改变 编码具有N-糖基化活性的蛋白质的一个或多个内源基因的启动子或增强子元件，如此改 变其编码蛋白质的表达。RNA分子包括例如小干扰RNA(SiRNA)，短发夹RNA(shRNA)，反义 RNA，或微小RNA (miRNA)。遗传工程化还包括改变编码具有N-糖基化活性的蛋白质的内源 基因以生成具有添加（例如异源序列）、缺失、或取代（例如突变，诸如点突变，保守或非保 守突变）的蛋白质。突变可以特异性引入（例如通过定点诱变或同源重组）或可以随机 引入（例如，细胞可以化学诱变，如记载于例如Newman and Ferro_Novick(1987)J. Cell Biol. 105(4) :1587 的）。
[0094] 本文中描述的遗传修饰可以导致下列一项或多项：（i)经遗传修饰的细胞中的一 种或多种活性的升高，（ii)经遗传修饰的细胞中的一种或多种活性的降低，或（iii)经遗 传修饰的细胞中的一种或多种活性的定位或胞内分布的变化。应当理解，特定活性（例如 促进甘露糖基磷酸化）的量增加可以由于过表达一种或多种能够促进甘露糖基磷酸化的 蛋白质、内源基因的拷贝数目增加（例如，基因复制）、或刺激由基因编码的蛋白质表达升 高的内源基因的启动子或增强子的变化所致。一种或多种特定活性的降低可以是由于突变 体形式（例如，显性负性形式）的过表达、导入或表达降低具有特定活性的一种或多种蛋白 质的表达的一种或多种干扰RNA分子，或删除编码具有特定活性的蛋白质的一种或多种内 源基因所致。
[0095] 为了通过同源重组破坏基因，"基因替换"载体可以以如下的方式构建以包含选择 标志物基因。选择标志物基因可以在5'和3'端两者与足以介导同源重组的长度的基因的 部分可操作连接。选择标志物可以是互补宿主细胞营养缺陷型或提供抗生素抗性的众多基 因之一，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合适的选择标志物包括CAT基因，其对酵母细 胞赋予氯霉素抗性，或IacZ基因，其由于表达β-半乳糖苷酶而导致蓝色菌落。然后，使用 本领域中公知的方法（见下文）将基因替换载体的线性化DNA片段导入细胞中。线性片段 对基因组的整合和基因的破坏可以基于选择标志物测定，并且可以例如通过Southern印 迹分析确认。可以通过例如Cre-IoxP系统（参见下文）从宿主细胞的基因组中除去选择 标志物。
[0096] 或者，基因替换载体可以以如下的方式构建，使得包含要破坏的基因部分，该部分 缺乏任何内源基因启动子序列并编码无一基因编码序列或基因编码序列的无活性片段。 "无活性片段"指编码具有从基因的全长编码序列生成的蛋白质的活性的例如小于约10% (例如小于约9 %，小于约8 %，小于约7 %，小于约6 %，小于约5 %，小于约4%，小于约3 %， 小于约2%，小于约1%，或0%)的蛋白质的基因片段。将此类基因的部分以如下的方式在 载体中插入，使得无已知启动子序列与基因序列可操作连接，但是终止密码子和转录终止 序列与基因序列的部分可操作连接。随后，可以将此载体在基因序列的该部分中线性化，并 转化到细胞中。通过单同源重组，此线性化载体然后被整合在基因的内源对应物中。
[0097] 表达载体可以是自主的或整合的。可以将重组核酸（例如编码甘露糖苷酶，GAA， 或碱性蛋白酶的重组核酸）以表达载体形式诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒或病毒颗粒导 入细胞中。可以将重组核酸在染色体外维持或者可以将其整合入酵母细胞染色体DNA中。 表达载体可以含有编码在选定的条件下对于细胞存活力需要的蛋白质的选择标志物基因 (例如，URA3,其编码尿嘧啶生物合成必需的酶，或TRP1，其编码色氨酸生物合成需要的酶） 以容许检测和/或选择用期望的核酸转化的那些细胞（见例如美国专利No. 4, 704, 362)。 表达载体还可以包含自主复制序列（ARS)。例如，美国专利No. 4, 837，148描述了提供适合 于维持巴斯德毕赤酵母中的质粒的手段的自主复制序列。
[0098] 整合性载体披露于例如美国专利No. 4, 882, 279。整合性载体一般包含至少第一 可插入DNA片段、选择标志基因、和第二可插入DNA片段的连续排列序列。第一和第二可插 入DNA片段各为约200 (例如，约250、约300、约350、约400、约450、约500、或约1000或更 多）个核苷酸的长度，并且具有与要转化的物种的基因组DNA的一部分同源的核苷酸序列。 含有表达的感兴趣基因（例如，编码GAA的基因）的核苷酸序列在此载体中在第一和第二 可插入DNA片段间插入，无论在标志物基因之前还是之后。可以在酵母转化前将整合性载 体线性化以便于感兴趣的核苷酸序列对宿主细胞基因组的整合。
[0099] 表达载体的特征可以是在酵母（例如，解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、巴 斯德毕赤酵母、或其它合适的真菌物种）启动子（其使它们能够在真菌细胞中表达）的控 制下的重组核酸。合适的酵母启动子包括例如ADC1、TPI1、ADH2、hp4d、Ρ0Χ、和GallO (参 见例如 Guarente 等（1982)Proc. Natl. Acad Sci. USA 79(23):7410)启动子。其它合适的 启动子记载于例如 Zhu and Zhang(1999)Bioinformatics 15(7-8) :608-611 及美国专利 No. 6, 265, 185。
[0100]启动子可以是组成性或诱导型（条件性的）。组成性启动子理解为其表达在标准 的培养条件下恒定的启动子。诱导型启动子是响应一种或多种诱导信号的启动子。例如，可 以将诱导型启动子化学调节（例如，其转录活性受到化学诱导剂诸如醇、四环素、类固醇、 金属、或其它小分子的存在或缺乏调节的启动子）或物理调节（例如，其转录活性受到物理 诱导物诸如光或高或低温的存在或缺乏调节的启动子）。也可以通过自身受到化学或物理 信号直接调节的一种或多种转录因子间接调节诱导型启动子。
[0101] 应当理解，其它遗传工程修饰也可以是条件性的。例如，可以使用例如，位点特异 性DNA重组酶诸如 Cre-IoxP 系统（见例如 Gossen 等（2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173 及美国申请公开文本No. 20060014264)来条件性删除基因。
[0102] 可以使用多种方法诸如原生质球技术或全细胞氯化锂酵母转化方法来将重组核 酸导入本文中所描述的细胞中。其它可用于将质粒或线性核酸载体转化入细胞中的方法 记载于例如，美国专利 No. 4, 929, 555 ;Hinnen 等（1978) Proc. Nat. Acad Sci. USA 75:1929 ; Ito 等（1983) J. Bacteriol. 153:163 ;美国专利 No. 4, 879, 231 ;及 Sreekrishna 等（1987) Gene 59:115,每篇的公开内容通过提及完整并入本文。也可以使用电穿孔和PEG1000 全细胞转化规程，如由 Cregg and Russel，Methods in Molecular Biology:Pichia Protocols，Chapter 3，Humana Press，Totowa，N.J.，pp. 27-39(1998)所描述的。
