专利名称：小核糖核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小核糖核酸及其相关应用。
背景技术：
肝癌是东南亚和南非的最常见肿瘤之一，其死亡率也非常高。人类疾病很多是由于一些基因表达紊乱或失控所引起的。小核糖核酸(小RNA， microRNA，miRNA)是一类长度约21-25nt的不编码蛋白质的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，通过核酸序列互补性结合到特定的靶mRNA上来调节靶mRNA翻译或降解耙mRNA,是一种起负调控作用的分子。目前研究显示许多miRNA参与了生物体发育、分化、生长、免疫应答等生理过程，且其表达及功能失调可能导致肿瘤发生，白血病以及病毒感染等多种病理现象。
尽管目前有报道显示miRNA可能在生物体发育、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。本领域仍然迫切需要了解在肝癌中的miRNAs表达谱，更需要了解与肝癌预后有关的miRNA表达谱。
发明内容
本发明旨在提供一种小核糖核酸的用途。本发明的另一个目的是提供一种探针。
本发明的再一个目的是提供上述探针的用途，所述用途是制备辅助性检测肝癌预后的试剂盒。
本发明的第四个目的是提供一种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方法。
本发明的第五个目的是提供一种辅助检测肝癌预后的方法。本发明的第六个目的是提供一种筛选与肝癌预后的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在物质的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸序列如SEQ IDNO: 1所示的寡核苷酸，所述的小核糖核酸可用于制备辅助检测肝癌预后的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂是特异性地针对小核糖核酸的探针。
在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有特异性地针对序列如SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸的探针和说明书。
在本发明的第三方面，提供了一种探针的用途，所述探针用于制备辅助检测肝癌预后的试剂盒；所述的探针特异性地针对序列如SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸。
在本发明的第四方面，提供了一种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方法，所述方法包括步骤
(i) 将核酸样品与特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示；
(ii) 根据样品与小核糖核酸的探针的杂交情况，获得所述小核糖核酸的表达谱。
在另一优选例中，所述的探针位于芯片上。在另一优选例中，所述的核酸样品是抽提核酸。
在本发明的第五方面，提供了一种体外非诊断性辅助检测肝癌预后的方法，
所述方法包括步骤
(i) 将待检体系和含有特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示；
(ii) 观察待检体系与所述探针的杂交情况，其中，如果所述待检体系可与探针杂交，则表明该待检体系存在肝癌预后佳的可能性；
所述待检体系选自组织、细胞体系、或抽提的核酸。
在本发明的第六方面，提供了一种筛选候选物质的方法，所述方法包括步骤(a)将待筛选物质与实验组的肝癌细胞培养物接触，然后检测所述肝癌细胞中小核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，从而获得实验组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱；
(b)将实验组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱与空白对照组表达谱
及正常肝细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱进行比较，所述空白对照组表达谱是来自不加入待筛选物质的肝癌细胞培养物；
其中，如果实验组表达谱与空白对照组表达谱的一致率<70%，说明该待筛选物质是与肝癌预后的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在物质，可以作为进一步筛选的基础；较佳地， 一致率<50%，更佳地， 一致率<20%。
据此，本发明提供了在肝癌中的miRNAs表达谱，进一步地，提供了与肝癌预后有关的miRNA表达谱。
图1显示了 Kalplan-Meier生存分析的结果；其中
A是肝癌组织中HsaiiR-125b的表达水平；
B是hsa-mir-125b的表达与肝硬化状态对肝癌预后的影响情况。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现了一种miRNA，该miRNA (如SEQ ID NO: l所示序列)的表达与肝癌患者的预后有关。
M濯A IDSEQUENCESEQ ID NO:
hsa-miR-125bUCCCUGAGACCCUAACUUGUGASEQ IDNO:l
基于本发明的上述新发现，发明人完成了一系列的发明，例如但不限于
1、 获得一种能特异性地同SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA结合的探针；
2、 制备一种用于辅助性检测肝癌预后的试剂或试剂盒；
4、 检测能同SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA特异性结合的物质的方法；
5、 用于初步评估相关人群的肝癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；
6、 获得一种基因芯片(微列阵芯片)，芯片上含有能特异性地同SEQ ID NO:1所示序列的miRNA结合的探针。
6本发明包括可用于检测miRNA的表达水平，进而辅助性检测肝癌预后的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性地针对miRNA的探针。优选的，所述探针携带可检测信号。所述的探针可固定在微阵列(raicroarray)或基因芯片上。
本发明还涉及定量和定性检测miRNA水平，从而判断肝癌预后的试验方法。这些试验是本领域所熟知的，例如包括(但不限于)实时荧光定量PCR，聚类分析，非参数Mann-Whitney检验，Spearman相关性分析等。
