一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗制备工艺的制作方法

专利名称：一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备工艺。
背景技术：
原发性胃癌为我国高发的恶性肿瘤。在胃癌治疗历史上，手术切除是主要手
段，但术后常复发。胃癌晚期(m期)患者，常缺乏有效的延长病人生命的治疗方法。若这些胃癌患者经一些有效的辅助治疗措施使胃癌肿瘤縮小后，再行切除，有可能使胃癌治疗有一个突破。
90年代新兴的肿瘤基因治疗巳成为肿瘤生物治疗的重要措施之一，并被誉为继手术、化疗和放疗之后的另一种具有潜在前途的治疗方法。近年来肿瘤基因
治疗的研究无论从深度上还是广度上都取得了很大进展。在获得美国重组DNA咨询委员会(RAC)、 NIH专家委员会和FDA批准的基因治疗临床试验方案中，以肿瘤为最多，充分显示基因治疗在肿瘤研究中的迫切性。目前所开展的肿瘤基因治疗中，以肿瘤免疫基因治疗的研究为最多。肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗是以主动免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转导入肿瘤细胞中，以制备出免疫原性更强的新型瘤苗，并由于细胞因子的持续分泌，从而激发机体产生抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。研究表明，细胞因子基因治疗不仅在一定程度上克服了以往临床直接应用细胞因子需反复多次且副作用明显的缺点，而且也取得了直接应用所不具有的疗效。
白细胞介素-2是由活化T细胞所分泌的一种细胞因子，具有剌激多种免疫效应细胞活化的作用，包括T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等。在肿瘤免疫中起到重要作用。十多年前已开始将重组白细胞介素-2应用于临床恶性肿瘤病人。这种白细胞介素-2的系统性应用在黑色素瘤及其它一些肿瘤病人中取得一定的效果，报道有效率为15~20%。这种疗法主要是基于白细胞介素-2可使T细胞活化，从而有助于杀伤肿瘤细胞。然而由于白细胞介素-2在血液中的半衰期较短，而反复多次大剂量的应用又产生严重的毒副作用，因而限制了白细胞介素-2的临床应用。
1990年，两个研究小组分别报道了应用基因工程技术，将白细胞介素-2基因转导至肿瘤细胞。动物实验结果表明，可分泌白细胞介素-2的肿瘤细胞丧失了致瘤性。进一步观察发现，体内接种白细胞介素-2基因转导的肿瘤细胞后可抵抗后
续野生型肿瘤的攻击。这些数据表明(l)基因修饰的肿瘤细胞自身可与T细胞
相互作用，(2)肿瘤细胞分泌的白细胞介素-2可替代辅助T细胞的作用，来激活肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞[11]。类似的研究结果在多种肿瘤模型中相继得到证实，包括肠癌(CT26)、纤维肉瘤(CMS5)、肥大细胞瘤(P815)、黑色素瘤(M-3)1等。
我们在动物肿瘤模型研究中也发现，白细胞介素-2基因修饰的小鼠肿瘤细胞Hn及MM45T丄i均显著降低其致瘤性，并能有效保护后续野生型肿瘤的攻击。
与此同时，在全世界范围内，应用白细胞介素-2基因工程瘤苗的临床试验不断获得批准，在细胞因子基因修饰肿瘤细胞的临床试验方案中，以白细胞介素-2基因应用最多。目前已有23个相关治疗方案获得批准，涉及到的肿瘤类型包括黑色素瘤、肾癌、肠癌、前列腺癌、头颈部肿瘤及肺癌等。
在所应用的基因转移系统中，逆转录病毒载体系统应用最早，对其研究也很深入。该系统最大的优点是可以前病毒形式稳定整合至宿主基因组中，从而使目的基因的长期稳定表达成为可能。尽管这种整合形式有可能导致宿主基因组的插入突变(insertion mutation),但采用安全的ex vivo治疗方案，可使插入突变对机体带来的潜在危险降至最低。此外，作为第二代复制缺陷型逆转录病毒载体系统，LXSN系统更为安全，产生有复制能力的野生型病毒的可能性很小。该载体系统也是被美国FDA获得批准可应用于临床试验的载体之一。自1990年应用逆转录病毒载体于临床基因治疗以来，尚无发现该病毒的毒副反应报道。