[0103] 可以通过使用合适的技术，包括但不限于在转化后在缺乏需要的生物化学产物 (由于细胞的营养缺陷型所致）的情况中培养营养缺陷型细胞，选择并检测新表型，或在存 在抗生素的情况中培养来选择经转化的真菌细胞，所述抗生素在缺乏转化体中含有的抗性 基因的情况中对于酵母是毒性。也可以通过将表达盒整合入基因组中来选择和/或确认转 化体，其可以通过例如Southern印迹或PCR分析来评估。
[0104] 在将载体导入感兴趣的靶细胞中前，可以将载体在细菌细胞诸如大肠杆菌 (Escherichia coli，E.coli)中增加（例如，扩增），如上文描述的。可以通过导致载体DNA 自细菌环境（milieu)纯化的本领域中已知的任何方法来自细菌细胞分离载体DNA。可以用 酚、氯仿、和乙醚来广泛提取纯化的载体DNA，以确保质粒DNA制备物中不存在大肠杆菌蛋 白质，因为这些蛋白质对于哺乳动物细胞可以是毒性的。
[0105] 在一些实施方案中，遗传工程化真菌细胞缺乏OCHl基因或其基因产物（例如mRNA 或蛋白质），并且是OCHl活性缺陷的。在一些实施方案中，遗传工程化细胞表达能够促进甘 露糖基磷酸化的多肽（例如来自解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、巴斯德毕赤酵 母、或白念珠菌的MNM多肽，或来自巴斯德毕赤酵母的PNOl多肽）。例如，真菌细胞可以 表达来自解脂耶氏酵母的MNM多肽（ Genbank?登录号：XM_503217, Genolevures Ref : YALI0D24101g)。在一些实施方案中，遗传工程化细胞是OCHl活性缺陷的，并且表达能够促 进甘露糖基磷酸化的多肽。
[0106] 在脱帽和脱甘露糖基化后，可以分离分子复合物。在一些实施方案中，将分子复 合物在酵母细胞内维持，并且在细胞裂解后释放。在一些实施方案中，经由由指导分子从 细胞中分泌的编码序列（对于外源核酸而言天然的或工程化改造到表达载体中）提供的 机制将分子复合物分泌到培养基中。可以通过多种用于检测分子存在的标准方案，例如用 对GAA特异性的抗体进行的免疫印迹或放射性免疫沉淀，或测试酶比活（specific enzyme activity)(例如糖原降解）确认细胞裂解物或培养基中脱帽且脱甘露糖基化的分子复合 物的存在。
[0107] 在一些实施方案中，在分离后，可以将脱帽且脱甘露糖基化的靶分子或分子复合 物与异源模块附接，例如使用酶促或化学手段。"异源模块"指与改变的靶分子连接（例如 共价或非共价）的任何组成，该组成不同于最初存在于改变的靶分子上的组成。异源模块 包括例如聚合物，载体，佐剂，免疫毒素，或可检测（例如荧光，发光，或放射性）模块。在一 些实施方案中，可以将额外的N-聚糖添加到改变的靶分子。
[0108] 用于检测分子的糖基化的方法包括DNA测序仪辅助（DSA)、荧光团辅助碳水化合 物电泳（FACE)或表面增强的激光解吸/离子化飞行时间质谱术（SELDI-TOF MS)。例如，分 析可以利用DSA-FACE，其中例如，将糖蛋白变性，接着在例如膜上固定化。然后，可以用合适 的还原剂诸如二硫苏糖醇（DTT)或β-巯基乙醇来还原糖蛋白。可以使用酸诸如碘乙酸来 将蛋白质的硫氢基基团羧化。接着，可以使用酶诸如N-糖苷酶F自蛋白质释放N-聚糖。任 选地,可以将N-聚糖重建，并通过还原性胺化来衍生化。例如，可以通过还原胺化在还原端 用突光团，如 APTS (8-氨基花-1，3, 6-三横酸（8-aminopyrene-l, 3, 6-trisulfonic acid)) 标记释放的N-聚糖。标记的化学计量学使得仅将一个APTS分子附接于每个寡糖分子。然 后，可以将衍生化的N-聚糖浓缩。适合于N-聚糖分析的设备包括例如ABI PRISM? 377 DNA 测序仪（Applied Biosystems)。可以使用例如 GENESCAN? 3.1 软件（Applied Biosystems)来实施数据分析。可以用一种或多种酶诸如小牛肠磷酸酶进一步处理分离的 甘露糖蛋白（mannoprotein)以确认其N-聚糖状态。N-聚糖分析的其它方法包括例如质谱 术（例如MALDI-TOF-MS)、正常相的高压液相层析（HPLC)、反相和离子交换层析（例如，在 未标记聚糖时通过脉冲安培计检测，且若将聚糖适当标记，则通过UV吸光度或荧光）。还 可见 Callewaert 等（2〇01)Glycobiology 11(4) :275_281 及 Freire 等（2〇〇6)Bioconjug. Chem. 17(2) : 559-564。
[0109] 工程化细胞的培养
[0110] 本文件还提供了本文中所描述的任何遗传工程化细胞的基本上纯的培养物。如本 文中所使用的，遗传工程化细胞的"基本上纯的培养物"是所述细胞的如下培养物，其中培 养物中活细胞总数的小于约40% ( S卩，小于约：35% ;30% ;25% ;20% ;15% ;10% ;5% ; 2% ;1% ;0. 5% ;0. 25% ;0. 1% ;0. 01% ;0. 001% ;0. 0001% ;或甚至更少）是与遗传工程 化细胞不同的活细胞，例如，细菌、真菌（包括酵母）、支原体、或原生动物细胞。在本上下文 中的术语"约"意味着相关百分比可以是在规定的百分比之上或之下的规定百分比的15% 百分比。如此，例如，约20%可以是17%至23%。遗传工程化细胞的此类培养物包括细胞 和生长、贮存、或转运培养基。培养基可以是液体、半固体（例如，凝胶状培养基）、或冷冻 的。培养基包括在液体中或在半固体培养基中/上生长或在贮存或转运培养基，包括冷冻 贮存或转运培养基中贮存或转运的细胞。培养物在培养容器或贮存容器或基片（例如，培 养皿、烧瓶、或管或贮存小瓶或管）中。
[0111] 可以将本文中所描述的遗传工程化细胞例如，以冷冻的细胞悬浮液在例如含有冻 干保护剂诸如甘油或蔗糖的缓冲液中以冻干细胞贮存。或者，可以将它们例如以例如通过 流化床干燥或喷雾干燥，或任何其它合适的干燥方法获得的干燥细胞制备物贮存。
[0112] 药物组合物和治疗方法
[0113] 可以将本文中描述的GAA分子和分子复合物，例如含有至少一处增强对哺乳动物 细胞内部转运的修饰的分子复合物掺入药物组合物中，所述药物组合物含有治疗有效量的 分子和一种或多种佐剂、赋形剂、载体、和/或稀释剂。可接受的稀释剂、载体和赋形剂通常 没有不利地影响接受体的稳态（例如，电解质平衡）。可接受载体包括生物相容性、惰性或 生物可吸收盐、缓冲剂、寡或多糖、聚合物、粘性改善剂、防腐剂等。一种例示性的载体是生 理盐水（0. 15M NaCl，pH 7. 0至7. 4)。另一种例示性的载体是50mM磷酸钠、IOOmM氯化钠。 关于配制和施用药物组合物的技术的更多详情可参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co.，Easton, Pa.)。补充性活性化合物也可以惨入组合物中。
[0114] 含有具有本文中描述的一处或多处修饰的分子复合物的药物组合物的施用可以 是系统的或局部的。可以如下配制药物组合物，使得它们适合于胃肠外和/或非胃肠外施 用。具体的施用模式包括皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、鞘内、口服、直肠、含服、表面、 鼻、眼、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴系统、阴道、和子宫内施用。
