共同阻断pd-1和tim-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途

共同阻断pd-1和tim-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途
【专利摘要】本发明涉及共同阻断PD-1和TIM-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途，具体涉及PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂及其与现有抗胃癌治疗药物在制备抗胃癌的药物组合物中的用途，该阻断剂或其与现有胃癌治疗药物的组合通过增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用起到抗胃癌治疗作用。本发明的组合物对胃癌有显著的治疗效果，且具有毒副作用小、能与现有胃癌治疗药物协同的优点。
【专利说明】共同阻断PD-1和TIM-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及一种治疗胃癌的新方法，即共同阻断ro-Ι和--Μ-3信号通路；同时证明了该方法与现有抗胃癌治疗药物合用具有协同效果。据此，本发明提供了 ro-Ι信号通路阻断剂和TIM-3信号通路阻断剂或其与现有抗胃癌治疗药物的联用在胃癌治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]在多种小鼠肿瘤模型中有大约半数的肿瘤浸润的淋巴细胞(Tumor InfiltrationLymphocytes, TILs)共表达--Μ-3与Η)_1，并且表现出功能的耗竭，丧失增殖和分泌IL-2、TNF-α和IFN-Y这些细胞因子的能力。共同阻断Η)_1和--Μ-3信号通路，被发现与单独阻断I3D-1或--Μ-3信号通路相比，能更有效地抑制肿瘤生长。在人类癌症中，--Μ-3在Η)_I-的NY-ES0-1特异性的CD8+T细胞上高表达，TIM-3+/PD-l+双阳性的NY-ES0-1特异性CD8+T细胞比HM-37PD-1+和HM-37PD-1_的NY-ES0-1特异性CD8+T细胞功能更加紊乱，分泌更少的IL-2、TNF和IFN- Y，阻断--Μ-3信号通路能够增强NY-ES0-1特异性⑶8+T细胞增值和分泌细胞因子的能力，共同阻断ro-1信号通路则具有显著的协同作用。
[0003]先前的一些研究只是对结肠腺肉瘤(MC38和CT26)和纤维肉瘤(WTMCA2)这3种小鼠肿瘤模型进行了研究；在人类肿瘤中的研究，也是针对在黑色素瘤患者中NY-ES0-1特异性的CD8+T细胞的研究。缺乏对人类其他癌症尤其是全球发病率第四，死亡率第二的癌症——胃癌的研究，中国胃癌发病率占全世界的42%，平均每3分钟就有一个中国人死于胃癌。面对中国严峻的胃癌形势，我们希望能够通过共同阻断免疫抑制信号通路的免疫治疗途径来治疗胃癌。
[0004]在癌症病人体内。免疫系统是一个整体的存在。通过对整体⑶3+、⑶4+和⑶8+T细胞的研究得出的结果将更全面真实的体现病人在接受ro-Ι和TIM-3信号通路阻断后能否获得有效的疗效。在黑色素瘤病人中的研究，只是研究了 ro-Ι和--Μ-3在NY-ES0-1特异性的⑶8+T细胞上的表达水平，以及阻断ro-Ι和--Μ-3信号通路后对NY-ES0-1特异性的⑶8+T细胞活性的影响。先前的研究缺乏整体性的研究ro-Ι和TIM-3在癌症病人外周PBMC和TIL中⑶3+、⑶4+和⑶8+T细胞中表达水平的研究，以及缺乏在共同阻断I3D-1和TIM-3信号通路后对⑶4+和⑶8+T细胞活性的影响的评价。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种共同阻断Η)-1和--Μ-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途。
[0006]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下。
[0007]PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂在制备抗胃癌的药物组合物中的用途。
[0008]进一步地,所述药物组合物包括:[0009]DPD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；
[0010]2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；
[0011]和3)任选的,其它抗胃癌药物。
[0012]进一步地，所述药物组合物与其它抗胃癌药物联合使用。
[0013]进一步地，所述药物组合物包括其它抗胃癌药物。
[0014]进一步地，所述ro-1信号通路的阻断剂为抗ro-1单克隆抗体，所述--μ-3信号通路的阻断剂为抗ΤΙΜ-3单克隆抗体。
[0015]进一步地，所述其它抗胃癌药物为烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素中的一种或多种。
[0016]进一步地，所述其它抗胃癌药物为顺钼、表柔比星、氟尿嘧啶中的一种或多种。