本发明提供了一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备工艺，为癌症的治疗提供了一种新的治疗途径。

发明内容
本发明提供了一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备工艺。包括
4mRNA的抽提及c副A的合成、PCR扩增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、含IL-2重组逆转录病毒载体的组建、白细胞介素-2重组逆转录病毒包装细胞制备、人胃癌细胞株MKN-45的感染，白细胞介素-2表达活性的基因工程人胃癌细胞的建立及瘤苗的灭活。


无。
具体实施例方式
第一步含信号肽的白细胞介素-2 cDNA的制备。
1. PHA剌激的人外周血细胞人外周血用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，共约"106细胞，经植物血凝素(PHA)10pg/ml剌激30小时，使细胞因子基因表达，以备抽提mRNA。
2. mRNA的抽提及cDNA的合成
(1) mRNA的抽提离心收集细胞，悬浮于1.5mlRNA抽提缓冲液，用注射器反复抽打匀浆细胞，然后再补加3ml抽提缓冲液，充分混合，离心1000cpm5分钟，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混合内容物，350g离心两分钟，弃去柱内液体，取4ml上清上柱，混匀，弃去液体。然后用高盐缓冲液洗三遍，低盐缓冲液洗二遍，最后用经65°C预热的洗脱缓冲液洗脱三次，每次用0.25ml，收集洗脱液，然后乙醇沉淀poly(A)十RNA(mRNA)。
(2) cDNA的合成将mRNA溶于20^1 ddH20中，65°C10分钟，置于冰上备用。在第一条链反应混合液内加入lmlDTT和热变性的RNA， 37'C保温1小时，再将此反应液加入第二条链反应混合液中，12°C和22°C各保温1小时，最后加lpl Klenow酶，37°C 30分钟，65°C10分钟后再用酚和氯仿抽提，经Sephacryl S-300柱纯化后-20°。保存。
2.PCR扩增IL-2基因取制备好的PBLcDNA10pl，加入5'和3'扩增引物各lnl( 30pmo1)、 10X反应缓冲液5^U、 dNTP4pl、加水至50^1，94°C 5分钟变性，力B Pfu酶1U(2.5U)，进行30个循环反应.(94。C 45"、55°C45"、 72"C1'20")。反应结束后，将反应产物用等体积苯酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀。
3. IL-2 cDNA的克隆为了鉴定PCR产物的准确性，须先将产物克隆入pUC 18或pBluescriptDNA ， 经DNA序列测定确认为IL-2 cDNA无误后再将这一片段回收，并与表达载体重组。故将PCR产物溶于TE，用适当的限制性内切酶水解后，与用同样酶水解过的载体DNA重组，转化TG1后涂于LB/AP平板，37。C培养过夜。
4. 质粒DNA小量抽提将一个单菌落接入含AP(50iag/ml)的3ml LB中，37。C培养过夜。将菌液转移至1.5ml离心管中，5000rpm离心2分钟，沉淀菌体。用100pl溶液I悬浮菌体，再加200pl溶液I1，温和颠倒混匀,置于冰上，待溶液澄清后，加入150^1溶液IIl，充分混匀。15000rpm 10分钟离心，收集上清，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加2.5倍乙醇混匀，沉淀。离心15000rpm 10分钟，将沉淀用70%乙醇洗一次，水泵抽干，最后溶于20plTE，用200ng/mlRNase处理1小时，-20"存放。
5. 质粒DNA的大量抽提
(1) 接种培养将一个单菌落接种于3mlLB(含AP)中培养至对数晚期(OD600"0.6)，取500^1接种入50ml含抗菌素的LB中，同样培养至对数晚期，再取15ml接种入含相应抗菌素的1.5LLB中，培养过夜。