[0115] 施用可以是通过周期性注射药物组合物的推注或者可以通过自外部（例如，IV 袋）或内部（例如，生物可蚀性植入物、生物人工器官、或植入的经改变的N-糖基化分子生 成细胞的集落）的储库的静脉内或腹膜内施用而是不中断的或连续的。见例如美国专利 4, 407, 957, 5, 798, 113和5, 800, 828。可以使用合适的投递手段来实现药物组合物的施用， 诸如：泵（见例如 Annals of Pharmacotherapy, 27:912(1993) ;Cancer, 41:1270(1993); Cancer Research,44:1698(1984);微囊化（microencapsulation)(见例如美国 专利4, 352, 883 ;4, 353, 888 ;和5, 084, 350);连续释放聚合物植入物（见例如 Sabel,美国专利No. 4, 883, 666);宏囊化（macroencapsulation)(见例如美国专利 5, 284, 761，5, 158, 881，4, 976, 859 和 4, 968, 733 及公布的 PCT 专利申请 W092/19195, WO 95/05452);注射（皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、或对其它合适的部位）；或口服施用（在 胶囊、液体、片剂、丸剂、或延长释放的配制剂中）。
[0116] 胃肠外投递系统的例子包括乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输 注系统、泵投递、包囊细胞投递、脂质体投递、针投递注射、无针注射、喷雾器、气雾器、电穿 孔、和经皮贴片。
[0117] 适合于胃肠外施用的配制剂通常含有经改变的N-糖基化分子的无菌水性制备 物，其优选地是与接受体的血液等张的（例如，生理盐水溶液）。配制剂可以以单位剂量或 多剂形式呈现。
[0118] 适合于口服施用的配制剂可以以离散单元呈现，诸如胶囊、扁囊剂、片剂、或锭剂， 它们各自含有预定量的经改变的N-糖基化分子；或水性液体或非水性液体中的悬浮液，诸 如糖楽剂、酏剂、乳剂、或顿服水剂（draught)。
[0119] 可以对哺乳动物（例如，人患者）以例如膏剂、喷雾剂、泡沫、凝胶、油膏、软膏、或 干擦（dry rub)施用适合于表面施用的含有至少一处增强复合物对哺乳动物细胞内部转 运的修饰的分子复合物。干擦在施用部位可以是再水合的。此类分子也可以直接输注入 (例如，浸入并干燥）绷带、纱布、或贴片，其然后可以直接表面应用。此类分子也可以以 半液体、胶化、或完全液体状态在供表面施用的绷带、纱布或贴片中维持（见例如美国专利 No. 4, 307, 717)。
[0120] 可以以本领域技术人员可确定的剂量方案对有此需要的受试者施用治疗有效量 的药物组合物。例如，可以对受试者以每剂〇. 01 μ g/kg至10, 000μ g/kg受试者体重的剂量 系统性施用组合物。在另一个例子中，剂量是每剂1 μ g/kg至100 μ g/kg受试者体重。在 另一个例子中，剂量是每剂1 μ g/kg至30 μ g/kg受试者体重，例如，每剂3 μ g/kg至10 μ g/ kg受试者体重。
[0121] 为了优化治疗效力，首先可以以不同给药方案施用本文中描述的分子复合物。单 位剂量和方案取决于如下因素，其包括例如，哺乳动物物种、其免疫状态、哺乳动物的体重。 通常，可以使用合适的筛选测定法作为临床测试规程的一部分来监测此类分子复合物在组 织中的水平，例如以测定给定治疗方案的功效。
[0122] 本文中描述的分子复合物的给药频率在医学从业人员（例如医生或护士）的技术 和临床判断内。通常，通过可以建立最佳施用参数的临床试验来建立施用方案。然而，从业 人员可以依照受试者的年龄、健康、重量、性别和医学状态来改变此类施用方案。可以根据 治疗是预防性还是治疗性来改变给药频率。
[0123] 可以通过例如细胞培养物或实验动物中的已知药学规程来确定此类分子复合物 或其药物组合物的毒性和治疗效力。例如，可以使用这些规程来测定LD50 (对50%的群体 致死的剂量）和ED50(在50%的群体中治疗有效的剂量）。毒性与治疗效果之间的剂量比 率是治疗系数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。优选展现出高的治疗系数的药物组合 物。虽然可以使用展现出毒性副作用的药物组合物，但是要注意设计如下的投递系统，其将 此类化合物靶向受累组织位置以使对正常细胞（例如，非靶定细胞）的潜在损害最小化，由 此降低副作用。
[0124] 可以在配制合适受试者（例如，人患者）用剂量范围中使用自细胞培养测定法和 动物研究获得的数据。此类药物组合物的剂量一般位于包括具有少许毒性或没有毒性的 ED50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂量形式和所利用 的施用路径。对于如本文中所描述的那样使用的药物组合物（例如，用于治疗受试者中的 代谢紊乱），最初可以自细胞培养测定法评估治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以 达到包括IC50 ( S卩，实现对症状的半最大抑制的药物组合物的浓度）的循环血浆浓度范围， 如在细胞培养中所测定的。可以使用此类信息来更精确地确定人中有用的剂量。可以例如 通过高效液相层析来测量血浆中的水平。
[0125] 如本文中所定义的，分子复合物的"治疗有效量"是能够在经治疗的受试者中产生 医学上期望的结果（例如，改善蓬佩氏病的一种或多种症状）的复合物的量。治疗有效量 (即，有效剂量）可以包括每千克受试者或样品重量毫克或微克量的化合物（例如，每千克 约1微克至每千克约500毫克、每千克约100微克至每千克约5毫克、或每千克约1微克至 每千克约50微克）。
[0126] 受试者可以是任何哺乳动物，例如，人（例如，人患者）或非人灵长类（例如，黑猩 猩、狒狒、或猴）、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、马、一类牲畜（例如，母牛、猪、绵羊、或山 羊）、犬、猫、或鲸。
[0127] 本文中描述的分子复合物或其药物组合物可以作为与用于蓬佩氏病的另一种治 疗的联合疗法对受试者施用。例如，联合疗法可以包括对受试者（例如人患者）施用一种 或多种别的药剂，其对已经形成或有风险形成（由于编码GAA的基因中的突变）蓬佩氏病 的受试者提供治疗益处。如此，化合物或药物组合物和一种或多种别的药剂可以同时施用。 或者，可以首先施用分子复合物，接着施用一种或多种别的药剂，或反之亦然。
[0128] 本文中描述的任何分子复合物可以是冻干的。
[0129] 本文中所描述的任何药物组合物可以与施用用法说明书一起包含在容器、包装、 或分配器中。
[0130] 本文中描述的任何药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器，包装，或分配 器中。在一些实施方案中，组合物可以以一次性管形瓶包装。
[0131] 以下是本发明实施的实施例。它们不应解释为以任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0132] 实施例1
[0133] 用CcMan5和刀豆α -甘露糖苷酶对重纟目huGAA的脱帽和脱甘露糖某化