[0017]本发明进一步提供了一种药物组合物，包括:i)ro-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；和3)任选的，其它抗胃癌药物。
[0018]本发明更进一步提供了一种药盒，包括:i)含有ro-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂的容 器；ii)含有其它抗胃癌药物的容器；和任选的iii)使用说明书。
[0019]本发明还提供了一种治疗胃癌的方法，所述方法包括将本发明的药物组合物或药盒给予需要该治疗的对象，或将ro-Ι和TIM-3信号通路的阻断剂与其它抗胃癌药物联合给予需要该治疗的对象。
[0020]本发明的有益效果是:共同阻断ro-1和TIM-3信号通路能够有效增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用，从而为胃癌的临床免疫治疗提供了有力依据，并为为临床用药和胃癌防治提供了新的有效途径。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1为本发明的实施例1的操作流程图。
[0022]图2A、图2B、图2C、图2D为本发明的实施例1的胃癌病人外周血单核细胞(PBMC)，癌旁胃粘膜(AGM)和肿瘤浸润的淋巴细胞(TILs)的代表性示意图和整合示意图。
[0023]其中，整合的数据展示CTLA-4 (C)和TIGIT (D)在⑶3+，⑶4+和⑶8+T细胞群中的表达水平。
[0024]图3为本发明的实施例1的正常人外周血单核细胞(NDMC)，胃癌病人外周血单核细胞(PBMC)，癌旁胃粘膜(AGM)和肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)的代表性示意图。
[0025]其中，数据展示ro-Ι和--Μ-3在⑶3+，⑶4+和⑶8+T细胞群中的表达水平。
[0026]图4显示了实施例1中，分别来自15个胃癌病人的肿瘤浸润的淋巴细胞，癌旁胃粘膜和外周血单核细胞(TIL，AGM和PBMC)，以及9个正常人外周血单核细胞(NDMC)PD-i、, --Μ-3+，PD-l+/TIM-3+, PD-l+/TM-3' Ρ?-i'/ΤΙΜ-3+ 和 PD-17TIM-3-所占 CD3+T 细胞的百分率。
[0027]图5显示了实施例1中，分别来自15个胃癌病人的肿瘤浸润的淋巴细胞，癌旁胃粘膜和外周血单核细胞(TIL，AGM和PBMC)，以及9个正常人外周血单核细胞(NDMC)的PD-i+, --Μ-3+，PD-l+/TIM-3+, PD-l+/TM-3' Ρ?-i、/ΤΙΜ-3+ 和 PD-17TIM-3-所占 CD4+T 细胞的百分率。[0028]图6显示了实施例1中，分别来自15个胃癌病人的肿瘤浸润的淋巴细胞，癌旁胃粘膜和外周血单核细胞(TIL，AGM和PBMC)，以及9个正常人外周血单核细胞(NDMC) Η)_I'，--Μ-3+，PD-l+TIM-3+, PD-l+TIM-3_, Ρ?-ΤΙΜ-3+ 和 PD_rilM-3-所占 CD8+T 细胞的百分率。[0029]图7显示了实施例1中，在15个胃癌患者的TIL，AGM和PBMC中，CD3+ (A和B)，CD4+ (C和D)和CD8+ (E和F)T细胞中表达I3D-1和--Μ-3的平均荧光强度(MFI)。p值是用Wilcoxon符号秩和检验计算得到的。
[0030]图8A、图8B、图8C、图8D显示了实施例1中，在用抗Tim-3 ( α --Μ-3)和/或抗PD-1 ( a PD-1)单抗或同型对照(IgG)阻断后，CD4+ (Α和C)和CD8+ (B和D) TIL中细胞因子的表达。
[0031]图9显示了实施例1中，用抗Tim-3 ( α --Μ-3)和/或抗PD-1 (aPD_l)单抗阻断增强TIL对AGS的细胞毒性。AGS-GFP与TIL以1:6的形式共培养4h，AGS死亡率用7-AAD染色的细胞流式方法检测。
【具体实施方式】
[0032]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0033]本发明的发明人经过研究和试验，发现共同阻断ro-Ι和--Μ-3信号通路能够有效增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用，PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂同时使用可明显抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡，从而达到治疗胃癌的效果，并发现该类药物与现有抗胃癌治疗药物合用具有显著的协同治疗胃癌的效果。
[0034]PD-1信号通路的阳断剂和--Μ-3信号通路的阳断剂
[0035]本文中，术语“ro-1信号通路”是指表达于激活τ细胞表面的ro-1受体与其配体PDLl (B7-H1, CD274)或PDL2(B7-DC，CD273)接触后，通过磷酸化SHP2等信号通路抑制T细胞激活；术语“--Μ-3信号通路”是指--Μ-3会在IFN- Y分泌的T细胞表面表达上调，与其配体galectin-9结合后，使Bat_3从--Μ-3受体上解离，从而抑制T细胞IFN- Y的分泌和增殖，甚至导致T细胞死亡。