(2) 质粒抽提将1.5L培养物离心5500rpmlO分钟，收集菌体。用吸水纸将离心管壁上残余液体擦干。将菌体悬浮于30ml溶液I中，置室温中IO分钟。加液体Il60ml，混合均匀后置冰上10分钟。加溶液IIl45ml，置冰浴10分钟后，15000rpm离心IO分钟。纱布过滤后取上清，加等体积异丙醇沉淀，15000rpm离心10分钟，用70%乙醇洗一次，真空干燥。将沉淀溶于20mlTE，加入等体积5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置IO分钟，4"15,000rpm离心10分钟，取上清，用等体积异丙醇沉淀。离心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase至200pg/ml， 37°C 30分钟。加等体积13%PEG(8000)/1.6M NaCl沉淀DNA，冰浴放30分钟。离心沉淀，干燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇各抽提一次。最后加1/10体积3MNaAc及2倍乙醇沉淀。-20°<:保存。用时再离心沉淀，溶于TE。
(3) CsCl超离心纯化DNA: 如上述碱法抽提的DNA，经LiCI纯化后，用于CsCl超速离心，按lg/ml的用量，加入固体CsCl， 30。C溶解。每10mlDNA加入0.8ml溴乙锭溶液(10mg/ml)， CsC溶液的最终密度是1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙锭浓度约为704pg /ml。室温8000rpm 5分钟，浮在溶液上的是溴化乙锭和蛋白质形成的复合物。将浮渣下的清亮溶液用注射器吸入用于超离心的离心管中，用轻石蜡油补满其余部分，'并封口。 45000转/分离心24 48小时(20。C)。离心完毕，在普通光照下可见两条DNA区带，下部区带由闭环质粒DNA组成，用针头插入此带，吸出至1.5ml管中，用等体积的经水饱和的正丁醇反复抽提,直至粉红色从水相和有机相中消失。将水相加3倍TE稀释，加2.5倍无水乙醇沉淀。离心后用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE， -20匸保存。
6. 限制性内切酶反应根据不同的限制性内切酶选择相匹配的缓冲液。 一般取0.5 lpg DNA，限制性内切酶 5U，反应体积20^1， 37°C保温1 2小时，用1.2%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0.5 lpg/ml)鉴定酶切结果。
7. 冻融法回收酶切片段在紫外灯下将DNA片段从琼脂糖凝胶中切下来，加入100ialTE，在干冰乙醇内冻结后置37°C15分钟，反复三次，15000rpm离心10分钟后吸出上清，加入1/10体积NaAc和2倍体积乙醇沉淀，离心收集，沉淀经水泵抽干后，溶于TE，即可进行连接反应。
8. DNA连接将等克分子数的待连接DNA混合，加入5XT4连接酶缓冲液4pl，加水至20pl，加入T4DNA连接酶2U， 12。C连接过夜，即可用于转化。
9. 重组DNA的转化
(l)感受态细胞制备将培养过夜的受体菌250nl接种于50|alLB中，37°C1.5 3小时至对数中期，菌液置冰浴IO分钟，5000rpm离心5分钟，沉淀菌体用1/2体积经预冷的100mM MgCl2悬浮，冰浴20分钟，4°C5000rpm离心5分钟，将菌体悬浮于1/15 1/10体积的100mM CaCl2中，冰浴中放60分钟，即可用于转化。(2)重组DNA的转化将连接过夜的DNA加入lOOpl感受态细胞，混匀，冰浴中放置40分钟，间或轻轻混匀，42"C2分钟，涂布于含抗菌素的LB平板上，37°C培养过夜。10.双链DNA测序
(1) 双链变性样品DNA约1.5-2(ag，溶于8^1 ddH20，加2M NaOH 2pl，置室温10分钟，加3^1 3M NaAc中和，再加7|ilddH20后，加60|al乙醇沉淀，离心15000rpm 10分钟，抽干后溶于10^1 ddH20。