[0134] 如W02011/039634中描述的，使用解脂耶氏酵母生产菌株0XYY1589生成重组人 GAA (rhGAA)，所述解脂耶氏酵母生产菌株0XYY1589含有三个拷贝的人alpha葡糖苷酶基 因（又称为酸性alpha葡糖苷酶或酸性麦芽糖酶EC3. 2. 1.3)和两个拷贝的解脂耶氏酵母 MNM基因。人GAA的氨基酸序列在图1中列出。菌株0XY1589的基因型如下：
[0135] MatA，leu2_958, ura3_302, xpr2_322，
[0136] gut2_744,ade2_844
[0137] P0X2-Lip2pre-huGAA:URA3Ex::zeta
[0138] P0X2-Lip2pre-huGAA:LEU2Ex::zeta
[0139] P0X2-Lip2pre-hGM_CSF:⑶TEx::zeta
[0140] YlMNN4-P0X2-hp4d-YLMNN4:ADE2::PT targeted
[0141] 用纤维化纤维微细菌甘露糖苷酶（CcMan5)和刀豆α甘露糖苷酶（JbMan) (Sigma Product M7257, 3. OM磷酸铵悬浮液）使RhGAA脱帽并脱甘露糖基化。如下重组生成CcMan5， 首先将编码CcMan5多肽的核酸（图2A)克隆到载体pLSAH36中，该载体pLSAH36含有DsbA 信号序列，并且导致具有N端HIS标签的蛋白质的表达。图2B和2C分别含有具有和没有 信号序列的CcMan5多肽的氨基酸序列。将质粒pLSAH36克隆到大肠杆菌B21细胞中，并使 用Talon柱将驻留于周质中的蛋白质分离并纯化。在使用JbMan的硫酸铵悬浮液前，将其 通过凝胶过滤过Superdex 200柱以除去污染性磷酸酶活性来进一步纯化。
[0142] 通过以对于huGAA: CcMan5: JbMan为100:5:10的w: w比率与CcMan5 (憐酸盐缓冲 盐水（PBS)中约 0· 15-0. 30mg/mL)和 JbMan (PBS 中约 0· 5-lmg/mL) -起温育使 RhGAA (20mM 乙酸钠（NaOAc)缓冲液，pH 5. 0中约5mg/mL的浓度）脱帽并脱甘露糖基化。用500mM NaOAc 缓冲液，pH 5. 0和IOOmM CaCl2稀释总反应体积以获得IOOmM NaOAc和2mM CaCl2的终浓 度。将反应混合物于30°C温育16小时。
[0143] 为了评估脱帽过程及分析纯化的huGAA的N-聚糖概况，将5 μ g糖蛋白的N-聚糖 用N-糖苷酶F (PNGaseF)释放，用APTS (8-氨基-1，3, 6-芘三磺酸；三钠盐）标记，随后在 DSA-FACE (DNA测序仪辅助荧光团辅助碳水化合物电泳）上分析。该方法基本上遵循Laroy 等，Nature Protocols, 1:397-405(2006)中描述的方案。
[0144] 图3A中呈现了用CcMan5和JbMan处理之前（小图B)和之后（小图C)的来自 huGAA(76kD形式）的N-聚糖的DSA-FACE电泳图。小图A是含有用PNGaseF从RNaseB释 放的N-聚糖的参照样品。从加帽的huGAA释放的N-聚糖混合物主要由ManP-Man 8GlcNAc2 和（ManP)2-Man8GlcNAc2组成（图3A，小图B)。比ManP-Man 8GlcNAc2略快运行的峰可以 归为ManP-Man7Gl cNAc2。脱帽和脱甘露糖基化后观察到的主峰可以归为双重磷酸化的 P2-Man6GlcNAc2 和单磷酸化的 P-Man4GlcNAc2、P-Man5GlcNAc2 和 P-Man6GlcNAc2 (小图 C)。
[0145] huGAA的不同经加工形式的脱帽对于76kD形式（小图B)，95kD形式（小图C)和 IlOkD形式（小图D)产生相同的N-聚糖概况（图3B)。
[0146] 实施例2
[0147] IlOkDa rhGAA 的钝化
[0148] 如下从菌株0XYY1589分离rhGAA的IlOkDa形式。在收获后，将培养液离心，并使 用Durapore膜（Merck Millipore)过滤。将硫酸铵（AMS)添加至IM的浓度，并过滤溶质， 之后在疏水性相互作用层析（HIC)柱上加载，该柱在20mM磷酸钠 pH 6, IM硫酸铵中平衡。 用20mM磷酸钠 pH 6洗脱产物。
[0149] 在第二层析柱上加载前，首先将产物经由再生纤维素膜上的切向流过滤（TFF)浓 缩，然后从缓冲液更换为20mM乙酸钠 pH 4. 5。在用20mM乙酸钠 pH4. 5平衡的阳离子交换 层析（CEX)柱上加载此材料。在柱加载后，将其用平衡缓冲液清洗，直到UV吸光度信号达 到基线，然后用20mM乙酸钠 pH 4. 5, 50mM NaCl清洗。将产物在20mM乙酸钠 pH 4. 5, 150mM NaCl中洗脱，并浓缩，并从缓冲液更换成20mM乙酸钠 pH 5。（参见下文）
[0150] 如实施例中描述的那样使样品脱帽并脱甘露糖基化，然后将D-甘露醇添加至 IOOmM的浓度。将所述材料的四分之三使用具有IOkDa分子量截留（MWCO)的再生纤维素膜 经由TFF在柱中减少，并在Superdex 200柱上经由大小排阻层析（SEC)进一步纯化，所述 Superdex 200柱于4°C用25mM磷酸钠 pH6，150mM NaCl，100mM D-甘露醇平衡。然后，在变 性条件下在Cibacron蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上对级分筛选纯度。将合并的级分经由TFF 浓缩，并使用IOkD MWCO(再生纤维素膜，Merck Millipore)的Amicon离心滤器超速离心。
[0151] 实施例3
[0152] IlOkDa rhGAA 的钝化
[0153] 如下从菌株0XYY1589分离rhGAA的IlOkDa形式。在收获后，将材料离心并过滤， 之后将AMS的浓度提高到1M。将溶质再次过滤，并将产物在用20mM磷酸钠 pH 6, IM AMS平 衡的HIC柱上捕捉，并在20mM磷酸钠 pH 6缓冲液中在1至OM AMS的逐步梯度中释放。
[0154] 将洗脱液浓缩，并在 Vivaflow 200 型（PES 膜，IOkD MWCO, Sartorius)上经由 TFF 将缓冲液更换为IOmM BIS-TRIS，pH 6。将经脱盐的材料引入阴离子交换层析（AEC)柱 上。在柱清洗到UV信号几乎达到基线后，应用两相连续盐梯度；第一梯度从0变为0. 3M NaCl，第二梯度从0.3变为IM NaCl。将级分在梯度期间收集，并经由定性4-甲基伞形酮 基-a-D-葡糖吡喃糖苷（4-MUG)筛选GAA。在4-MUG测定法中，通过将反应缓冲液添加至 10 μ 1洗脱级分开始反应，所述反应缓冲液由10:1体积比例的0. 35mM 4-MUG，0. 1% BSA和 IOOmM乙酸钠 pH 4组成。于37°C温育30分钟至1小时后，添加等体积的IOOmM甘氨酸pH 11 以停止反应。在UV光下观察突光生成反应产物4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone) 的释放。
[0155] 将含有GAA的级分合并，并通过Vivaflow 200模块（PES膜，IOkD MWCO, Sartorius)上的TFF和使用IOkD MWCO的Amicon离心滤器（再生纤维素膜，Merck Millipore)进行的超速离心浓缩。