一种检测待测组织或样品中是否存在所述miRNA及其存在量的方法是利用实时荧光定量PCR进行检测，它包括制备hsa-miR-125b的特异性探针(所述探针优选携带可检测信号)，制备hsa-miR-125b的特异性引物，进行PCR，然后通过检测PCR结束后的可检测信号的强弱来判断所述miRNA的水平。作为本发明的优选方式，基于TaqMan荧光技术，即以TaqMan荧光探针为基础进行检测。TaqMan荧光探针为一种寡核苷酸，其两端分别标记一个荧光发射基团(作为可检测信号)和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而通过荧光检测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，即荧光信号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。
所述的小核糖核酸特异性的引物和/或探针也包含在本发明内，用于检测样品中是否存在所述小核糖核酸及其存在量，从而用于辅助性判断受试者肝癌的预后情况。所述的探针可固定在微阵列(microarray)或基因芯片上，用于分析组织或样品中miRNA的差异表达分析和基因诊断。
本发明提供的芯片含有特异性地针对miRNA的探针，所述miRNA如SEQ ID NO:1所示序列。
在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选方法，所述的方法包括将候选物质与如SEQ ID NO: 1所示序列的探针接触；观察候选物质与所述探针的杂交情况，其中，若所述候选物质可与探针杂交，则表明该候选物质是与肝癌预后有关的潜在物质。
更优选的，可通过设置对照组来观察候选物质与所述探针的杂交情况；所述对照组是不添加所述候选物质的体系。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于-
1、 首次揭示和证明了一类小核糖核酸与肝癌预后密切相关，找到了可作为辅助性判断肝癌预后的重要生物标志物，为该疾病的防治提供了新的靶点；
2、 首次揭示如SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA同肝癌预后的相关性，为
相关疾病的防治提供了有效途径；
3、 本发明人分析了大量的肝癌患者中小核糖核酸的水平，并与正常人作了细致的比较，因此结果准确可靠。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
肝癌预后验证实施例材料与方法
病例组织
78对癌和癌旁组织来自于原发性肝癌患者的手术切除标本，这些标本去自于浙江大学第一附属医院病理科和启动肝癌研究所。IO例正常肝来自意外死亡者。所取得所有组织标本均通过上海市政府授权的世界卫生组织合作组织伦理委员会的同意。手术切除标本均经过了病理学分析，病理分级依照Edmonson标准。临床资料包括年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移、肝硬化状态、HBV和HCV感染情况，这些资料都来自于患者的病例记录。所有患者术前都没有接受化疗，术后随访最长达68个月。MicroRNA芯片
探针设计针对成熟miRNAs序列，miRNAs序列从sanger数据库下载(http://microrna-sanger.ac.uk; miRBase Release 7.0， accessed June,2005).靶序列包含人类miRNAs 435个，122个预测miRNAs序列和75个大鼠和小鼠的序列，总计芯片上包括了 509个靶向于成熟miRNAs探针。除此之外我们设计了 8个己知的RNA没有互补结合的寡核苷酸序列作为阴性对照。其它的耙miRNAs探针釆用Ambion公司的mi腿Probe Construction Kit (Ambion,Austin, TX USA)合成。
RNA抽提和样品准备
富含miRNA的用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得，具体操作按照相应说明书小RNA。样品用T4 RNA连接酶标记步骤依照Thomson'的方法(11)。简而言之，4 小RNA和500 ng 5'-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶-cy3-3， (Dharmacon， Chicago, USA)及2单位2 units T4 RNA ligase (NEB,Ipswich, USA),于4'C孵育2小时，对miRNA进行标记。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。标记的RNA用0.3 M醋酸钠和2. 5体积乙醇进行沉淀，再用15 W含3XSSC、 0.2% SDS和15%甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlip (Erie, PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。将杂交室放在杂交仪BioMixer II上(CapitalBio Corp， Beijing,China)于42'C水浴杂交过夜，之后用洗液洗两遍。
实时RT-PCR验证芯片结果
RNA样品用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒合成单链cDNA (AppliedBiosystems， Foster, USA)。我们用ABI公司合成的miRNA和U43 MGB探针检测PCR产物，以U43作为内参进行相对定量分析。每个逆转录反应用1-10 ngmiRNA，耙基因和U43在同一反应体系中进行逆转录。相对定量real-time PCR反应用ABI 7300系统进行反应(Applied Biosystems, Foster, USA)。本研究运用looped-primer进行特异的逆转录的反应确保检测的目的基因仅为成熟miRNAs。生存分析
我们进一步用单变量cox风险回归模型分析了癌与癌旁有差异的microRNAs与预后的关系。以microRNAs在75例具有完整随访资料的病例中表达值的中位数为界分为microRNAs表达高与低两组，之后用Kaplan-Meier生存分析法分析这两组患者的的生存情况与该microRNA表达有无关系。
结果
MicroRNA表达谱与肝癌病人术后生存期的相关性
在芯片检测的78例肝癌患者中，其中75例有完整的随访资料。发明人用单变量COX风险回归模型分析69个在癌和癌旁差异的miRNAs在75例肝癌组织中表达水平与预后的关系。
结果发现hsa-mir-125b表达较高的肝癌患者术后生存时间相对较长，风险比为1.787， 95%可信区间为1.020-3.133, p=0. 043。并且hsa-mir-125b的表达与肝硬化状态对肝癌预后的影响有一定的协同作用，即hsa-mir-125b高表达，且无肝硬化的肝癌患者预后最好，而hsa-mir-125b低表达，且有肝硬化的肝癌患者预后最差，hsa-mir-125b高表达但有肝硬化，与hsa-mir-125b低表达但无肝硬化的肝癌患者的预后无明显差异，处于最好和最差之间，详见图1。