(2) 退火反应10nl变性模板，加2pl引物，2pl退火缓冲液，65°C，5分钟，缓慢冷却至室温。
(3) 延伸反应将退火后的反应液加入lplddH20标记混合物3pl、T7聚合酶2pl(3U)、和0.5|iil同位素(ot-"P)标记的dATP，室温反应5分钟。
(4) 终止反应取上述反应液4.5^1至预先分装好的4管分别标记有G、 A、 T、 C的终止混合物中(各2.5pl)，混匀，37°C 5分钟，加5pl终止液。在电泳上样前样品置75 8(TC2分钟变性。
第二步含IL-2重组逆转录病毒载体的组建。
将pLXSN用EcoRI和BamHI酶切，与经同样酶切的IL-2相连接，重组载体经酶切鉴定后含有正确的插入片段，命名为L(IL-2)SN。
第三步产生含白细胞介素-2重组逆转录病毒的包装细胞的建立
逆转录病毒载体是一种很有效的基因转移系统。复制缺陷型逆转录病毒载体经包装细胞包装，可产生出高滴度的病毒颗粒，并能高效感染靶细胞，通过整合至宿主细胞基因组而获得长期稳定表达。本研究采用安全性较高的第二代包装细胞PA317对含IL-2基因的缺陷型逆转录病毒载体L(IL-2)SN进行包装，产生出具有高滴度且不具有复制能力的重组逆转录病毒。1.磷酸钙-DNA共沉淀法
转染前一天，将lx106 PA317细胞从培养瓶分至6cm培养皿中，转染前先将32^1 CaCl2(2M)与220(^1质粒DNA (IO吗)充分混匀，再加250W 2xHBS，滴加同时轻柔摇动，置室温30min，以形成细小均匀的沉淀颗粒。然后将上述溶液加到含有细胞的培养皿，于37C°， 5%C02静置20min。再加无血清DMEM培养液， 培养3天后更换培养液。继续培养3天后用0. 5mg/mlG418进行筛选。约14天时 可见抗G418的细胞克隆形成，挑选单个克隆进行扩增。
2. 病毒滴度测定
病毒滴度测定以NIN313/TK—为指示靶细胞。lx105靶细胞培养1天后，加入 经过稀释的含病毒上清液，并加入Polybrene (8吗>1)。 37°C， 5%0)2培养3天 后，更换培养液，并加入G418 (0.5mg/ml)进行筛选。10 14天后可见抗G418 细胞克隆形成，Giemsa染色后，计算克隆数确定病毒滴度。
3. 病毒上清的保存
选择病毒滴度大于lx104 CFU/ml的PA317克隆进行扩增培养，收集24小时 新鲜上清，于-70C。冻存备用。
4. 野生型病毒检测
4. 1 NIH3T3细胞扩增培养
将NIH3T3细胞以lxl()S/孔接种入6孔板中，用DMEM培养液(含10%新生小牛 血清)在37。 C， 5°/￡02中培养24小时。去除6孔板中培养液后，每孔加入0. 5ml 待检样品及1. 5ml DMEM培养液，并加入终浓度为8|ag/ml的Polybrene，继续 37° C， 5%0)2培养，扩增传代1 3周。作为阳性对照，在6孔板中，每孔加入 0.5mli]/AM培养上清，其余同上。在第一周末及第三周末分别收集NIH3T3细胞 24小时培养上清，过滤后用于标记拯救试验；同时消化部分培养细胞，用于聚 合酶链反应(PCR)。 4. 2 S+L—分析
将PG4或MiCL,细胞株以105个/孔接种于6孔板中，加2. 5ml培养液，过夜 后每孔加入20pg/ml的DEAE Dextran; 30min后去除Dextran，各孔加入0. 5ml 上清，其中阳性对照为Mo"MuLV病毒上清，以I:IO, 1:102， 1:103， 1:104稀释， 另两孔为阴性对照及PA317细胞上清，37° C温育2h后去样品另加2. 5ml新鲜 培养液，培养1 2周后观察结果。 4.3聚合酶链反应(PCR)
用常规酚、氯仿法抽提细胞基因组DNA，以空白NIH3T3细胞的基因组DNA 为阴性模板，以x)/AM上清培养的NIH3T3细胞基因组DNA为阳性模板。建立常规的PCR体系25^1 (模板DNA lpg、 1.25mM dNTP 2pl、 10xBuffer 2.5^1、 e/ K基 因引物2pl、Taq酶2nl)，进行40次循环扩增反应(94° C:45" ， 64° C:45")， 最后72° C延长5分种。PCR产物在2y。琼脂糖凝胶电泳上观察结果，阳性模板扩 增产物长度应为375bp。