[0156] 将浓缩的材料分成两份，并在Superdex 200柱上进一步纯化，所述Superdex 200 柱于41：用501111磷酸钠？!1 6,2501111恥(：1，0.05%了￥6611-20平衡。随后，在变性条件下 在Cibacron-蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上对级分筛选纯度，并使用对硝基苯磷酸盐（其在 405nm波长测量黄色的对硝基苯酚盐反应产物的酶促释放）使用比色测试测定磷酸酶含 量。
[0157] 从含有GAA的级分制备实验用（pilot)合并物。经由Bradford测定法测定实验 用合并物的总蛋白质。将选择的级分合并以浓缩到Vivaflow 200TFF模块（PES膜，IOkD MWCO, Sartorius)上。使用IOkD MWCO的15ml Amicon离心滤器（再生纤维素膜，Merck Millipore)进一步减少体积。
[0158] 将浓缩的材料进行第二轮大小排阻层析（SEC)，使用与第一 SEC步骤相同的条件 进行。在变性条件下在Cibacron-蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上对级分再洗筛选纯度。将级 分依照选择的实验用合并物合并，并在15ml Amicon离心滤器（IOkD MWC0,再生纤维素膜， Merck Millipore)上浓缩。
[0159] 实施例4
[0160] 95kDa rhGAA 的纯化
[0161] 如下从菌株0XYY1589分离rhGAA的95kDa形式。在收获后，将培养液离心，并使 用Durapore膜（Merck Millipore)过滤。然后，在具有IOkD分子量截留（MWCO)的改良聚 醚砜（PES)膜上经由TFF浓缩产物。将AMS添加至IM的浓度，并过滤溶质，之后在HIC柱 上加载，该HIC柱在20mM磷酸钠 pH 6, IM AMS中平衡。将产物用水洗脱，将洗脱液的pH通 过将IOOmM BIS-TRISpH 6的储液缓冲液添加至IOmM的浓度调节，并将其于4°C贮存13天。
[0162] 在AEX柱上加载前，将产物在具有IOkD MWCO的再生纤维素膜上经由TFF浓缩，并 将缓冲液更换为IOmM BIS-TRIS pH 6。将经脱盐的材料经由AEX层析进一步加工，所述AEX 层析如实施例3中描述的那样实施。将级分在梯度期间收集，并经由定性4-MUG测定法筛 选GAA。将含有GAA的级分合并以进一步纯化。
[0163] 对于第三个层析步骤，将AMS的浓度提高到1M，并且在过滤后，经由HIC进一步纯 化材料。在梯度过程中收集级分期间应用1至OM AMS的连续盐梯度。经由定性测定法对 所有级分筛选GAA，并且将那些含有GAA的级分合并以进一步加工。
[0164] 将合并物使用IOkD MWCO再生纤维素膜的15ml Amicon离心滤器经由超速离心浓 缩，并经由SEC使用与实施例3中所述相同的规程进一步纯化。然后，在变性条件下在经 Cibacron-蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上对级分筛选纯度。将90%纯的GAA级分合并，并首先 在 TFF Vivaflow 200 模块（PES 膜，IOkDMWCO, Sartorius)上浓缩，然后使用 15ml Amicon 离心滤器（IOkD MWC0,再生纤维素膜，Merck Millipore)进行超速离心。将浓缩的材料进 行第二轮SEC，使用与第一 SEC步骤相同的条件进行。使用定性4-MUG GAA测定法对级分筛 选GAA。将具有GAA活性的级分合并并浓缩。
[0165] 在如实施例1中所列的脱帽和脱甘露糖基化后，将D-甘露醇添加至IOOmM的浓 度，并将体积再次减少，之后加载到最终的Superdex 200凝胶过滤柱上，该凝胶过滤柱于 4°C用25mM磷酸钠 pH 6，150mM NaCl，100mM D-甘露醇平衡。使用4-MUG定性测定法对级 分筛选GAA，并将那些含有产物的级分合并并浓缩。
[0166] 实施例5
[0167] 95-1 IOkDa rhGAA 混合物的钝化
[0168] 如下从菌株0XYY1589分离rhGAA的IlOkDa前体和95kDa形式两者。在收获后，将 材料进行第二层析步骤，如实施例2中描述的。在HIC步骤后，将产物浓缩，并经由TFF将 缓冲液更换成IOmM BIS-TRIS pH 6,并在AEX柱上加载。将产物在0至300mM NaCl的单一 步骤中于pH 6(10mM BIS-TRIS)洗脱，然后使用Pellicon XL50TFF模块（具有IOkD MWCO 的再生纤维素膜）浓缩。将一半的材料经由大小排阻层析进一步纯化。如实施例3中描述 的那样实施层析步骤，但是仅基于变性条件下经Cibacron-蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上的 纯度进行级分的选择以进一步加工。
[0169] 将一半的合并物浓缩，并与AEX材料的剩余部分组合。在脱帽和脱甘露糖基化后， 将D-甘露醇的浓度提高到IOOmM,并且遵循与实施例2中的描述相同的规程进行随后的浓 缩和SEC步骤。将级分基于4-MUG定性测定法合并，并与来自实施例6的脱帽产物合并。
[0170] 实施例6
[0171] 95kDa rhGAA 的钝化
[0172] 如下从菌株0XYY1589分离rhGAA的95kDa形式。在收获后，将材料加工，直到且 包括AEX步骤，如实施例3中描述的。在AEX步骤中，相当大量的产物由于加载过程中电导 率的增加而驻留于流过级分中。因此，将流过材料再次渗滤到合适的缓冲液，并进行第二轮 AEX层析。在分开加工后，两个量（批次A和批次B)都来自这里。
[0173] 将批次A与来自实施例5的SEC合并物的剩余部分和来自实施例2的CEX合并物 的剩余部分组合，随后将合并物浓缩并渗滤到含有IOmM BIS-TRIS pH 6, 300mM NaCl的缓 冲液。将材料于30°C温育65h。然后，通过将IM乙酸钠储液缓冲液pH 5添加至125mM的 浓度将PH降低到pH 5,并将样品于30°C再次温育。在24h后，使用40:1重量：重量比产 物的总蛋白含量对蛋白酶混合物用Flavourzyme (Novozymes Corp)( -种来自米曲霉的蛋 白酶混合物）处理产物，并且最后一次于30°C温育。在过夜温育后，经由第一 SEC步骤纯 化材料，所述第一 SEC步骤在与实施例3中的描述相同的条件下实施。将级分合并，该级分 基于还原性条件下经Cibacron-蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶经评估含有纯的产物。在浓缩并 缓冲液更换为20mM乙酸钠 pH 5后，将材料脱帽并脱甘露糖基化，如实施例1中所列的。将 D-甘露醇添加至IOOmM的浓度，并将材料与来自实施例5的脱帽并脱甘露糖基化的材料合 并。如实施例2中所描述的那样实施最终的SEC步骤及随后的样品操作。
[0174] 将批次B与来自实施例3的终产物合并，并将合并物浓缩，并渗滤到含有IOmM BIS-TRIS pH 6, 300mM NaCl的缓冲液。然后，使用与实施例5中的描述相同的重量比将产 物于30°C用米曲霉蛋白酶混合物处理过夜温育时段，然后经由第一 SEC步骤纯化，实施第 一 SEC步骤在如实施例3中描述的相同条件下实施。如实施例5中描述的那样完成产物的 进一步加工。
[0175] 在最终批次中，将来自批次A和批次B的产物以在GAA含量上14:1的比率混合。
