经生物工程改造的同种异体血管的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于使血管再细胞化的方法。该方法特别地可用于生产同种异体静脉，其中将供体静脉脱细胞化，然后使用全血或骨髓干细胞再细胞化。通过本文公开的方法生产的同种异体静脉对于血管疾病患者的植入或移植特别有利。
【专利说明】经生物工程改造的同种异体血管
[0001]相关申请
本申请要求于2012年3月16日提交的美国临时申请号61/611，810的优先权和权益，该申请的内容以其整体结合到本文中。
[0002]发明背景
血管疾病为全世界数百万人所经历的逐渐增加的健康问题之一。常见的血管手术程序例如冠状动脉旁路心脏手术尝常常需要手术替换血管。当前用于移植物或植入物的血管来源包括患者自己的血管(即，来自四肢)、组织匹配的供体血管、动物血管以及人造血管或合成移植物。遗憾的是，这些替换血管来源具有许多缺点和并发症，例如可用的同种异体血管不足或缺乏、供体缺少和不可获得、开放性差、移植排斥、长度限制、免疫抑制和血栓并发症等。
[0003]因此，存在对同种异体血管及其生产方法的需求。
【发明内容】
[0004]本发明特征在于用于生产同种异体血管的材料和方法。
[0005]本发明提供了使血管再细胞化(recellularizing)的方法，包括向脱细胞化(decellularized)的血管中引入细胞群并在脱细胞化的血管上培养所述细胞群，从而使血管再细胞化。
[0006]本发明特征在于用于向患者提供血管移植物的方法，该方法包括将受试者-来源的细胞群递送至脱细胞化血管；并在脱细胞化血管上培养所述细胞群。在一些方面，脱细胞化血管来自同种异体供体。
[0007]在一个方面，所述细胞群来自全血、骨髓或干细胞。
[0008]在另一个方面，所述细胞群包含内皮细胞和平滑肌细胞。所述干细胞为表达CD133+的细胞。
[0009]在另一个方面，所述细胞群在体外扩大和分化为内皮细胞和平滑肌细胞，然后将内皮细胞和平滑肌细胞引入脱细胞化血管中。
[0010]在进一步的方面，通过注射或灌注将所述细胞群引入脱细胞化血管。
[0011]在另一个方面，细胞群的培养包括灌注内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基。内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的灌注交替给予。交替给予重复至少两次。
[0012]在另一个方面，在脱细胞化血管上培养细胞群导致细胞群分化为内皮细胞和平滑肌细胞。在一些实施方案中，内皮细胞排列在脱细胞化血管外部，所述平滑肌细胞排列在脱细胞化血管腔。
[0013]在前述方法的任一种中，内皮细胞表达VE-钙粘着蛋白、AcLDL、vWF或⑶31。在前述方法的任一种中，平滑肌细胞表达平滑肌肌动蛋白或波形蛋白。
[0014]在一个方面，细胞群的培养为体外培养。
[0015]所述血管为静脉或动脉。
[0016]本发明特征在于通过本文所述方法中的任一种生产的血管。
[0017]本发明特征还在于通过本文所述方法中的任一种生产的血管用于移植的用途。
[0018]除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文所述那些相似或相当的方法和材料可用于实施或检验本发明，下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而不意在限制。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体结合。若不一致，则以本说明书，包括定义，为准。
[0019]本发明一个或多个实施方案的细节在附图和下文说明中阐述。本发明的其它特征、目标和优点将从附图和详述以及从权利要求书中显而易见。
[0020]附图简述
图1显示临床和手术程序之前以及之后的手术区域图片。(A) —期手术前的诊断CT血管造影术。该图像显示肝门内血流集中在肝左部(i)。络脉流入门静脉但未见连续性外部门静脉(ii)。脾增大，并且在食管周围和肝门中可发现络脉。(B-C)在SMV和左侧门静脉之间使用移植物成功手术矫正(meso-Rex)。干细胞衍生的静脉与SMV吻合(i)。静脉移植物与左侧门静脉吻合(ii)。术前超声显示移植物和肝内门静脉中血流25-40 cm/s。(E)手术后1周CT血管造影术显示患者移植物(i)。该图像已经使用3-4个图像重建以使移植物的定位更好地可见。
[0021]图2显示脱细胞化之前和之后髂静脉的宏观和微观视图。(A)从已故供体获得的原始血管。髂静脉的苏木精-伊红染色显示天然移植物中存在核(蓝色)(B)和存在透明内皮层。同一静脉的免疫组织化学显示存在I类MHC (C ;黑褐色染色)但无II类MHC (D)，这是因为EC和SMC不组成型表达II类MHC。(E) 7个去垢剂-酶处理周期后的半透明髂静脉。尽管脱细胞化的组织维持结构完整性，但蓝染细胞核(F)、I类MHC (G)和II类MHC
(H)的不存在表明腔表面以及基质是完全无细胞的。使用ΧΜ-0ΝΕ试剂盒进行流式细胞检测分析以检测抗-内皮细胞抗体。代表性的直方图证明不存在抗-内皮细胞抗体结合(I)，而用阳性对照血清获得阳性反应(J)。黑线代表阴性对照。放大率B-H 20 X。
[0022]图3显示生长在室载玻片上的受体内皮和平滑肌细胞的免疫荧光染色。抗体染色阳性的细胞为绿色，核为蓝色。(A)内皮细胞对于VE-钙粘着蛋白、AcLDL和vWF为阳性。(B)平滑肌细胞对其特异性标志物α-肌动蛋白和波形蛋白染色阳性。(Α)放大率40Χ和(Β)放大率20Χ。
[0023]图4显示经生物工程改造的静脉移植物的宏观和微观视图。两种经生物工程改造的静脉移植物(Α-移植物1)和(Β-移植物2)的肉眼可见照片。C&D免疫组织化学和免疫荧光的阴性对照。用受体的干细胞接种孵育2周后，移植物完全再细胞化(E-J)，如血管壁上汇合的EC单层和血管中膜(media)中平滑肌细胞的存在所证明的。移植物1石蜡切片的IHC染色(褐色)显示覆盖腔(E)和瓣膜(F) 90%的内皮细胞清楚地存在。(G)平滑肌细胞的存在也在血管中膜中可见。移植物2的IF染色显示相似的结果。在腔(H)和瓣膜
(I)中检测到EC(绿色)，在血管中膜中检测到SMC(红色)。放大率20X。
[0024]图5显示移植后的图片。(A)该图像显示移植后一年，移植物(移植物1)在门静脉处狭窄但为开放的。该图像已经使用3-4个图像重建以使移植物全长可见。SMV (i)处的静脉直径为6 _，与左侧门静脉(ii) 4mm接近。(B)显示SMV吻合位点的一期移植物(i)。血管为薄壁以及开放的。(C) 一期移植物接近左侧门脉吻合处(ii)，显示部分由结肠系膜组织狭窄的狭窄移植物。因此使用第二个干细胞衍生的静脉移植物进行meso-Rex分流的手术矫正。(D)该图像显示使用超声剥离器(CUSA)将门静脉进一步剥离入肝脏后完成左侧门静脉吻合，并释放导致结肠系膜中狭窄的组织(iii)。(E)该图像显示通过将新移植物修补(patch)到旧SMV吻合处，完成远侧吻合。24小时后这被修正，并且扩展SMV的开口后吻合增大。(F)超声影像证实移植物中复原的超过20 cm/s的血流(G)和良好的25-40 cm/s的肝内门静脉血流。
[0025]图6显示生物反应器的示意图。血管位于室中心，培养基通过所示导管提供。箭头方向指示导管中溶液的流动。
[0026]图7显示四个供体静脉(左图)、脱细胞化后(中图)和再细胞化后(右图)的一系列照片。
[0027]图8显示通过正常静脉(上部)和脱细胞化静脉(DC，下部)中核的HE染色的组织学分析。9个脱细胞化周期后观察到无核染色。
[0028]图9显示通过正常静脉(上部)和脱细胞化静脉(DC，下部)的马森三色(MT)染色的组织学分析。9个脱细胞化周期后观察到无核染色。MT染色还显示脱细胞化静脉中胶原保持。
[0029]图10显示通过正常静脉(上部)和脱细胞化静脉(DC，下部)的Vernhoeff VonGieson (VVG)染色的组织学分析。9个脱细胞化周期后观察到无核染色。VVG染色还显示脱细胞化静脉中弹性蛋白(和弹性蛋白环)以及胶原保持。