PCR灵敏度检测:将阳性模板DNA按1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106 稀释，并同时加入阴性模板DNA，使每nl溶液中DNA总量为l吗，而阳性模板 DNA依次为1:1(T、 1:10-2、 1:10-3、 1:10—4、 1:10—5、 l:10、g，从上述溶液中各取 2plDNA作为模板进行PCR扩增。此实验将能从106个细胞中检测出1个带有朋r 基因的阳性细胞，灵敏度为l(T。 4.4标记拯救试验
将lxl06Musdunni细胞接种于10cm培养皿中，置37° C， 5%032中培养24小 时。去除培养皿中培养液后，每孔加入2ml NIH3T3细胞培养上清(前述)及3ml DMEM培养液，并加入终浓度为8叫/ml的Polybrene，置37° C， 5%0)2培养2周。 为设立阳性对照，去除培养皿中培养液后，加入2mlv)/AM培养上清培养的NIH3T3 细胞培养上清，其余同上。收集前述Musdimni细胞培养上清，过滤后取lml加 入到在6孔板中培养的NIH3T3细胞，置37° C， 5%C02中培养24小时，用含 G418(0.6pg/ml)的培养液筛选培养8 10天。在标记拯救试验中，如待测上清中 存在有复制能力的逆转录病毒，则可将Musdunni中的缺陷型逆转录病毒包装出 来，收集上清感染NIH3T3细胞，缺陷型逆转录病毒可整合到宿主基因组中，使 NIH3T3细胞带有Nec/基因，因此能在含G418的培养液中生长并形成克隆者为阳 性；不能生长者为阴性。
第四步白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞种子细胞库的建立
1. 重组逆转录病毒感染
当细胞生长呈80%融合时，加入L(IL-2)SN重组逆转录病毒上清(病毒滴度 lxl06CFU/ml)，并加入Polybrene至终浓度为8吗/ml，置37° C， 5线培养24 小时，按1:2， 1:4传代后加入终浓度为0. 5mg/ml的G418，筛选培养约二周后， 可见G418抗性细胞呈克隆化生长。挑取单个克隆至24孔板中继续扩增培养，建 立克隆化细胞系。
2. 基因组DNA的抽提
10分别将1X106转导及末轩导肿瘤细胞用PBS洗二次，0.25%胰酶消化，800 转离心6分钟，加0. 9ml细胞裂解液(STE20pl， 20%SDS 15pl，蛋白酶K10mg/ml)， 37'C保温过夜后，苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提二次，氯仿异戊醇24:1 抽提一次，按1/10体积加入5M NaCl,按2倍体积加入无水乙醇混匀后得DNA 沉淀，70。/。乙醇洗一次后TE溶解备用.
3. 细胞总RNA抽提 按异硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提法抽提细胞总RNA。分别取各种细胞l X 107，
PBS冼二次，加PBS lml后平分移入两支l. 5ml Eppendorf管中，1200rpm离心 弃上清后，细胞加溶液D 500nl迅速吸打使细胞裂解以抑制RNA酶活性。加 50nl 2M NaAc(pH4. 0)， 500^1 DEPC &0饱和的新鲜重蒸酚，200pl氯仿异戊 醇(49:1)，混匀后置冰浴15分钟，12000rpm离心15分钟。吸出含RNA水相，加 l倍体积异丙醇混匀，-2(TC过夜。12000rpm离心15分钟，沉淀加150pl溶液D 溶解后，加等体积异丙醇，-2(TC放置1小时以上，12000rpm离心15分钟。沉 淀用75%乙醇洗一次后用5(^1 DEPC水溶解，65。C水浴10分钟，-70。C冻存备 用。
4. PCR
先94'C5分钟，接60'C5分钟，然后进行35个循环反应(72'C1'30"， 94°C 45〃， 60°C45〃)，最后72。C10分钟。反应体系为30pl (10X反应缓冲液3^1, 5' 及3'引物各lnl( 25pmo1)， 1.25mmoldNTP 2^1，样品DNA lpg,加ddH20至 30)Ld)。反应结束后1.5 2%凝胶水平或6% PAGE垂直凝胶电泳鉴定。