[0176] 实施例7
[0177] 76kDa rhGAA 的钝化
[0178] 如下从菌株0XYY1589分离rhGAA的76kDa形式。在收获后，将培养物进行二轮连 续离心。将上清液合并，并将AMS引入到约IM的浓度。在溶解后，将在20mM磷酸钠 pH 6, IM AMS中预平衡的1个体积的HIC树脂在搅动的情况下添加到50个体积的上清液，以在批次 吸收模式（batch uptake mode)中结合产物。将所得的楽体于4°C在不搅动的情况下I&存 过夜。在此时段期间，褐色层停留在溶质上方，该溶质经由温和抽吸在早餐除去。将树脂在 每个轮次中用三个体积的前导缓冲液（20mM磷酸钠 pH 6, IM AMS)清洗三次，之后将其填充 到柱中。将填充树脂清洗，直到UV信号几乎达到基线，然后，用水洗脱产物。通过将IOOmM BIS-TRIS pH 6的储液缓冲液添加到IOmM的浓度调节洗脱液的pH。然后，将材料在袋中无 菌过滤，并且于4°C贮存11天的时段。
[0179] 如实施例4中所描述的，实施第二和第三层析步骤和附随的材料操作。首先， 将第三层析步骤后的合并物在两个平衡偶联的TFF Vivaflow 200模块（PES膜，IOkD MWCO, Sartorius)上浓缩约7倍，然后使用IOkD MWCO的15ml Amicon离心滤器（再生纤维 素膜，Merck Millipore)超速离心。将浓缩的材料分成两份，并使用与实施例4中的描述 相同的条件经由SEC进一步纯化。然后，在变性条件下在经Cibacron-蓝染色的聚丙烯酰 胺凝胶上对级分筛选纯度。将选择的级分合并以浓缩到两个平行偶联的Vivaflow 200 TFF 模块（PES 膜，IOkD MWCO, Sartorius)上。使用 IOkD MWCO 的 15ml Amicon 离心滤器（再 生纤维素膜，Merck Millipore)进一步减少体积。
[0180] 在脱帽和脱甘露糖基化后，将D-甘露醇添加到IOOmM的浓度，并将样品在 Vivaflow 50 TFF模块（PES膜，IOkD MWCO，Sartorius)上再次浓缩，之后加载到最终的SEC 柱上，其以与实施例4中的描述相同的方式实施。将含有产物的级分合并并浓缩。
[0181] 实施例8
[0182] 俥用人工牛色底物对硝某苯某-a -D-葡糖吡喃糖苷对huGAA的不同夺体
[0183] (76,95和IlOkD夺体）的酶促表征
[0184] 使用人工生色底物对硝基苯基-a -D-葡糖吡喃糖苷（PNPG)测定实施例2中获得 的未加工的huGAA(llOkDa)和实施例7(76kDa)，实施例6(95kDa)和实施例4(95kDa)中获 得的经加工的huGAA变体的动力学参数。用商业人α-葡糖苷酶「Myozyme? (阿葡糖苷 酶alpha, Genzyme)进行比较。
[0185] 将酶在含有0. 1 % BSA和IOOmM AMS的IOOmM乙酸钠缓冲液pH 4. 0 (反应缓冲液） 中稀释至20 μ g/ml。将10 μ 1酶溶液一式三份添加到96孔板。将PNPG底物（Sigma)在反 应缓冲液中稀释至多个底物浓度（10,6,4, 2,1. 6,1. 2,0. 8,和0. 4mM)，并将90 μ 1稀释底物 添加至每孔。将酶促反应于37°C温育60分钟，接着添加100 μ 1 10%碳酸钠 ，pH 12以淬灭 反应。于405nm测量吸光度。测量用对硝基酚（PNP)得到的标准曲线以计算每分钟形成的 产物量。以μ M/min表示的速度以产生Michaelis-Menten曲线的不同底物浓度的函数绘 图。依照对Michaelis-Menten等式的直接拟合，使用GraphPad Prism计算Vmax和Km。计 算催化常数kcat和催化效率kcat/Km。各种酶的比活以U/mg报告，其中1个单位定义为在 IOOmM乙酸钠缓冲液，pH 4. 0+0. 1 % BSA和IOOmMAMS中在2mM底物浓度每分钟催化Inmol 底物水解的酶量。表1中显示了结果。
[0186] 表 1
[0187]
【权利要求】
1. 一种分离的分子复合物，其具有酸性alpha葡糖苷酶（GAA)活性，且包含至少两个多 肽，每个多肽与SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区 段通过对SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位 点处的蛋白水解衍生；其中所述分子复合物包含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被 转运到哺乳动物细胞内部的能力增强。
2. 权利要求1的分子复合物，其中每个区段通过对SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列 在氨基酸60和氨基酸65之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生。
3. 权利要求1的分子复合物，所述复合物包含至少三个多肽。
4. 权利要求1-3中任一项的分子复合物，其中所述对SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序 列的蛋白水解进一步包括在SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746 之间的一个或多个位点处的切割或氨基酸137和氨基酸151之间的一个或多个位点处的切 割。
5. 权利要求1-4中任一项的分子复合物，所述复合物包含至少四个多肽。
6. 权利要求5的分子复合物，其中所述蛋白水解进一步包括在SEQIDNO: 1中所列的 氨基酸序列的氨基酸719和氨基酸746之间的一个或多个位点处的切割和在SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列的氨基酸137和氨基酸151之间的一个或多个位点处的切割。
7. 权利要求1-6中任一项的分子复合物，其中至少一个所述多肽包含一个或多个磷酸 化的N-聚糖，且其中所述修饰包含至少一个磷酸化的N-聚糖的脱帽和脱甘露糖基化。
8. 权利要求5的分子复合物，其中所述多肽上至少40%的N-聚糖是脱帽且脱甘露糖 基化的。
9. 权利要求8的分子复合物，其中所述多肽上至少60%的N-聚糖是脱帽且脱甘露糖 基化的。
10. 权利要求8的分子复合物，其中所述多肽上至少80 %的N-聚糖是脱帽且脱甘露糖 基化的。
11. 权利要求8的分子复合物，其中所述多肽上至少90%的N-聚糖是脱帽且脱甘露糖 基化的。
12. 权利要求1-11中任一项的分子复合物，其中每个多肽与SEQIDNO: 1中所列的氨 基酸序列的区段具有至少90%序列同一性。
13. 权利要求1-11中任一项的分子复合物，其中每个多肽与SEQIDNO: 1中所列的氨 基酸序列的区段具有至少95%序列同一性。
14. 权利要求1-13中任一项的分子复合物，其中对于所述至少两个多肽之一，所述区 段包含SEQIDNO: 1的氨基酸22至57,且其中对于所述至少两个多肽之一，所述区段包含 SEQIDNO: 1的氨基酸66至896。
15. 权利要求3-14中任一项的分子复合物，其中对于所述至少三个多肽之一，所述区 段包含SEQIDNO: 1的氨基酸22至57,其中对于所述至少三个多肽之一，所述区段包含 SEQIDNO: 1的氨基酸66至726,且其中对于所述至少三个多肽之一，所述区段包含SEQID NO: 1的氨基酸736至896。