[0036]本文中，术语“PD-1信号通路的阻断剂”是指可用于阻断ro-1信号通路的活性物质，术语“TIM-3信号通路的阻断剂”是指可用于阻断--Μ-3信号通路的活性物质。术语“阻断剂”是指部分或全部阻止或抑制某一作用的物质。
[0037]本发明的阻断剂可为本领域中已知的活性物质，包括:ro-l单克隆抗体、--Μ-3单克隆抗体、CTLA-4单克隆抗体、LAG3单克隆抗体，但不限于上述活性物质。
[0038]在本发明的一个优选实施方式中，所述阻断剂优选为抗体，更优选为单克隆抗体。所述抗体可通过本领域中已知的方法获得。
[0039]本发明的阻断剂能明显发挥的抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡的作用，与现有抗胃癌治疗的药物合用具有显著的协同效果。
[0040]其它抗胃癌药物
[0041]本发明的阻断剂不仅本身能明显发挥的抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡的作用，其还可与现有抗胃癌药物合用产生显著的协同效果。[0042]所述其它抗胃癌药物包括:烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素。优选为顺钼、表柔比星、氟尿嘧啶。
[0043]药物组合物和药盒
[0044]本发明提供的药物组合物包括:Η)-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂、药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂、其它抗胃癌药物。
[0045]该药物组合物可有效用于胃癌的治疗。如组合物中存在其它抗胃癌药物，则其与PD-1信号通路的阻断剂、TIM-3信号通路的阻断剂三者的摩尔比为(8 - 40):1:1。
[0046]本文中，术语“药学上或免疫学上可接受的载体”是指用于保健品或药物制剂的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。适用的载体是本领域的技术人员所熟知的，本发明优选稀释剂，具体可选生理盐水(0.9%氯化钠溶液)。
[0047]本发明的组合物为液态的溶液剂。
[0048]本发明还提供了一种用于胃癌治疗的药盒，包括:容纳有ro-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂的容器、容纳有其它抗胃癌药物的容器、任选的使用说明书。
[0049]在本发明的实施方式中，在给予ro-Ι信号通路的阻断剂、TIM-3信号通路的阻断剂之前、之后或同时给予其它抗胃癌药物，以产生协同治疗效果。
[0050]施用方式
[0051]本发明的药物是通过以下哪种给药方式:胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、瘤内、局部给药，或者其他的给药方式，优选静脉注射或静脉滴注。本发明组合物的施用量，按活性物质重量计，通常为每天约0.001-5mg阻断剂/kg体重,较佳地约0.01-1/kg体重,优选0.01-0.5mg/kg 体重。
[0052]本发明的优点
[0053]本发明具有如下的优点:共同阻断ro-Ι和--Μ-3信号通路能够有效增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用，从而为胃癌的临床免疫治疗提供了有力依据，并为为临床用药和胃癌防治提供了新的有效途径。
[0054]实施例:共同阻断PD-1和TIM-3信号通路对体外培养胃癌癌细胞的杀伤作用
[0055](一)材料
[0056]1.标本及细胞系
[0057]1)胃癌组织、癌旁组织和胃癌病人外周血(由苏州大学附属第一人民医院提供)；
[0058]2)正常人外周血(由苏州大学附属第二人民医院提供)；
[0059]3)胃癌细胞系(AGS来自苏州大学唐中英血液学研究中心)。
[0060]2.主要试剂与材料
[0061]1) RPMI1640，DMEM 高糖培养基(HyClone 公司)；
[0062]2)胎牛血清(FBS)、0.25% 胰酶(HyClone 公司)；
[0063]3)细胞培养用青霉素-链霉素(HyClone公司)；
[0064]4) Ficoll-paque plus 淋巴细胞分离液(GE healthcare 公司)；
[0065]5) 7-AAD 染料(BD 公司)；
[0066]6) LIVE/DEAD固定死细胞染料试剂盒(invitrogen公司)；
[0067]7)固定及破膜溶液和破膜/清洗缓冲液(BD公司)；
[0068]8)高尔基体阻断试剂(BD公司)；[0069]9) Trizol 裂解液(invitrogen 公司)；
[0070]10)病毒包装质粒ΔR, REV和包膜质粒VSV-G ；
[0071]11) PersonGen人类T淋巴细胞活化与扩增试剂盒(博生吉公司)。
[0072]3.主要仪器与设备
[0073]1) FACS Aria III和 FACS Caliber 流式细胞仪(BD 公司)；
[0074]2)超净工作台(Thermo公司)；
[0075]3) CO2细胞培养箱(Thermo公司)；
[0076]4)低速冷冻离心机(Thermo公司)；
[0077]5)高速离心机(Beckman Coulter 公司)；
[0078]4.主要抗体