5. RT-PCR
逆转录反应取各细胞总RNA各5iLil(liag/Vl)，加入RNA酶抑制剂 RNasinO. 5pl，随机引物2pl， 65。C5分钟后置冰浴上加入RNasin0. 5pl， 5X Buffer 4pl， dNTP 7|^1， Mo-MuLV逆转录酶1iLd后置37""C 1.5小时。加入终 止液后备用。
PCR反应各取上述逆转录反应液2pl作为模板，按上述PCR方法进行扩增， p-actin引物作为内标准。
6. Southern印迹杂交
(1) DNA酶解取各细胞基因组DNA各3(Vg，溶于17nl水中，力n2plSacI酶切缓冲液(10X),混匀后加入lpl Sacl (30U/>1) ， 37。C保温过夜。
(2) 电泳及转移上述酶解液5nl加2pl溴酚兰上样缓冲液后，上1%琼 脂糖凝胶电泳，70V、 30mA电泳2 3小时。EB染色观察是否酶解完全。如果酶 解不完全，则再加入lpl Sacl继续保温2 3小时使其完全酶解。然后按上述 条件进行电泳，电泳结束后将胶浸泡于变性液(1.5M NaCl， 0.5MNaOH)中40 分钟，然后在中和液(1M Tris.Cl, 1.5M NaCl)中浸泡30分钟。转移至尼龙膜 方法按分子克隆手册进行。
(3) 探针制备以含细胞因子基因的逆转录病毒载体质粒为模板，按上 述PCR方法制备Neo及IL-2的DNA探针，dNTP用宝灵曼的PCR DIG labeling mix (No. 1585550)替代。杂交及检测采用宝灵曼公司推荐方法进行。
7. Northern印迹杂交
各细胞总RNA 50叫用于电泳。转移至尼龙膜及杂交均参见Molecular Cloning。探针用a32 P-dATP.(购自Amersham公司)标记。
8. 白细胞介素-2活性检测
(1) 待测样品稀释用RPMI1640培养液将待测样品进行1:2、 1:4、 1:8、 1:16倍稀释，加到96孔板中，每孔100pl。同时设立阳性(rlL-2标准品)及阴 性(培养液)对照，三个孔。
(2) 细胞培养取生长状态良好的CTLL-2细胞，用PBS洗涤2 3次，配成 lxl()5细胞/ml，以100^1/孔加到待测样品中，置于37C。 ， 5呢C02中培养16 24 小时。
(3) MTT染色从各孔中轻轻吸取100p-l培养上清，弃去。各孔中再加入10pl MTT溶液，继续37C。中孵育4 6小时后，各孔加入lOO)nl酸化异丙醇，充分震 荡吹打后静置20分种。
(4) 比色用波长570nm的酶标仪检测。
(5) 结果判定IL-2活性是以细胞培养上清所具备的维持IL-2反应细胞增 殖能力来确定的。IL-2的活性单位可通过与IL-2标准品对比而判定。方法为将 待测上清和IL-2标准品均稀释成不同的倍数后观察IL-2反应细胞的增殖情况， 求出IL-2标准品组中反应细胞最高增殖数50%时的稀释倍数，同时求出待测标 本相应的稀释度。两个稀释度倒数之比乘以IL-2标准品的活性单位，即是待测标本的IL-2活性单位。
9.白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞种子细胞冻存
0. 25%胰酶消化白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞种子细胞后，移入5ml培 养液中，以800rpm离心5分钟，将上清吸尽，按lx106细胞加lml冻存液(含 30%小牛血清及10%DMS0)，移入冻存管中。先放在4C。降温30分钟，然后移入气 态的液氮中继续降温30分钟，最后将冻存管放入液氮生物容器内的液氮里保存。
第五步瘤苗的灭活
1. 细胞收集及洗涤
常规扩增培养的白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞，用PBS洗漆两次后， 以0.25%胰酶消化，收集lx108细胞至400ml离心瓶中，内含400ml pH7.4无钙、 镁磷酸缓冲液(PBS)。以1000rpm离心10分钟清洗，共清洗三次，最后将PBS 上清吸尽，按lx107细胞加lml冻存液，移入冻存管中。