16. 权利要求5-14中任一项的分子复合物，其中对于所述至少四个多肽之一，所述区 段包含SEQIDNO: 1的氨基酸22至57,其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQ IDNO: 1的氨基酸66至143,其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQIDNO: 1 的氨基酸158至726,且其中对于所述至少四个多肽之一，所述区段包含SEQIDNO: 1的氨 基酸736至896。
17. 权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括与至少一个所 述多肽融合的胞外受体的配体。
18. 权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括与至少一个所 述多肽融合的靶向域，其中所述靶向域结合靶细胞的表面上的受体的胞外域。
19. 权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括与至少一个所 述多肽融合的尿激酶型纤维蛋白溶酶原受体。
20. 权利要求1-16中任一项的分子复合物，其中所述至少一处修饰包括与至少一个所 述多肽融合的人胰岛素样生长因子II的识别域。
21. -种组合物，其包含权利要求1-20中任一项的分子复合物，其中所述分子复合物 是冻干的。
22. 权利要求21的组合物，其中所述组合物以一次性管形瓶包装。
23. -种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项的分子复合物和药学可接受载 体。
24. 权利要求23的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内或皮下施用。
25. 权利要求23的组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内输注。
26. -种治疗蓬佩（Pompe)氏病的方法，所述方法包括对诊断为蓬佩氏病的患者施用 权利要求23至25中任一项的所述组合物。
27. 权利要求26的方法，其中所述患者诊断为婴儿期发作性（infantileonset)蓬佩 氏病。
28. 权利要求26的方法，其中所述患者诊断为迟发性蓬佩氏病。
29. -种用于生成分子复合物的方法，所述方法包括使具有SEQIDNO: 1中所列的氨 基酸序列的多肽与蛋白酶接触，所述蛋白酶与SEQIDN0:8中所列的氨基酸序列具有至少 85%序列同一性，其中所述蛋白酶在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处切割 所述多肽。
30. 权利要求29的方法，其中在体外实施所述接触。
31. 权利要求29或权利要求30的方法，其中所述蛋白酶在氨基酸60和氨基酸65之间 的一个或多个位点处切割所述多肽。
32. -种用于生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物的方法， 所述方法包括使分子复合物与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够（i)将甘露糖-1-磷 酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸及（ii)水解末端alpha-1, 2甘露糖，alpha-1, 3 甘露糖和/或alpha-1，6甘露糖连接，所述分子复合物具有GAA活性且包含至少两个多肽， 每个多肽与SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段 通过对SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点 处的蛋白水解衍生，其中至少一个所述多肽包含含有一个或多个甘露糖-1-磷酸-6-甘露 糖模块的磷酸化N-聚糖。
33. 权利要求32的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
34. 权利要求32或33的方法，其中所述甘露糖苷酶是直生刀豆（Canavalia ensiformis)甘露糖苷酶。
35. 权利要求32或33的方法，其中所述甘露糖苷酶是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)甘露糖苷酶。
36. 权利要求32-35中任一项的方法，其中在重组真菌细胞中发生所述接触，所述真菌 细胞表达所述甘露糖苷酶。
37. -种生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物的方法，所 述方法包括使分子复合物与能够水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或 alpha-1，6甘露糖连接的甘露糖苷酶接触，所述分子复合物具有GAA活性且包含至少两个 多肽，每个多肽与SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每 个区段通过对SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或 多个位点处的蛋白水解衍生，其中在所述接触前，至少一个所述多肽包含含有脱帽的甘露 糖-6-磷酸模块的磷酸化N-聚糖。
38. 权利要求37的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族47糖基水解酶。
39. 权利要求37或38的方法，其中所述甘露糖苷酶是斋藤曲霉（Aspergillussatoi) 甘露糖苷酶。
40. 权利要求37的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族92糖基水解酶。
41. 权利要求37或40的方法，其中甘露糖苷酶是纤维化纤维微细菌 (Cellulosimicrobiumcellulans)甘露糖苷酶。
42. 权利要求37的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
43. 权利要求37或权利要求42的方法，其中所述甘露糖苷酶是直生刀豆甘露糖苷酶。
44. 权利要求37-43中任一项的方法，其中在重组真菌细胞中发生所述接触，所述真菌 细胞表达所述甘露糖苷酶。
45. -种生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物的方法，所述方 法包括使分子复合物与能够将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸的 甘露糖苷酶接触，所述分子复合物具有GAA活性且包含至少两个多肽，每个多肽与SEQID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通过对SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生， 其中在所述接触前，至少一个所述多肽包含甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块。