[0079]1)鼠抗人 CD3-FITC，鼠抗人 CD4-FITC，鼠抗人 CD8-FITC，鼠抗人 CD4-APC，鼠抗A PD-1-APC,鼠抗人 PD-1-FITC，鼠抗人 --Μ-3-ΡΕ，鼠抗人 TIGIT-PerCP Cy5.5，鼠抗人CTLA-4-PerCP Cy5.5，鼠抗人CD8-PE Cy7，鼠抗人 IL-2-PE，鼠抗人 IFN-Y-PerCP Cy5.5，鼠抗人 TNF- a -APC,鼠抗人 CD3_PerCP Cy5.5，鼠抗人 CD8_PerCP Cy5.5 (BD 公司)；
[0080]2)鼠抗人ro-1单克隆抗体、鼠抗人⑶3单克隆抗体(博生吉公司)；
[0081]3)鼠抗人 --Μ-3 单克隆抗体 clone2E2 (Millipore 公司)；
[0082]4)正常小鼠IgG抗体(invitrogen公司)。
[0083](二)方法
[0084]按照常规细胞培养方法，在37°C、5%C02的环境培养人细胞。包括胃癌细胞系:AGS、AGS-GFP ;从胃癌病人的胃癌组织中提取的肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL);从胃癌病人或正常人外周血中提取的T淋巴细胞。AGS、AGS-GFP、TIL、T细胞用含10%FBS DMEM培养基培养。
[0085]图1为本发明的实施例1的操作流程图，如图1所示，本实施例具体包括如下步骤:
[0086]1.建立GFP-1uc阳性AGS细胞系
[0087]1.1GFP-1uc 慢病毒制备
[0088]1.1.1质粒转化
[0089]I)取100 μ L感受态细胞置于冰浴中；
[0090]2)向感受态细胞悬液中加入Ing目的质粒(GFP-luc、ΔR、REV或VSV-G)，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min ；
[0091]3)将离心管置于42°C水浴中放置60s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min ；
[0092]4)向离心管中加入900 μ I无菌SOC培养基(不含抗生素)，混匀后置于37°C摇床振荡培养 45min (150rpm/min)；
[0093]5)将离心管内容物混匀，吸取100 μ I已转化的感受态细胞涂布于含有氨苄抗生素(Ampici 11 in，Amp)的LB固体培养基上，倒置平板，37°C培养12h。
[0094]1.1.2质粒提取
[0095]1)挑选上述LB平板上的单克隆置于3ml LB培养基(Amp)中，37°C摇床振荡培养12h (250rpm/min)；
[0096]2)12h后，吸取Iml菌液至200ml LB培养基(Amp)中，37°C摇床振荡培养18h_20h(250rpm/min)；
[0097]3)按照Axygen质粒大量提取试剂盒说明书提取质粒，用紫外分光光度计检测质粒浓度和纯度，置于_20°C保存。
[0098]1.1.3慢病毒包装
[0099]1)细胞培养:取6X106个293T细胞接种于IOOmm细胞培养皿中，过夜，待细胞汇合度达到90%时，更换6ml新鲜DMEM培养基；
[0100]2) 3h后进行包装病毒，向EP管中加入450 μ I无菌水，加入下述质粒，混匀；
[0101]
【权利要求】
1.PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂在制备抗胃癌的药物组合物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括:DPD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；和3)任选的，其它抗胃癌药物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物与其它抗胃癌药物联合使用。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括其它抗胃癌药物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述ro-1信号通路的阻断剂为抗ro-Ι单克隆抗体，所述TIM-3信号通路的阻断剂为抗TIM-3单克隆抗体。
6.根据权利要求2-4任一项所述的用途，其特征在于，所述其它抗胃癌药物为烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素中的一种或多种。
7.根据权利要求2-4任一项所述的用途，其特征在于，所述其它抗胃癌药物为顺钼、表柔比星、氟尿嘧啶中的一种或多种。
8.一种药物组合物，包括: DPD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；和3)任选的，其它抗胃癌药物。
9.一种药盒，包括:i)含有ro-Ι信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂的容器；ii)含有其它抗胃癌药物的容器；和任选的iii)使用说明书。
【文档编号】A61K45/00GK103721255SQ201410006645
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】杨林, 宗云辉 申请人:苏州大学