[0030]图11显示通过正常静脉(左部)和脱细胞化静脉(DC，右部)染色的组织学分析。染色显示脱细胞化静脉中胶原I (上部)和胶原IV (下部)保持。
[0031]图12示正常静脉(左部)和脱细胞化静脉(DC，右部)的Vernhoeff Von Gieson(VVG)染色的组织学分析。VVG染色显示脱细胞化静脉中纤连蛋白(上部)和层粘连蛋白(下部)保持。
[0032]图13显示脱细胞化后DNA、胶原和糖胺聚糖(GAG)水平的定量，分别通过凝胶电泳、sircol和bislycan测定进行测定。DNA凝胶(右上部)显示梯对照(L)、脱细胞化静脉(DC)和正常静脉(N)。胶原水平通过sircol测定来测量:原始数据在表中呈现(左中)，定量测定在图中表示(右中)。糖胺聚糖(GAG)水平通过bislycan测定来测量:原始数据在表中呈现(左下)，定量测定在图中表示(右下)。
[0033]图14显示正常静脉中与脱细胞化静脉相比17个血管生长因子的水平。原始数据在表中呈现(左)，在图中定量(右)。
[0034]图15显示HE组织学染色并证明核在再细胞化静脉的内、中和外层中存在。再细胞化静脉经历2个灌注周期(上部)或4个灌注周期(下部)。
[0035]图16显示马森三色(MT)组织学染色，证实存在核、细胞质和细胞附着到胶原。
[0036]图17显示Vernhoeff Von Giesen (VVG)组织学染色，证实存在核、细胞质和细胞附着到胶原。
[0037]图18显示内皮和平滑肌细胞标志物的免疫荧光染色。⑶31 (上部)和VWF (中部)染色证实存在朝向静脉内衬的内皮细胞。SMA (下部)染色证实存在平滑肌细胞。
[0038]图19显示平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学染色证实在静脉的中和外层存在纺锤形平滑肌细胞。
[0039]图20显示脱氧胆酸钠(SDC)脱细胞化后平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学染色。
[0040]图21显示脱氧胆酸钠(SDC)脱细胞化后平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学染色。
[0041]图22显示脱氧胆酸钠(SDC)脱细胞化后平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学染色。
[0042]图23显示拉伸强度测定的定量以及静脉制备和试验的图片。所测量总力(左图)和伸长(右图)的盒须图显示拉伸试验的结果。NHV -天然人静脉；DCHV -脱细胞化人静脉；和RCHV -再细胞化人静脉。
[0043]发明详述
本发明基于以下意想不到的发现:适于手术植入的血管可成功从脱细胞化并随后被移植物受体的自体细胞再细胞化的已故供体静脉生物工程改造。对于由于血栓形成、慢性深静脉机能不全、静脉阻塞或静脉回流而需要旁路手术或血管静脉分流术的患者，可考虑该方法。另外，该技术避免了对终生免疫抑制的需求，是一种具有极大益处和比先前的血管移植方案更低风险的有前景且安全的临床方法。
[0044]本发明提供用于使血管脱细胞化的方法。本文描述了用于血管脱细胞化的方法包括除去内生性细胞，同时保持细胞外基质(ECM)的完整性。本文所述脱细胞化的过程利用两种或更多种不同的细胞破碎溶液连续处理几个周期。在一个优选的实施方案中，脱细胞化可在通过本领域已知的多种方法检测无核残留时实现。血管可为静脉或动脉。血管可来自供体。在一些实施方案中，供体为已故的。在其它实施方案中，供体可来自HLA或组织-匹配供体。
[0045]本发明还提供用于使脱细胞化血管再细胞化的方法，包括向脱细胞化血管引入细胞群并在脱细胞化血管上和脱细胞化血管中培养所述细胞群。本文所述方法可用于细胞群的扩大和细胞群向功能性内皮细胞和平滑肌细胞的分化，以产生功能性血管。
[0046]在一个实施方案中，用于再细胞化的细胞群衍生自干细胞或祖细胞，例如，骨髓衍生的干细胞或祖细胞，或表达⑶133的细胞(⑶133+细胞)。通过本领域已知的方法，干细胞或祖细胞可体外扩大和分化为内皮细胞和/或平滑肌细胞。例如，可在启动向内皮细胞和/或平滑肌细胞分化的某些生长因子和补充剂存在下培养干细胞或祖细胞。在一些方面，弓丨入脱细胞化血管前，分化细胞可不为终末分化，但表达至少一种内皮细胞标志物(即，CD31或vWF)或至少一种平滑肌细胞标志物(即平滑肌肌动蛋白)。如本文所述衍生自干细胞的内皮细胞和平滑肌细胞，例如，通过灌注，引入脱细胞化血管。内皮细胞和平滑肌细胞的培养包括用内皮细胞培养基或平滑肌细胞培养基以交替周期孵育细胞和血管直至达到期需的再细胞化。
[0047]产后血管发生(vasculogenesis)为在成年人中由循环内皮祖细胞(EPC)形成新血管；血管形成(ang1genesis)为从预先存在的内皮细胞形成新血管(Ribatti D等，2001)。这两个过程促成血管分支的形成和致病状态如伤口愈合、缺血、骨折愈合、肿瘤生长等(Laschke等，2011)。全血循环中内皮细胞和内皮祖细胞共同存在，而内皮祖细胞促成血管化(vascularizat1n) (Asahara T等，1997)。此外，平滑肌细胞的祖细胞也存在于全血循环中(Simper D等,2002)。
[0048]在另一个实施方案中，用于再细胞化的细胞群来自全血。使用全血用于脱细胞化血管的再生，将导致血管有效再细胞化而无需从骨髓或全血分离和扩大生成血管的祖细胞亚群。全血，例如，通过灌注，引入脱细胞化血管中。
[0049]相对于当前可用的血管移植物选择，本发明有许多优点。本发明提供具有下列优点的自体经工程改造的血管:1)为非-免疫原性的，因此具有最小的移植物排斥或不良免疫反应风险；2)避免了对免疫抑制的需求，因此手术后以及患者终生中对其风险较低；3)无长度限制；4)与匹配的供体血管或自体血管相比，更容易获得；5)由天然组分(即，ECM、内皮细胞和平滑肌细胞)构成，因此相对于大多数合成和人工血管具有优良的性质，包括保持残留的血管形成生长因子和生物力学完整性；6)与获取自体血管用于移植相比血管产生为轻微侵袭性的；7)全血细胞的使用允许快速而对受试者最小侵袭的程序。
[0050]如本文所使用的，“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可为例如，任何哺乳动物，例如，人、灵长类、鸟、小鼠、大鼠、禽类、狗、猫、奶牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。优选地，哺乳动物为人类。如本文所使用的，“有需要的受试者”为具有血管疾病或病症而需要血管移植物或移植的受试者，或相对于普遍人群具有增加的发展血管疾病或病症风险而需要血管移植物或移植的受试者。
[0051]血管的脱细胞化
本发明提供使血管脱细胞化的方法和材料。如本文所使用的，“脱细胞化”是指从血管除去细胞，使得细胞外基质(ECM)骨架的三维结构保留的过程。组合使用物理方法以及化学和生物试剂裂解细胞，随后通常为漂洗步骤以除去细胞残余物和碎片。有效的脱细胞化取决于例如组织密度和组构、终产物期需的几何学和生物学性质以及靶向的临床应用等因素决定。保留ECM完整性和生物活性的血管脱细胞化可由本领域技术人员例如，通过在处理期间选择特定试剂和技术优化。
[0052]用于脱细胞化的最有效试剂将取决于许多因素，包括细胞结构、密度、脂质含量和血管厚度。应理解的是，尽管大多数细胞去除试剂和方法可改变ECM组成并导致一些程度的超微结构破坏，但优选将这些不良效果最小化。本领域技术人员可容易地优化脱细胞化过程，如本文所述的，以使ECM骨架的破坏最小化。
[0053]一种或多种细胞破碎溶液可用于使血管脱细胞化。细胞破碎溶液通常包含至少一种去垢剂，例如SDS、PEG或Triton X。一种特别优选的去垢剂为Triton X。细胞破碎溶液可包含水从而使该溶液与细胞渗透不相容。或者，细胞破碎溶液可包含缓冲液(例如，PBS)用于与细胞渗透相容。细胞破碎溶液还可包含酶例如，但不限于，一种或多种胶原酶、一种或多种分散酶、一种或多种DNA酶或蛋白酶例如胰蛋白酶。在一些情况下，细胞破碎溶液另外地或者替代地可包含一种或多种酶抑制剂(例如，蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂和/或胶原酶抑制剂)。