2. 6()0)照射灭活白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞
在6GQ)治疗仪(THERATRON780-C)下，按40G、 60G、 IOOG辐射强度分 别进行照射，照射后的细胞命名为白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗 (HG-l/IL-2)。
3. HG-l/IL-2冻存
先放在4C。降温30分钟，然后移入气态的液氮中继续降温30分钟，最后将 冻存管放入液氮生物容器内的液氮里保存。
4. HG-l/IL-2细胞存活率测定
将复苏后的HG-l/IL-2，用5ml完全培养液悬浮。取4滴于载玻片上，用0.1% 台酚兰(溶于0.9%生理盐水)染色2 3分钟，观察结果。细胞中有深蓝色颗粒 浸润即为死亡细胞，透亮的则为活细胞。4滴样品各随机取视野计数100个细胞， 细胞存活率=活细胞数/100。 4滴样品的平均值即为某一天的活细胞数，将总细胞 数x存活率即得总活细胞数。
实施例1 细胞复苏
从种子细胞库的液氮生物容器内取出1管细胞，立即放入40C。水浴中摇动融 化，将融化的细胞移到含5ml完全培养液的离心管中，以800rpm离心5分钟。
13弃上清后，将细胞悬液移到含有37C。预温完全培养液的瓶内，置5%032培养箱 内，37C。培养。
实施例2 细胞大量培养及收集
吸出细胞培养液，用pH7.4无钙、无镁磷酸缓冲液洗瓶2次后，加入细胞消
化液，待细胞散开后，将消化的细胞悬液移入含有完全培养液的培养瓶中(1x107
细胞/10ml培养液)。
将细胞悬液移至400ml无菌离心瓶内，以1000rpm离心10分钟，弃上清。
加入400ml pH7.4无钙、无镁磷酸缓冲液，使细胞均匀悬浮，以10G0rpm离心
IO分钟，反复洗涤三次。
细胞冷冻保存液为98%右旋糖酐注射液及2M(W/V)人血白蛋白注射液。 根据细胞计数，按1x107细胞/lml冻存液/管计算，加入细胞冷冻保存液，
并使细胞均匀悬浮后分装。管外贴有品名及批号。
将含细胞悬液的冻存管置60Co治疗仪下，以100G辐射剂量进行照射。 细胞制品冷冻保存管先放在化°降温30分钟，然后移入气态的液氮中继续
降温30分钟，最后将冷冻保存管移入液氮生物容器内的液氮中保存。
权利要求
1.一种白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备工艺，其特征在于，用基因工程技术，以逆转录病毒载体介导，将人白细胞介素-2(IL-2)cDNA转导入人胃癌细胞株MKN-45。
2. 如权利要求l所述，其特征在于，应用61)0)照射使其灭活。
3. 如权利要求l所述，其特征在于，该细胞株表达HLA-A2分子。
4. 如权利要求l所述，其特征在于，该白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞有如下步骤得到用含白细胞介素-2的重组逆转录病毒上清感染MKN-45得到白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞，应用6QCo照射使其灭活。
5. 如权利要求l所述，其特征在于，该白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞疫苗可以用于治疗胃癌。
全文摘要
本发明提供了一种灭活的白细胞介素-2基因工程人胃癌细胞瘤苗的制备工艺。用基因工程技术，以逆转录病毒载体介导，将人白细胞介素-2(IL-2)cDNA转导入人胃癌细胞株MKN-45，经⁶⁰Co照射灭活后制成，简称HG-1/IL-2。能分泌具有生物活性的IL-2，具有增强机体抗肿瘤免疫反应能力，供临床原发性胃癌患者使用。
文档编号C12N13/00GK101560517SQ20081003602
公开日2009年10月21日 申请日期2008年4月14日 优先权日2008年4月14日
发明者钱关祥, 陈诗书 申请人:上海交通大学医学院;上海新生源医药研究有限公司