46. 权利要求45的方法，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
47. 权利要求45或46的方法，其中所述甘露糖苷酶是直生刀豆甘露糖苷酶。
48. 权利要求45或46的方法，其中所述甘露糖苷酶是解脂耶氏酵母甘露糖苷酶。
49. 一种生成包含脱帽且脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的分子复合物的方法，所述方 法包括： a)使分子复合物与能够将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸的甘 露糖苷酶接触以使所述分子复合物中的至少一个多肽上的甘露糖-6-磷酸模块脱帽，所述 分子复合物具有GAA活性且包含至少两个多肽，每个多肽与SEQIDNO: 1中所列的氨基酸 序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通过对SEQIDN0:1中所列的氨基酸序列 在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生；并 b)使所述分子复合物与能够水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1，6甘露糖连接的甘露糖苷酶接触。
50. 权利要求49的方法，其中通过两种不同酶催化步骤（a)和步骤（b)。
51. 权利要求49的方法，其中通过单一酶催化步骤（a)和步骤（b)。
52. 权利要求49或50的方法，其中在重组真菌宿主细胞中发生所述接触，所述真菌宿 主细胞表达能够催化步骤（a)的甘露糖苷酶和能够催化步骤（b)的甘露糖苷酶。
53. 权利要求49或51的方法，其中在重组真菌宿主细胞中发生所述接触，所述真菌宿 主表达能够催化步骤（a)和（b)的甘露糖苷酶。
54. 权利要求32-53中任一项的方法，所述方法进一步包括使哺乳动物细胞与包含至 少一个多肽的所述分子复合物接触，所述多肽包含所述脱帽且脱甘露糖基化的N-聚糖，其 中在所述接触后，所述分子复合物以增强的效率转运到所述哺乳动物细胞的内部。
55. 权利要求54的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
56. -种将具有GAA活性的分子复合物转运到细胞内部的方法，所述方法包括使哺乳 动物细胞与所述分子复合物接触，所述分子复合物包含至少两个多肽，每个多肽与SEQID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通过对SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生； 其中至少一个所述多肽上的磷酸化N-聚糖已经如权利要求33-55中任一项的方法中所列 的那样脱帽并脱甘露糖基化。
57. -种将具有GAA活性的分子复合物转运到细胞内部的方法，所述方法包括使哺乳 动物细胞与所述分子复合物接触，所述分子复合物包含至少两个多肽，每个多肽与SEQID NO: 1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通过对SEQIDNO: 1 中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生， 所述分子复合物包含至少一处修饰，其导致所述分子复合物被转运到哺乳动物细胞内部的 能力增强。
58. 权利要求56或权利要求57的方法，其中所述哺乳动物细胞在体外。
59. 权利要求56或权利要求57的方法，其中所述哺乳动物细胞在哺乳动物受试者中。
60. 权利要求58-59中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
61. 权利要求57-60中任一项的方法，其中所述修饰包括与至少一个所述多肽融合的 靶向域，其中所述靶向域结合靶细胞的表面上的受体的胞外域。
62. 权利要求57-60中任一项的方法，其中所述至少一处修饰包括与至少一个所述多 肽融合的尿激酶型纤维蛋白溶酶原受体。
63. 权利要求57-60中任一项的方法，其中所述至少一处修饰包括与至少一个所述多 肽融合的人胰岛素样生长因子II的识别域。
64. -种分离的真菌细胞，其包含编码SEQIDNO: 1中所列的GAA氨基酸序列的核酸和 编码与SEQIDN0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的碱性蛋白酶的核酸， 其中所述真菌细胞生成具有GAA活性且包含至少两个多肽的分子复合物，每个多肽与SEQ IDN0:1中所列的氨基酸序列的区段具有至少85%序列同一性，每个区段通过所述碱性蛋 白酶对SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列在氨基酸50和氨基酸74之间的一个或多个位点 处的蛋白水解衍生。
65. 权利要求64的分离的真菌细胞，每个区段通过所述碱性蛋白酶对SEQIDNO: 1中 所列的氨基酸序列在氨基酸60和氨基酸65之间的一个或多个位点处的蛋白水解衍生。
66. 权利要求64或权利要求65的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶 的核酸，所述甘露糖苷酶能够（i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷 酸及（ii)水解末端alpha-1, 2甘露糖、alpha-1, 3甘露糖和/或alpha-1, 6甘露糖连接。
67. 权利要求64或权利要求65的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码甘露糖苷酶 的核酸，所述甘露糖苷酶能够将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸。
68. 权利要求64或权利要求65的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码甘露糖 苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能够水解末端alpha-1，2甘露糖、alpha-1，3甘露糖和/或 alpha-1, 6甘露糖连接。
69. 权利要求65的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码多肽的核酸，所述多肽能 够促进甘露糖基憐酸化。
70. 权利要求64-69中任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞被遗传工程化改造为 0CH1活性缺陷。
71. -种分离的真菌细胞，其包含编码碱性蛋白酶的外源核酸，所述碱性蛋白酶与SEQ IDN0:8中所列的氨基酸序列具有至少85%序列同一性。
【文档编号】A61K38/47GK104379162SQ201380024824
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2012年3月15日
【发明者】W.沃维肯, K.C.T.A.M.皮恩斯, J.R.L.斯陶特, G.N.派纳尔特 申请人:奥克西雷恩英国有限公司