[0054]在某些实施方案中，血管可连续用两种或更多种不同的细胞破碎溶液处理。例如，第一种细胞破碎溶液包含1% Triton X-100 (xlOO, Sigma, Sweden),第二种细胞破碎溶液包含1%磷酸三正丁酯(TNBP) 28726.1，VWR, Sweden)，以及第三种细胞破碎溶液包含0.004 mg/ml脱氧核糖核酸酶I (DNase I) (D7291, Sigma, Sweden)。连续处理可包括用处理程序中细胞破碎溶液的至少一种重复处理。在一些方面，血管可通过包括一种或多种细胞破碎溶液以相同顺序连续处理的脱细胞化周期处理，直至达到期需的脱细胞化水平。在一些实施方案中，优选的脱细胞化周期数目为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少19或至少20个周期。期需的脱细胞化所需要的周期数目通过监测血管中核、I类或II类HLA抗原以及其它细胞存在指示的存在情况确定。优选的脱细胞化水平由脱细胞化血管上存在的核的缺乏指示。
[0055]在一些实施方案中，每种细胞破碎溶液可进一步包含额外的组分，例如抗生物(即，青霉素、链霉素和两性霉素)、乙二胺四乙酸(EDTA) 二钠盐脱水物(EDTA)和/或苯甲基磺酰氟(PMSF)。例如，包含DNA酶I的细胞破碎溶液可还包含氯化钙和氯化镁(A12858，Life Technologies)以活化该酶。
[0056]可使用灌注方法与细胞破碎溶液一起处理血管用于血管脱细胞化。交替灌注方向(例如，顺行和逆行)可有助于使血管有效脱细胞化。如本文所述的脱细胞化基本上使血管从内到外脱细胞化，对ECM造成极小的损伤。根据组织的大小和重量以及细胞破碎溶液中的特定去垢剂和去垢剂浓度，血管通常用细胞破碎介质灌注约2-约12小时每克组织。包括洗涤在内，器官可被灌注多达约12-约72小时每克组织。灌注通常被调整至生理学条件，包括搏动血流、速率和压力。如本文所述的灌注脱细胞化可与如，例如，美国专利号6，753，181和6，376，244中所述的浸溃脱细胞化相比。
[0057]在一个优选的实施方案中，血管可充满细胞破碎溶液并同时摇动以使血管脱细胞化。可以按先后顺序加入不同的细胞破碎溶液，并重复该顺序多次直至达到期需的脱细胞化水平。例如，静脉的一个末端可保持开放，而将其余开口(即，磨损处和分支)缝合以防止渗漏。可首先在包含抗生素(0.5%青霉素、0.5%链霉素和0.5%两性霉素B)的PBS中漂洗静脉。然后可在蒸馏水中漂洗静脉72小时。每个脱细胞化周期优选由以下组成:用1%Triton X孵育3小时，接着1% ΤηΒΡ孵育3小时和0.004 mg/ml DNA酶I孵育3小时。最后，可用蒸馏水洗涤血管过夜以除去细胞碎片。在每次孵育中，静脉可充满细胞破碎溶液并且可被夹紧闭合。然后可将静脉放置在37°C振荡器上缓慢摇动，持续孵育时间(3小时或过夜)。每次孵育结束时，可除去血管内容物并用PBS漂洗血管。7-9个(TritonX、TnBP、DNA酶I和水洗)周期加搅拌后，静脉可用PBS连续洗涤48小时，其中PBS每6小时更换。可利用不同浓度的去垢剂(TritonX或ΤηΒΡ)，按照需要或本领域普通技术人员的判定。可利用不同浓度的酶，例如DNA酶，按照需要或本领域普通技术人员的判定。
[0058]任选地，在再细胞化步骤之前可对脱细胞化血管灭菌。例如，将脱细胞化血管在0.1%过乙酸/无菌PBS中孵育1小时，然后用无菌水和PBS洗涤，每种溶液4小时。
[0059]如本文所示，脱细胞化血管基本上由血管树的细胞外基质(ECM)组分组成。ECM组分可包含下列任何或所有:纤连蛋白、原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原家族成员(例如，胶原Ι、ΙΙΙ和IV)、糖胺聚糖、基质、网状纤维和血小板反应蛋白，其可保持有组织的，如确定的结构例如基底膜。成功的脱细胞化定义为使用标准组织染色程序，在组织切片中不存在可检测的肌丝、内皮细胞、平滑肌细胞和核。优选，但非必需地，残留的细胞碎片也已经从脱细胞化器官或组织中除去。
[0060]为了有效地再细胞化和产生同种异体血管，在脱细胞化期间和之后维持ECM的形态学和构造(保持大体上完整)是重要的。如本文所使用的“形态学”是指器官或组织或ECM的总体形状，而如本文所使用的“构造”是指外表面、内表面和其间的ECM。ECM的形态学和构造可目测和/或组织学地检查以证实脱细胞过程没有损害ECM骨架的三维结构和生物活性。染色组织学分析(即，Η&Ε、ΜΤ或VVG)可用于使脱细胞化血管的构造以及ECM组分例如胶原1、胶原IV、层粘连蛋白和纤连蛋白的保持可见。本领域已知的其它方法和测定可用于测定ECM组分例如糖胺聚糖和胶原的保持。重要地，脱细胞化后残留血管形成或生长因子保持与ECM骨架相关。这样的血管形成或生长因子的实例包括，但不限于VEGF-A、FRF-2、PLGF、G-CSF、FGF-1、卵泡抑素、HGF、血管生成素-2、Endoglin、BMP-9、HB-EGF、EGF、VEGF-C、VEGF-D、内皮素_1、瘦素和其它本领域已知的血管形成或生长因子。
[0061]血管的再细朐化
本发明提供用于产生再生血管的材料和方法。再生血管可通过使如本文所述来自供体的脱细胞化血管与细胞群接触并在脱细胞化血管上和脱细胞化血管内培养所述细胞群而产生。如本文所使用的，“再细胞化”是指这样的过程:将细胞引入或递送至脱细胞化血管或ECM骨架，并培养该细胞使得细胞增殖和/或分化以最终再生具有与正常血管相似的构造、细胞组构和生物活性的血管。
[0062]如本文所使用的细胞群可为用于使脱细胞化血管再细胞化的任何细胞。这些细胞可为全能细胞、多潜能细胞(pluripotent cell)或多能细胞(multipotent cell),并且可为非定型的或定型的。另外，用于本发明的细胞可为未分化细胞、部分分化细胞或完全分化细胞。用于本发明的细胞还包括祖细胞、前体细胞和“成体衍生的干细胞。可用于使血管再细胞化的细胞的实例包括，但不限于，骨髓-衍生的干细胞或祖细胞、骨髓单核细胞、间充质干细胞(MSC)、多能成年祖细胞、全血衍生的干细胞或祖细胞例如内皮干细胞、内皮祖细胞、平滑肌祖细胞、全血、外周血以及可从全血分离的任何细胞群。在一些实施方案中，用于使血管再细胞化的细胞群为同种异体的。如本文所使用的“同种异体的”是指获自与器官或组织来源相同的物种的细胞(即，自身或有关或无关个体)。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞来自受体(即，“自体”)。
[0063]所述细胞群全可为异质细胞群。例如，细胞可为全血细胞，或来自全血。这些细胞包括红血细胞、白血细胞、凝血细胞、内皮细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞。本领域已知，循环内皮细胞、内皮祖细胞和平滑肌细胞的祖细胞可有助于血管发生和血管形成。因此，应用全血细胞可容易地提供具有细胞(其能够扩大和分化为用于再生血管的内皮细胞和平滑肌细胞)的脱细胞化血管。
[0064]用于再细胞化的细胞群可从异质细胞群分离。在一个实施方案中，细胞群可为从骨髓分离的干细胞或祖细胞。在另一个实施方案中，细胞群可为从全血分离的内皮细胞或内皮祖细胞。用于从异质群分离特定细胞群的方法为本领域所已知。这样的方法包括lymphotrap、密度梯度、差速离心、亲和层析和FACS流式细胞术。可使用本领域已知的鉴定特定目的细胞群的标志物从异质群分离细胞。例如，已知CD133在衍生自骨髓的干细胞或干细胞样细胞的表面上表达。⑶133+细胞的选择可通过利用MAC珠和识别⑶133的特异性抗体而实现。也可利用内皮祖细胞或平滑肌细胞祖细胞的特异性标志物纯化目的细胞群。