实施例2
肝癌预后检测试剂盒
如实施例1所述，如序列SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸与肝癌预后密切相关。因此，可基于这个抽提病人的miRNA进行检测。
随机挑选30个人构成的测试组，其中包括未知肝癌预后情况的对象和己知肝癌预后情况的病人。
获得测试组中待检测对象的肝组织切片，使用如实施例1的方法抽提RNA和制备检测样品。
RNA样品用Applied Biosystems公司的TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒，用特异的，带有颈环的引物进行逆转录，以保证实时PCR时仅检测到成熟miRNAs。每个逆转录反应用1-10 ng RNA，耙基因和U43在同一反应体系中进行逆转录。反应体系如下:
IOX逆转录缓冲液(reverse buffer)核糖核酸酶抑制剂(Rnase inhibitor)
0. 2ii 1
1. 5u 1
逆转录酶(Transcribe reverse transcriptase)
lOOmM dNTP混合物(dNTP mix)逆转录引物混合物(RT primer mix)
0. 15u 1
各lii 1
RNA样品加水至15 p 1
发明人用ABI公司合成的MGB探针检测PCR产物(MGB探针序列为hsa-miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA),以U43作为内参进行相对定量分析。相对定量实时PCR反应用ABI 7300系统进行反应。每个样品重复三个孔。如下反应体系在95'C预变性5min，之后9 5'C变性30s, 60。C lmin，40个循环。
反应体系如下
2X实时PCR混合物(real time PCR mix) 10u 1
检测结果
对于SEQ ID NO: 1和表达较高的的对象，进一步随访了解其术后生存情况。
检测结果表明，SEQ ID NO: 1表达越高的检测对象其肝癌术后存活期明显长于表达低的人群。
因此，这表明通过本发明提供的芯片和试剂盒，可进行肝癌预后的辅助性
引物逆转录产物加水至20 u 1
1. 3u 1判断。实施例3
肝癌预后辅助性检测
重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了 IO个人(检测前不知道肝癌预后情况)进行检测。
结果同样证实了， SEQ ID NO: 1和表达越高的检测对象其肝癌术后存活期明显长于表达低的人群。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110> h海市肿瘤研究所<120〉小核糖核酸及其应用<130> 081099<160> 1
<170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1<211> 22<212〉 腿
<213> 智人(Homo Sapiens)<400> 1
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
1权利要求
1.一种小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸序列如SEQ ID NO1所示的寡核苷酸，其特征在于，用于制备辅助检测肝癌预后的试剂或试剂盒。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂是特异性地针对小核 糖核酸的探针。
3. —种试剂盒，其特征在于，它含有特异性地针对序列如SEQ ID N0: 1所示 的小核糖核酸的探针和说明书。
4. 一种探针的用途，其特征在于，所述探针用于制备辅助检测肝癌预后的试 剂盒；所述的探针特异性地针对序列如SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸。
5. —种体外非诊断性检测核酸样品中小核糖核苷酸的方法，其特征在于，所 述方法包括步骤(i) 将核酸样品与特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖核酸 的序列如SEQ ID NO: 1所示；(ii) 根据样品与小核糖核酸的探针的杂交情况，获得所述小核糖核酸的 表达谱。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的探针位于芯片上。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的核酸样品是抽提核酸。
8.一种体外非诊断性辅助检测肝癌预后的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(i) 将待检体系和含有特异性地针对小核糖核酸的探针接触，所述小核糖 核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示；(ii) 观察待检体系与所述探针的杂交情况，其中，如果所述待检体系可 与探针杂交，则表明该待检体系存在肝癌预后佳的可能性；所述待检体系选自组织、细胞体系、或抽提的核酸。
9.一种筛选候选物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(a) 将待筛选物质与实验组的肝癌细胞培养物接触，然后检测所述肝癌细胞中小核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，从而 获得实验组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱；(b) 将实验组肝癌细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱与空白对照组表达谱 及正常肝细胞中所述小核糖核苷酸的表达谱进行比较，所述空白对照组表达谱是来自不加入待筛选物质的肝癌细胞培养物；其中，如果实验组表达谱与空白对照组表达谱的一致率<70%，说明该待筛选物质是与肝癌预后的小核糖核苷酸表达谱相关的潜在物质，可以作为进一 步筛选的基础；较佳地， 一致率<50%，更佳地， 一致率<20%。
全文摘要
本发明公开了与肝癌预后有关的特异性表达的小核糖核酸，本发明还公开了有关该小核糖核酸的用途，例如含有特异性地针对所述小核糖核酸的探针，用于预测肝癌预后的辅助性检测试剂或试剂盒等。
文档编号C12Q1/68GK101555518SQ200810035839
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月10日 优先权日2008年4月10日
发明者万大方, 何祥火, 李文晰, 杨胜利, 顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所