[0065]在一些方面，可体外培养所述细胞群，然后引入脱细胞化血管。体外培养的目的包括扩大细胞数目和使细胞分化为特定的目的细胞谱系。在一些实施方案中，可首先从异质群分离细胞群，然后体外培养。在一些实施方案中，细胞群可为骨髓-衍生的干细胞或祖细胞(即CD1333+细胞)并且可体外分化，然后引入脱细胞化血管。本领域已知多种分化方案，包括，例如，在添加诱导向内皮细胞或平滑肌细胞分化的因子、试剂、分子或化合物的生长培养基中生长细胞。
[0066]引入脱细胞化血管以产生血管的细胞数目可取决于血管的大小(即，长度、直径或厚度)和用于再细胞化的细胞类型(即，干细胞vs.更分化的细胞，例如全血)。关于细胞将达到的群密度，不同类型的细胞可具有不同的趋势。举例来说，脱细胞化器官或组织可用至少约 1,000 (例如，至少 10，000、100，000、1,000，000、10，000，000 或 100,000,000)个细胞“接种”，或可具有约1，000个细胞/mg组织(湿重，即，脱细胞化前)_约10，000，000
个细胞/mg组织(湿重)附着于其上。
[0067]细胞群可通过注射到一个或多个位置而引入(“接种到”)脱细胞化血管。另外，可将超过一种类型的细胞(即，内皮细胞或平滑肌细胞)引入脱细胞化血管。例如，内皮细胞可被引入脱细胞化血管的外部，而平滑肌细胞可被引入血管腔。或者，或除注射外，细胞群还可通过灌注而引入插套管的脱细胞化血管。例如，细胞群可通过灌注而引入脱细胞化血管。细胞灌注后，可通过血管灌注扩大和/或分化培养基以诱导所接种细胞的生长和/或分化。在一些实施方案中，可在引入细胞群前和/或同时给予抗凝剂，例如肝素。
[0068]扩大和分化培养基，如本发明中所使用的，包括包含内皮细胞或平滑肌细胞增殖以及分化为内皮细胞或平滑肌细胞所需补充剂和因子的细胞生长培养基。在一些实施方案中，内皮细胞的分化培养基可与内皮细胞的生长/增殖培养基相同。例如，内皮生长或分化培养基中存在的额外因子或补充剂可包括，但不限于:抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、重组人VEGF、人成纤维细胞生长因子、人上皮生长因子、肝素和硫酸庆大霉素。在一些实施方案中，平滑肌细胞的分化培养基可与平滑肌细胞的生长/增殖培养基相同。例如，平滑肌细胞的生长或分化培养基中存在的额外因子或补充剂可包括，但不限于:平滑肌生长补充剂、平滑肌分化补充剂、MesenPro和转化生长因子β 1。至少，生长和分化培养基包含基础培养基(即，MCDB131、Μ231或DMEM)、热灭活血清(例如，至少10%)、谷氨酰胺和抗生素(即青霉素、链霉素、两性霉素)。
[0069]在一些实施方案中，接种的血管可用内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基交替孵育或灌注直至达到期需的再细胞化。在一些实施方案中，内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基的交替灌注还可重复多次，例如，至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次或至少15次。在一些实施方案中，灌注内皮细胞培养基的持续时间可与灌注平滑肌细胞培养基的持续时间相同。或者，灌注内皮细胞培养基的持续时间可与灌注平滑肌细胞培养基的持续时间不同。灌注分化或生长培养基的持续时间可取决于接种在脱细胞化血管上的细胞群的特征。灌注分化和生长培养基的时间可由本领域技术人员确定。
[0070]再细胞化期间，可将脱细胞化血管维持在其中至少一些所接种细胞可在脱细胞化血管内或在脱细胞化血管上繁殖和/或分化的条件下。那些条件包括，而不限于，适当的温度和/或压力、电和/或机械活动、力、适量02和/或co2、适量湿度、以及无菌或近似无菌条件。再细胞化期间，可将脱细胞化血管和附着在其上的细胞维持在合适的环境中。例如，细胞可需要营养补充剂(例如，营养物和/或碳源例如葡萄糖)、外源性激素或生长因子和/或特定的pH。
[0071]本发明还提供用于在适当条件下使血管再细胞化的生物反应器，如本文中所述。特别地，所述生物反应器包括足够大以适应待再细胞化的血管并且可灭菌的完全密闭室、用于提供细胞和/或培养基与泵送机构(即，蠕动泵)相连的导管、与血管的一个末端相连的结构以及2个入口和2个出口。导管相对于血管和泵的设置允许细胞或培养基流过血管腔，并围绕血管外部流动或浸溃血管外部。描绘示例性生物反应器设置的示意图在图6中示出。
[0072]在一些情况下，通过本文所述方法产生的血管将被移植入患者内。在那些情况下，用于使脱细胞化血管再细胞化的细胞可从该患者获得以使得再生细胞为患者“自体的”。来自患者的细胞可在不同生命阶段(例如，出生前、新生或产期、青春期期间，或作为成人)使用本领域已知的方法从，例如，血液、骨髓、组织或器官获得。或者，用于使脱细胞化器官或组织再细胞化的细胞可为与患者同基因的(即，来自同卵双生)，细胞可为来自，例如，患者亲属或与患者无关的HLA-匹配个体的人淋巴细胞抗原(HLA)-匹配的细胞，或细胞可为与患者同种异体的，来自，例如，非-HLA-匹配供体。
[0073]再细胞化期间可监测所接种细胞的进展。例如，再细胞化期间脱细胞化血管或组织上或脱细胞化血管或组织中的细胞数目可通过在一个或多个时间点取活组织标本估计。另外，可通过测定各种标志物是否存在于细胞或细胞群中而监测细胞所经历的分化量。与不同细胞类型和那些细胞类型的不同分化阶段有关的标志物为本领域所已知，并且可使用抗体和标准免疫测定、免疫荧光、免疫组织化学或组织学技术容易地检测。例如，为了证实内皮细胞或具有内皮谱系分化型的细胞的存在情况，可测定本领域已知的任何内皮标志物。优选的内皮标志物包括，但不限于⑶31、VWR、VE-钙粘着蛋白和AcLDL。例如，为了证实平滑肌细胞或具有平滑肌细胞谱系分化型的细胞的存在情况，可测定本领域已知的任何平滑肌细胞标志物。优选的平滑肌细胞标志物包括，但不限于平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。当在经工程改造的血管表面适当表达至少一种内皮标志物并且在经工程改造的血管腔适当表达至少一种平滑肌标志物时实现再细胞化。
[0074]在一些实施方案中，可检验经工程改造的血管的拉伸强度。拉伸强度试验为本领域已知。例如，可将经工程改造的血管横向切为环形段并通过径向变形检验。可计算用于完全断裂样品的总力和50%总力时的伸长以测定拉伸强度。在一些实施方案中，再细胞化血管显示了与脱细胞化血管相比增加的拉伸强度。例如，本发明经工程改造的血管可显示经受相对于脱细胞化血管10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多的总力。在其它实施方案中，再细胞化血管显示与正常血管相似或大约相同的拉伸强度。
实施例
[0075]实施例1:使用骨髓的生物工程改造的血管
此实施例描述了在患有EHPV0的十岁女孩儿中使用脱细胞化供体静脉(用自体干细胞再细胞化)的meso Rex程序。
[0076]肝外门静脉阻塞(EHPV0)为自肠系膜上静脉(SMV)、脾静脉(SV)、冠状静脉(CV)经门静脉(PV)的肝-足(hepato-pedal)血流受损的病况。
[0077]述
一个一岁大的女孩被发现具有血小板减少症和脾肿大。认为她患有特发性血小板减少性紫癜(ITP)，并在一家当地医院随访了数年。当她9.5岁大时进行了进一步调查并证实了食管静脉曲张和脾肿大。INR轻微升高。蛋白-S和蛋白-C显示正常水平，并排除了 APC-抵抗。她用β阻断剂进行治疗以减轻门脉高血压。
[0078]弹性成像(Elastography, Fibroscan)正常(刚度核心4.6)。CT-血管造影术显示门静脉血栓形成，伴随肝韧带中侧支循环和开放的肠系膜上静脉(SMV)(图1A)。开始了用阻断剂和质子泵抑制剂治疗。由于门脉高血压和食道静脉曲张发展，对她进行了评估并接受了旁路手术(meso Rex)。以防脐静脉不开放，计划将自体干细胞衍生的静脉移植物作为挽救程序。备选方案是使用来自患者或来自同种异体供体的另一血管，或实施肝移植，后两个需要终生免疫抑制。颈内静脉两侧均为开放的(超声和CT)，但移植物的估计长度比左侧门静脉到SMV的距离短。肝内门脉血管床难以可见。这可能由几乎9年的EHPV0导致。
[0079]供体静脉的脱细胞化
从不存在感染或其它疾病的健康30岁器官移植供体上取回9 cm静脉段。静脉的一端保持开放，而其余开口被缝合以防止渗漏。在包含0.5%青霉素、0.5%链霉素和0.5%两性霉素B的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗静脉。最初，在蒸馏水(D/W)中漂洗组织72 h。每个脱细胞化周期由以下组成:用l%Triton X (3小时)，接着1%磷酸三正丁酯(3小时)和0.004mg/ml脱氧核糖核酸酶I (均为Sigma, Gothenburg, Sweden)/1 Μ氯化钠(3小时)孵育。移植物的一端保持开放，而其它被夹紧，并用1% Triton X (Sigma, Gothenburg, Sweden)充满腔。然后夹紧另一端并置于37°C振荡器缓慢摇动3 h。孵育时间结束时，打开样品的一端，排空腔的内含物并用PBS洗涤样品。依照相同的程序，用磷酸三正丁酯(Sigma)和DNA酶(Sigma)处理。最后，用蒸馏水洗涤样品过夜以除去细胞碎片。运行了 7个周期。脱细胞化过程结束时，用PBS连续洗涤移植物48小时(每6小时更换)。用于脱细胞化的所有溶液包含上文提及的抗生素。每个周期之后筛查小块组织的核、I和II类HLA抗原的存在情况并使用标准程序组织学上验证。
[0080]受体自体内皮和平滑肌细胞的制备
自体受体细胞从获自受体的20 ml骨髓制备。首先在淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)上分离骨髓并用Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM)洗涤三次。内皮细胞用⑶133包覆的Mini MACS珠按照制造商的说明书分离。将所获得的CD133+细胞数目计数并使用台盼蓝检验活力。将⑶133+细胞在0.2 %明胶包覆的培养孔中于37°C和95%空气和5% C02的增湿气氛中培养。用于完全培养基的制备:基础培养基MCDB 131+10%热灭活人AB血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素+添加包含抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、重组人血管内皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、人上皮生长因子、肝素和硫酸庆大霉素的EGM-2 Single Quote 试剂盒(Lonza, Walkersville、MD USA)。培养基每 2-3 天更换。通过胰酶消化从所有孔分离汇合细胞，合并，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次。培养的第一代自体受体内皮细胞用双色免疫荧光针对VE钙粘着蛋白、乙酰化LDL和von ffillebrand因子染色，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染以证实内皮表型，然后附着于生物反应器的基质上。
[0081]对于平滑肌细胞，从骨髓分离的细胞生长在可市售获得的平滑肌细胞培养基(Cascade B1logies-培养基231+生长因子补充剂cat.n0.S-007-25)中。将细胞计数并以IX 106每mL的密度接种在75 cm2烧瓶中。细胞在完全培养基中生长，每3天更换培养基。当细胞达到90%汇合时，去除上清液并用PBS洗涤细胞，然后用IX胰蛋白酶-EDTA传代。为了诱导平滑肌分化，将培养基改变为包含平滑肌细胞分化补充剂(Cascade B1logics-cat.n0.S-008-5)的完全培养基。培养的自体受体平滑肌细胞用免疫荧光组织学针对α肌动蛋白和波形蛋白染色，用DAPI复染以证实平滑肌细胞表型，然后附着于生物反应器中的基质上。
[0082]细胞接种
从培养烧瓶中分离内皮细胞，在其生长特异性培养基中稀释，并用微量注射器纵向施于基质内表面上。每平方厘米移植物表面接种的EC平均数目为7.5x 104。将开放末端夹紧并将基质置于37°C 5% COj^rock’n roller上。3天后，用相同密度的悬浮在平滑肌细胞分化培养基中的平滑肌细胞接种内表面并进一步孵育3天。然后将基质置于生物反应器中。内部加入无血清的内皮细胞培养基(无血清培养基)(25 ml)，外部加入无血清的SMC分化培养基(25 ml)，以每分钟1.5转开始转动(37°C，5% C02)。外部和内部的培养基每72小时更换。使用可市售获得的试剂盒(Invitrogen, Sweden, cat.N0.C-7028)检验所提取培养基的微生物定殖。生物反应器培养的总时间段为两周。
[0083]手术程序
手术计划在静脉移植物准备好的日期。手术时将其从生物反应器转移至冷储存溶液中。用Mercedes样切口切开患者，使肝韧带和门暴露。从脐至肝小心调动圆韧带。找到了脐静脉，其非常小而且仅部分开放。发现腹部左部静脉曲张并且扩大的脾充满左季肋部。曲张静脉的质量差，不适于旁路。未探究颈静脉的术前长度，这是由于估计其长度用于旁路过短。
[0084]开始剥离门，接着圆韧带下至发现开放的左侧门静脉。肝外右侧门静脉较细并且未发现胰上的常见门静脉。左侧门静脉的进一步剥离包括在接合处打开脐静脉。发现可通过扩张去除纤维韧带，显示出具有良好回流的良好左侧门静脉。将腔扩大至15 _。未鉴定右侧门静脉，看到了 3段至4段的小分支。
[0085]下一步包括找到肠系膜上静脉(SMV)。鉴定了 Treitz韧带，调动十二指肠以暴露肠系膜下静脉。通过追踪该静脉，可容易地调动脾静脉和SMV。SMV为开放和扩大的。
[0086]采取使用干细胞衍生的静脉的决定，这是因为没有使用该儿童自己的静脉而无使用颈静脉、髂静脉或隐静脉组合的大量额外手术的好的替代。没有旁路的情况下，肝或多脏器移植将为选择。
[0087]将接种干细胞的静脉带至手术室。选取并制备合适长度的Y形移植物用于旁路。通过调动后夹紧SMV首先进行与SMV的吻合。移植物用5-0 Surgipro?从末端到侧边缝合，然后用移植物上的血管夹释放夹子(图1B)。将移植物置于胰腺上方但在结肠和胃下方。逐步移走血管夹以再次确保移植物无渗漏。接着，将一个夹子放在肝内左侧门静脉上，移植物与门静脉吻合(图1C)。移植物比门静脉大，但通过调整缝线将此克服。
[0088]术后监测
再灌注很顺利。手术中测量到门静脉中25-30 cm/s以及动脉中40 cm/s的良好血流并用超声确认(图1D)。程序起始时手术中门静脉压力为20mm Hg，但门静脉再灌注后未测量。第一周用每日两次超声然后第二周期间每日超声跟踪患者。在一些左侧门脉分支中血流高达80cm/s，而在右侧门静脉中观察到较低的15cm/s的血流。手术后1周使用CT血管造影术使移植物可见，发现其为开放的(图1E)。术后超声注意到术后第七天门脉吻合位点处血管壁轮廓改变，放射科医生不能排除此位点血栓形成。因此，手术后患者每日静脉给予6次肝素? 1000IE，接着每日超声两次以监测这一发现。几天后，患者伤口包扎处出血并且血红蛋白降低，但不需输血。同一天发现APTD210，可能是由肝素处理导致，因此暂时停止。患者在第一个月连续监测，进行供体抗原、肝酶的连续血液检验和使用超声进行血流速度成像。移植后的第3、6、9和12个月进行相似的检验。
[0089]抗内皮细胞抗体筛查
移植前和移植后均进行抗-内皮细胞抗体的筛查。血清样品在一个月前、第1和3周、移植后1、3、6、9和12个月收集。每一次，使用市售ΧΜ-0ΝΕ?试剂盒按照制造商(AbSorberAB, Stockholm, Sweden)的说明书从患者的血液样品新鲜分离表达血管生成素受体Tie_2的外周血单核细胞(PBMC)。细胞立即在Guava流式细胞仪(Millipore, Gothenburg,Sweden)上使用Guava分析软件进行分析。来自已知无任何抗体的健康非输血血型AB男性的血清用作阴性对照。来自由于多次输血或器官移植导致形成同种抗体的患者的血清库用作阳性对照。来自尸体供体的冷冻淋巴细胞也用作用于筛查抗-供体HLA抗体和抗-内皮细胞的靶标，如上文所述。
[0090]益果
使用Triton、TnBP和DNA酶，7个周期后将供体静脉成功脱细胞化。脱细胞化之前和之后髂静脉的总体形态学在图2A-H中示出。然而脱细胞化静脉的构造与天然对照不同(图2B)。第7个周期结束时在脱细胞化静脉移植物上未发现核或I或II类HLA抗原表达(图2F-H)。整个脱细胞化程序耗时12天，结束时发现静脉被成功脱细胞化(基于组织学发现)。从患者骨髓分离的⑶133+干细胞非常容易地分化为表达VE-3粘着蛋白、AcLDL和vWF的成熟内皮细胞(图3)。相似地，可成功从骨髓细胞生长平滑肌细胞，其稍后分化为表达α -平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的细胞(图3)。用于分离和扩大EC和SMC的总时间为约15天。
[0091]第4代的两种细胞类型被用于静脉移植物的再细胞化。使用的两个移植物的总图在图4A&B中示出。所有的细胞在临接种前再次表征，发现表达所需的表型标志物。在再细胞化静脉中，通过免疫组织化学和免疫荧光检测，EC存在于腔中，而SMC迁移至组织壁中(图4)。此外，在生物反应器中培养后两种细胞类型均表达其特异性标志物(图4E-H)。如该图中所见，移植入患者前发现约80-90%的腔被内皮层覆盖。还发现移植物中大部分瓣膜再内皮化(图4E和4H)。基于这些结果，决定开始进行移植。抽吸骨髓后用于制备供移植的移植物(包括在生物反应器中培养)的总时间为约一个月。
[0092]该程序后3周，患者出院，除INR (1.4)外肝功能检验(LFT)正常。她应答更快并且比移植前更警觉。随访4.5周后患者具有正常的肝值包括INR (1.2)，INR从手术前的1.4好转。她明显地较少疲惫并且其父母报告了改善的生活质量。3和6个月检查时患者在超声和正常实验室检验上对于开放移植物表现良好。移植前和/或移植后未检测到任何抗-内皮细胞抗体(图2I&J)。6个月检查后，患者更疲惫，然而实验室检验正常，除了血小板计数减少。就诊后进行的CT血管造影术显示腔从8 _缩减至4-6 mm (图5A)。超声确认了门脉流减少。与儿科小组和父母深入讨论后决定探查患者。
[0093]一期程序后一年，再次探查患者。决定是否可能校正狭窄的移植物或使用替代的来自左侧颈内静脉的自体静脉。预防起见，获得必需的许可后制备了新的如前所述的干细胞衍生静脉(见图4B & H-J)。
[0094]在与SMV的吻合位点，发现直径8 mm的开放移植物(图5B)。移植物在通过结肠系膜的位点压缩，以允许血管“悬挂”在移植物后的组织上。移植物至左侧门静脉的其余部分狭窄至直径4-6 mm但为开放的(图5C)。移植物看起来正常，薄壁。检测到SMV位点处腹膜后腔增厚，如一年前在一期程序手术记录中所注意到的。一旦将导致血管压缩的组织移除，移植物进一步扩大，但由于临近左侧门脉吻合的移植物缩短，最好的解决方案为在该位点放置新静脉并同时探查该吻合。颈内静脉经鉴定太短。因此决定使用新制备的干细胞衍生的静脉移植物。
[0095]使用超声剥离器(⑶SA)剥离左侧门静脉甚至进一步至肝后，从门放置新移植物，并修补SMV吻合(图4D&E)。可记录手术前和手术后移植物和门静脉中超过20 cm/s的血流(图4F&G)。由于血流减少手术后探查患者24小时。与SMV的远端吻合具有凝块，并重做。门脉压力手术前为20mm Hg，再灌注移植物后为13 mm Hg。缝合患者前，将沿着胃较小和较大曲率的络脉结扎。患者未接受任何免疫抑制药物，但一期手术后接受每日一次75 mg水杨酸和10 mg奥美拉唑6个月。β阻断剂在手术当天撤去。第二次手术后，患者静脉给予肝素2周，并在该程序后给予抗凝药6-12个月。
[0096]患者显示身高和体重均改善，并且一年中从137 cm生长至142.5 cm,体重从30.2kg增加至35 kg。
[0097]讨论
这些结果证明使用自体干细胞成功使脱细胞化的人髂静脉再细胞化，其随后被用于门静脉血栓形成患者中肠系膜上静脉和肝内左侧门静脉之间的旁路程序。
[0098]组织学结果显示用Triton-X-TnBP和DNA酶的脱细胞化完全并允许适当保持细胞外基质。已经4个周期后，人静脉可被脱细胞化，伴随核残余。还发现使用Triton-X-TnBP代替脱氧胆酸钠保留更好的胞外基质例如弹性蛋白和纤连蛋白。因此，如供体细胞的不存在所证实的，脱细胞化方案成功应用于人静脉组织。
[0099]据推测完整内皮的存在可促进平滑肌细胞体外迁移入血管中膜。因此，首先，接种内皮细胞，其于3天内在移植物上形成层。之后将平滑肌细胞接种入静脉腔，发现这些细胞24小时后嵌入。然而，静脉的完全再细胞化耗时总共2周。未进行SMC的外部接种，这是因为发现该方法已经成功使SMC在静脉中膜重新增殖。尽管脱细胞化静脉的再-接种不使用灌注进行，但这很重要。已经知道优化腔EC内衬需要剪切应力。开发了使用灌注使血管再细胞化。
[0100]数据提供了以下概念的证明:来自已故供体的同种异体人组织可使用自体干细胞再次工程改造用于成功“个人化”或定制移植。此外发展了新的研究领域，其再生供动静脉瘘患者透析或冠状动脉旁路手术之用的动脉。
[0101]实施例2:使用全血的同种异体血管
产后血管发生为在成年人中由循环内皮祖细胞(EPC)促成新血管形成，而血管形成为从预先存在的内皮细胞形成新血管。这两个过程促成血管分支的形成和在致病状态如伤口愈合、缺血、骨折愈合、肿瘤生长等。循环中内皮细胞和内皮祖细胞共同存在，而内皮祖细胞促成血管化。此外，平滑肌细胞的祖细胞一血管中另一种重要的细胞类型，也存在于循环血液中。
[0102]开发了一种全球临床可行的可靠和可重现的程序。由于全血中存在循环血管形成细胞，因此使用全血用于再生静脉导致有效的血管再细胞化而无需从骨髓或全血分离和扩大血管形成祖细胞的亚群。
[0103]在本发明中，5条人髂静脉通过灌注和搅拌组合脱细胞化，然后通过灌注全外周血接着分别灌注内皮和平滑肌细胞生长培养基而再细胞化。成功的再细胞化过程通过内皮细胞和平滑肌细胞的存在还有机械性能确认。为了检验体内开放性，选择两名患有肝外门静脉阻塞(EPHV0)的患者并移植使用自体外周血再生的经组织工程改造的静脉。随访患者8和6个月。结果证明了该方法在治疗血管疾病患者中的临床潜能。
[0104]材料和方法静脉的脱细胞化
从尸体器官供体取回约7-9 cm的人髂静脉，储存在含有抗生素的无菌PBS中，并运送至实验室。立即用蒸馏水洗涤静脉以除去全血。静脉的两端均连接至具盖连接器，将其它磨损、分支缝合以防止渗漏。脱细胞化周期包括在搅拌器中用1% triton-x 100 (xlOO,Sigma, Sweden)、1% 憐酸三正丁酯(TNBP) (28726.291, VWR, Sweden)和 4mg/L 脱氧核糖核酸酶I (DNA酶I) (D7291, Sigma, Sweden)以160 RPM的速度37°C搅拌静脉，每种溶液4 h。Triton和TNBP溶液在包含抗生素(青霉素200 U/ml,链霉素0.2 mg/ml和两性霉素 2 ug/ml) (Sweden)、5 mM 乙二胺四乙酸(EDTA) 二钠盐脱水物(ED2SS, Sigma, Sweden)和0.4 mM苯甲基硫酰氟(PMSF) (93482，Sigma, Sweden)的蒸馏水中制备。DNA酶I溶液在具有氯化钙和氯化镁(A12858, Life technologies)的Dulbecos PBS中制备。脱细胞化持续9个周期，每个周期之间通过灌注蒸馏水洗涤。脱细胞化后，组织用0.1%过乙酸/无菌PBS灭菌1 h，接着用无菌蒸馏水和PBS洗涤，每种溶液24 h。
[0105]脱细胞化静脉的表征
9个周期后，从脱细胞化静脉取活组织并处理用于免疫组织化学、免疫荧光、DNA定量、luminex、扫描和透射电镜分析、拉伸强度和细胞外基质定量。
[0106]组织学、免疫组织化学和免疫荧光
正常、脱细胞化和再细胞化静脉活组织依照相同方案处理。将活组织在4%缓冲福尔马林中固定48 h以制备石蜡块和组织tech 0CT用于冷冻块，并在液氮中冷冻。切割5 um厚的石蜡和冷冻切片用于染色。石蜡切片在递减系列的乙醇中再水化后用苏木精-伊红(HE)、马森三色(MT)、vernhoeff von gieson (VVG)染色和免疫组织化学染色。在HE染色中载玻片分别在Meyers苏木精和乙醇伊红中孵育7和1 min，二者之间用蒸馏水洗涤10 min，然后脱水和包埋。MT (25088-1, Polysciences, Germany)和VVG (25089-1，Polysciences,Germany)染色按照制造商的说明书进行。
[0107]进行免疫组织化学以查看ECM蛋白和平滑肌肌动蛋白。所依照的方案为按照制造商的说明书，第一抗体浓度为胶原I (1:100)、胶原IV (1:500)、纤连蛋白(1:500)、层粘连蛋白(1:100)和平滑肌肌动蛋白(1:50)。
[0108]DNA 定量
从5条不同的静脉收集约20 mg 5个正常和5个脱细胞化活组织，依照DNcasy血和组织试剂盒方案(69506，Qiagen, Sweden)分离DNA。用nanodrop测量存在的DNA量。
[0109]Luminex
在三个正常和相比的三个脱细胞化静脉组织中定量测定一组17个血管形成生长因子。取约30 mg的组织样品并分离总蛋白(2140，Millipore, Germany)。蛋白质的量通过Bradford 方法用一组 BSA标准品并使用 ELISA 读数器(Synergy2, B1tek, USA)在 595 nm处测量来测量。所有组织的蛋白质量用TM缓冲液(millipore)标准化至相同的浓度，并装载到luminex板。Luminex按照人血管形成/生长因子磁珠板(magnetic bead panel) 1供应商的方案(Millipore, Sweden)进行。简单而言，用200 μ 1测定缓冲液活化luminex板。向各个孔中加入25 μ 1标准化蛋白、标准品和对照，其中测定缓冲液用作空白。孔中的样品用25 μ 1测定缓冲液稀释，而标准品和对照用25 μ 1 ΤΜ缓冲液稀释。将抗体包覆的磁珠涡旋，向所有孔加入25 μ 1珠子并在温和的板振荡器上4°C孵育20 h。板在磁体上静置1 min，用洗涤缓冲液洗涤。加入检测抗体25 μ 1并孵育lh，接着加入25 μ 1链霉抗生素蛋白-藻红蛋白并孵育30 min。稍后用洗涤缓冲液依照洗涤说明书洗涤板，向所有孔中加入100 μ 1鞘液，通过摇动5 min而悬浮磁珠并在luminex上读数。
[0110]胶原和GAG定量
胶原和GAG定量使用B1color公司的Sircol胶原测定试剂盒和Bislycan GAG测定试剂盒进行。简单而言，用溶解在醋酸中的胃蛋白酶从约20 mg组织提取胶原24 h，用浓缩试剂浓缩并纯化。提取的胶原用1 ml sircol染料试剂饱和，接着用酸式盐洗涤试剂洗涤。在碱性试剂中释放胶原-染料颗粒物(pellet)并在555 nm读数(Synergy2, B1tek, USA)。GAG在木瓜蛋白酶提取试剂中从20 mg组织65°C提取3 h。提取的GAG用1 ml bislycan染料试剂在振荡器上饱和30 min，然后离心沉淀GAG-染料复合物。结合的染料在0.5 ml染料解离试剂中释放并在656 nm读数(Synergy2, B1tek, USA)。胶原和GAG基于试剂盒中提供的已知浓度的胶原和GAC的标准图定量。
[0111]拉伸强度测量
静脉段用Instron 5566 (Instron, Norwood USA)拉伸检验。预负载为0.1 N,使用的检验速度为50 mm/分钟。拉伸检验器的准确度为力0.5%和伸长率0.5%。将静脉切成约4mm宽的环形样品。切片的最小宽度用卡尺测量并记录。将两个圆柱形5 mm柄(grip)(每个2.5 mm高和5 mm宽)放置在环形样品内，然后进行径向变形。力通过将测量的力除以环的最小宽度而标准化，这是因为此为经历负载的部分(由于考虑到血管壁太不均匀，未计算应力)。还测量了预负载后样品的伸长。计算了用于使样品完全断裂的总力和50%总力时的伸长。
[0112]生物反应器
根据静脉尺寸在实验室内部制备了生物反应器。该生物反应器由包封的连接至聚乙烯和硅导管的聚丙烯导管结构组成。生物反应器和导管使用前在高压灭菌器中灭菌。使用蠕动泵以2 ml/min的速度灌注血液和培养基。
[0113]生物反应器设计为使得静脉可适应完全密闭的室并且所有需要的培养基可通过导管用蠕动泵提供(图6)。该生物反应器包括1根约15 cm的导管、2个盖子(每个具有1个入口和1个出口)、1个可连接至入口的由橡胶制成的圆锥形结构和防止从两个盖子渗漏的2个vicers。2个盖子以这样的样式设计，从而入口将穿过盖子进出，使得导管可容易地从外部连接并且圆锥形橡胶可固定在绑静脉的内侧。出口将刚好延伸到外部并从表面收集培养基。底盖出口用于收集培养基导管，并且可容易地从外部连接，其中顶盖出口直径稍大，导管可从其中穿过但保持气密。其用于从内部牵拉血管并使其保持直而展开。静脉的一端首先连接至圆锥形橡胶并固定在入口，第二端连接至包含穿过顶盖出口的导管的连接器。灌注培养基通过入口从底部进入血管，穿过血管，通过导管经由上盖流出并通过上盖入口再次进入生物反应器，因此静脉外部亦填充相同的培养基。当外部静脉填充生物反应器时将其倒置，充满后使其恢复正常，用连接器连接至入口导管。所有的生物反应器部件和导管在使用前用高压灭菌器灭菌。
[0114]血液收集
再细胞化的当日，从每个健康供体(年龄组25-35)收集30 ml血液到无菌肝素包覆的真空采血管中，尽快运送到实验室中。所需的血液体积取决于血管长度和导管长度。9 cm长和直径1 cm的静脉可用30 ml血液再细胞化。从动脉和静脉二者收集的血液均可用于再细胞化。
[0115]静脉的再细胞化
完整的再细胞化过程在非常无菌的条件下进行，所有灌注在提供5% C02的37°C培养箱中实施。再细胞化前，静脉用浓度50 IU/ml PBS的肝素(Leo)灌注2 h。排出肝素，立即以2 ml/min的速度灌注全血48 h。然后排出血液,用包含1%青霉素_链霉素_两性霉素的PBS洗涤静脉3-5 min或直至完全除去血液。随后用内皮和平滑肌培养基交替灌注静脉12天(每种培养基3天)。完全内皮培养基使用添加10%热灭活人AB血清(34005100，Life technologies, Sweden)的 MCDB131 (10372, Life technologies, Sweden)基础培养基、1%谷氨酰胺(25030，Lonza, Denmark)、1%青霉素-链霉素-两性霉素和包含抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、重组人VEGF、人成纤维细胞生长因子、人上皮生长因子、肝素和硫酸庆大霉素的EGM2 single quote试剂盒(CC-4176, Lonza, Denmark)制备。完全平滑肌培养基使用500ml添加10%热灭活人AB血清的培养基231 (M231,Life technologies, Sweden)、1%青霉素-链霉素-两性霉素以及20ml平滑肌生长补充剂(SMGS) (S-007-25, Life Technologies, Sweden)和 5ml 平滑肌分化补充剂(SMDS)(S-008-5, Life technologies)制备。对于第一个周期，使用仅包含SMGS的平滑肌培养基，而第二个周期中使用SMGS和SMDS 二者。
[0116]再细胞化静脉的表征
再细胞化14天后，如前所述从静脉取活组织制备冷冻块和石蜡块。为了使内皮细胞的存在情况可见，选择CD31 (1:1000)和VWF (1:100)标志物并通过免疫荧光染色，而平滑肌肌动蛋白(1:50)通过免疫组织化学染色以使平滑肌细胞可见。还如前所述拉伸检验再细胞化静脉的机械强度。
[0117]结果
静脉的脱细胞化
通过用1% Triton和1% TNBP搅拌和灌注的组合而脱细胞化成功在9个周期内使髂静脉脱细胞化。DV的总体形态学看起来为白色和半透明的，但未发现大小变化和渗漏(图7)。组织学分析通过HE、MT和VVG染色进行。9个周期后在所有DV中未观察到核染色(HE-蓝色和MT-黑色染色)(图8、9&10)。
[0118]脱细胞化静脉中存在细胞外基质
MT染色显示脱细胞化后存在大量胶原(蓝色，图3)。VVE染色给予弹性蛋白和核黑色，给予胶原红色(图10)。从VVE染色，甚至在脱细胞化后观察到弹性蛋白环存在。主要ECM蛋白层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原IV和胶原I在DV中的免疫组织化学染色也显示重要的ECM蛋白保持(图11&12)。分别用sircol和bislycan测定对胶原和GAG的定量也显示脱细胞化后胶原和GAG无显著损失(图13)。脱细胞化方案还导致DNA量从正常静脉中193土一ng/mg组织减少至脱细胞化静脉中15±8ng/mg (图13)。在通过luminex、生长因子瘦素和EGF检验的17个血管形成生长因子中，13种生长因子仍存在于DV中(图14)。虽然DV中保留的生长因子较少，但减少倍数为7-9倍。在脱细胞化静脉中未检测到的生长因子在正常静脉中以较少的量存在。所有这些结果显示该脱细胞化ECM可为用于再细胞化的合适骨架。
[0119]静脉的再细胞化
利用生物反应器系统，用血液将长度在7-9 cm之间的5条静脉再细胞化2天，交替内皮和平滑肌培养基12天，每种培养基3天。再细胞化后静脉的总体形态学看起来为粉红色，具有良好的外膜。静脉在生物反应器中令人信服地起作用。HE组织学染色显示静脉内层、中层和外层存在许多核。MT染色也证实了存在黑色染色的核和红色染色的细胞质以及细胞附着于蓝色胶原(图15、16 & 17)。
[0120]再细胞化静脉的表征
用内皮细胞标志物VWF的免疫荧光染色显示连续的绿色和用CD31抗体斑点状的绿色，证实了存在朝向静脉内衬的内皮细胞(图18)。用平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学染色也证实纺锤形平滑肌细胞的存在遍及静脉的中层和外层(图19)。平滑肌细胞分布在整个静脉中，并且平滑肌细胞的细环刚好存在于内皮衬里下方。当用脱氧胆酸钠进行脱细胞化时未获得相似结果(图20,21 & 22)。
[0121]拉伸试验
脱细胞化静脉的拉伸强度与正常相比显示断裂所需的力和断裂前伸长的长度减小，表明与正常相比脱细胞化静脉可经受住较小量的压力。但再细胞化后这些性质均恢复并且与正常接近(图23)。
[0122]讨论
这些实验例示了使用全血的静脉体外三维培养。认为该移植物制备技术和程序在血管疾病患者中临床使用安全。内部制备的生物反应器系统帮助了组织生长，并且由于灌注的轻微压力，反应器内的静脉可保持膨胀使得整个表面区域暴露在养分中。用TNBP和triton使髂静脉脱细胞化还产生ECM组分和强度保持的骨架。然而，使静脉脱细胞化所需的周期数目在供体与供体间、组织内的位置与位置间不同。在这些实验中使用了髂总静脉、髂外静脉和髂内静脉。髂总静脉需要9个周期，髂外静脉和髂内静脉在7个周期后脱细胞化。灌注6-7个周期后需要连续监测，一旦核不存在可停止脱细胞化程序。
[0123]用肝素灌注整个生物反应器系统，然后再细胞化，防止了静脉、循环导管中形成血块，最重要的是，其还活化具有多效性功能并刺激内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等生长的FGF。如通过luminex所分析的FGF甚至在脱细胞化后大量存在。由于未知的原因，与正常相比，VEGF在脱细胞化组织中存在更多，但这非常有利。VEGF是潜在的血管内皮细胞促分裂原。认为残留的组织生长因子在脱细胞化后仍然存在，并且ECM蛋白纤连蛋白、胶原、弹性蛋白和层粘连蛋白发挥重要作用，促进这些细胞在组织中附着和生长。发现用内皮和平滑肌细胞培养基交替灌注两次(每种培养基3天)足以使内皮层重新增殖，内皮层的特征在于连续VWF和⑶31层的存在。此外，组织中平滑肌肌动蛋白的存在提示静脉具有相同的顺应性并帮助收缩和扩张运动以推动血液流向心脏。该程序可用于任何年龄的受体。
【权利要求】
1.使血管再细胞化的方法，包括向脱细胞化血管中引入细胞群和在脱细胞化血管上培养所述细胞群，从而使血管再细胞化。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞群来自全血、骨髓或干细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞群包含内皮细胞和平滑肌细胞。
4.权利要求2的方法，其中所述干细胞为表达⑶133+的细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞群在体外扩大和分化为内皮细胞和平滑肌细胞，然后将内皮细胞和平滑肌细胞弓I入脱细胞化血管。
6.权利要求1的方法，其中所述向脱细胞化血管中引入细胞群为通过注射或灌注。
7.权利要求1的方法，其中所述培养包括灌注内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基。
8.权利要求7的方法，其中所述内皮细胞培养基和所述平滑肌细胞培养基的所述灌注交替给予。
9.权利要求8的方法，其中所述交替给予重复至少两次。
10.权利要求1的方法，其中所述在脱细胞化血管上培养细胞群导致细胞群分化为内皮细胞和平滑肌细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述内皮细胞排列在脱细胞化血管外部，所述平滑肌细胞排列在脱细胞化血管腔。
12.权利要求3或11的方法，其中所述内皮细胞表达VE-钙粘着蛋白、AcLDL、vWF或CD31。
13.权利要求3或11的方法，其中所述平滑肌细胞表达平滑肌肌动蛋白或波形蛋白。
14.权利要求1的方法，其中所述培养细胞群为体外培养。
15.权利要求1的方法，其中所述血管为静脉或动脉。
16.通过前述权利要求中任一项生产的血管。
17.权利要求16的血管用于移植的用途。
18.用于为患者提供血管移植物的方法，包括 a.将受试者-来源的细胞群递送至脱细胞化血管；和 b.在脱细胞化血管上培养所述受试者-来源的细胞群。
19.权利要求18的方法，其中所述脱细胞化血管来自同种异体的供体。
20.权利要求18的方法，其中所述受试者-来源的细胞群来自全血、骨髓或干细胞。
21.权利要求18的方法，其中所述受试者-来源的细胞群包含内皮细胞和平滑肌细胞。
22.权利要求20的方法，其中所述干细胞为表达⑶133+的细胞。
23.权利要求18的方法，其中所述受试者-来源的细胞群在体外扩大和分化为内皮细胞和平滑肌细胞，然后将内皮细胞和平滑肌细胞弓I入脱细胞化血管。
24.权利要求18的方法，其中所述向脱细胞化血管中引入受试者-来源的细胞群为通过注射或灌注。
25.权利要求18的方法，其中所述培养包括灌注内皮细胞培养基和平滑肌细胞培养基。
26.权利要求25的方法，其中所述内皮细胞培养基和所述平滑肌细胞培养基的所述灌注交替给予。
27.权利要求26的方法，其中所述交替给予重复至少两次。
28.权利要求18的方法，其中所述在脱细胞化血管上培养受试者-来源的细胞群导致受试者-来源的细胞群分化为内皮细胞和平滑肌细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述内皮细胞排列在脱细胞化血管外部，所述平滑肌细胞排列在脱细胞化血管腔。
30.权利要求21或29的方法，其中所述内皮细胞表达VE-钙粘着蛋白、AcLDL、vWF或CD31。
31.权利要求21或29的方法，其中所述平滑肌细胞表达平滑肌肌动蛋白或波形蛋白。
32.权利要求18的方法，其中所述培养细胞群为体外培养。
33.权利要求18的方法，其中所述血管为静脉或动脉。
【文档编号】A61F2/06GK104411816SQ201380025651
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年3月1日 优先权日:2012年3月16日
【发明者】S.苏米特兰-霍尔格松, M.奧劳松 申请人:诺瓦赫普有限公司