专利名称：一种白细胞介素-2重组逆转录病毒包装细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程、细胞工程领域，更具体地，本发明提供了一种白细胞 介素-2重组逆转录病毒的包装细胞的建立方法。
背景技术：
原发性胃癌为我国高发的恶性肿瘤。在胃癌治疗历史上，手术切除是主要手
段，但术后常复发。胃癌晚期(ni期)患者，常缺乏有效的延长病人生命的治疗方 法。若这些胃癌患者经一些有效的辅助治疗措施使胃癌肿瘤縮小后，再行切除， 有可能使胃癌治疗有一个突破。
90年代新兴的肿瘤基因治疗己成为肿瘤生物治疗的重要措施之一，并被誉 为继手术、化疗和放疗之后的另一种具有潜在前途的治疗方法。近年来肿瘤基因
治疗的研究无论从深度上还是广度上都取得了很大进展。在获得美国重组DNA 咨询委员会(RAC)、 NIH专家委员会和FDA批准的基因治疗临床试验方案中，以 肿瘤为最多，充分显示基因治疗在肿瘤研究中的迫切性。目前所开展的肿瘤基因 治疗中，以肿瘤免疫基因治疗的研究为最多。肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗 是以主动免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转导入肿瘤细胞中，以制备出免疫 原性更强的新型瘤苗，并由于细胞因子的持续分泌，从而激发机体产生抗肿瘤免 疫反应，达到治疗肿瘤的目的。研究表明，细胞因子基因治疗不仅在一定程度上 克服了以往临床直接应用细胞因子需反复多次且副作用明显的缺点，而且也取得 了直接应用所不具有的疗效。
白细胞介素-2是由活化T细胞所分泌的一种细胞因子，具有刺激多种免疫 效应细胞活化的作用，包括T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等。在肿瘤免疫 中起到重要作用。十多年前已开始将重组白细胞介素-2应用于临床恶性肿瘤病 人。这种白细胞介素-2的系统性应用在黑色素瘤及其它一些肿瘤病人中取得一 定的效果，报道有效率为15~20%。这种疗法主要是基于白细胞介素-2可使T细 胞活化，从而有助于杀伤肿瘤细胞。然而由于白细胞介素-2在血液中的半衰期较短，而反复多次大剂量的应用又产生严重的毒副作用，因而限制了白细胞介素 -2的临床应用。
1990年，两个研究小组分别报道了应用基因工程技术，将白细胞介素-2基因 转导至肿瘤细胞。动物实验结果表明，可分泌白细胞介素-2的肿瘤细胞丧失了致 瘤性。进一步观察发现，体内接种白细胞介素-2基因转导的肿瘤细胞后可抵抗后 续野生型肿瘤的攻击。这些数据表明(l)基因修饰的肿瘤细胞自身可与T细胞 相互作用，(2)肿瘤细胞分泌的白细胞介素-2可替代辅助T细胞的作用，来激活 肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞[11]。类似的研究结果在多种肿瘤模型中相继得到 证实，包括肠癌(CT26)、纤维肉瘤(CMS5)、肥大细胞瘤(P815)、黑色素瘤(M-3)1 等。
我们在动物肿瘤模型研究中也发现，白细胞介素-2基因修饰的小鼠肿瘤细胞 Hn及MM45T丄i均显著降低其致瘤性，并能有效保护后续野生型肿瘤的攻击。
与此同时，在全世界范围内，应用白细胞介素-2基因工程瘤苗的临床试验不 断获得批准，在细胞因子基因修饰肿瘤细胞的临床试验方案中，以白细胞介素-2 基因应用最多。目前己有23个相关治疗方案获得批准，涉及到的肿瘤类型包括 黑色素瘤、肾癌、肠癌、前列腺癌、头颈部肿瘤及肺癌等。
在所应用的基因转移系统中，逆转录病毒载体系统应用最早，对其研究也很 深入。该系统最大的优点是可以前病毒形式稳定整合至宿主基因组中，从而使目 的基因的长期稳定表达成为可能。尽管这种整合形式有可能导致宿主基因组的插 入突变(insertion mutation),但采用安全的ex vivo治疗方案，可使插入突变对机 体带来的潜在危险降至最低。此外，作为第二代复制缺陷型逆转录病毒载体系统， LXSN系统更为安全，产生有复制能力的野生型病毒的可能性很小。该载体系统 也是被美国FDA获得批准可应用于临床试验的载体之一。自1990年应用逆转录 病毒载体于临床基因治疗以来，尚无发现该病毒的毒副反应报道。
本发明提供了一种白细胞介素-2重组逆转录病毒的包装细胞的建立方法，为 癌症的治疗提供了一种新的治疗途径。
发明内容
本发明提供了一种白细胞介素-2重组逆转录病毒的包装细胞的建立方法。包括mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR扩增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、 含IL-2重组逆转录病毒载体的组建、以及白细胞介素-2重组逆转录病毒包装细 胞制备。
在本发明的第一方面，提供了一种含信号肽的白细胞介素-2 cDNA的缺陷型 逆转录病毒载体LXSN的制备方法。
在本发明的第二方面，提供了一种含IL-2重组逆转录病毒载体的包装细胞 PA317组建方法。
无。
具体实施例方式
第一步含信号肽的白细胞介素-2 cDNA的制备。
1. PHA剌激的人外周血细胞人外周血用淋巴细胞分离液分离出单 个核细胞，共约lxl(^细胞，经植物血凝素(PHA)10pg/ml剌激30小时， 使细胞因子基因表达，以备抽提mRNA。
2. mRNA的抽提及cDNA的合成
(1) mRNA的抽提离心收集细胞，悬浮于1.5mlRNA抽提缓冲液， 用注射器反复抽打匀浆细胞，然后再补加3ml抽提缓冲液，充分混合，离 心1000 cpm5分钟，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合内容物，350g离心两分钟，弃去柱内液体，取4ml上清上柱，混匀，弃 去液体。然后用高盐缓冲液洗三遍，低盐缓冲液洗二遍，最后用经65°C预 热的洗脱缓冲液洗脱三次，每次用0.25ml，收集洗脱液，然后乙醇沉淀 poly(A)十RNA(mRNA)。
(2) cDNA的合成将mRNA溶于20|al ddH20中，65°C10分钟，置于 冰上备用。在第一条链反应混合液内加入lmlDTT和热变性的RNA， 37 'C保温1小时，再将此反应液加入第二条链反应混合液中，12°C和22°C 各保温1小时，最后加1^1 Klenow酶，37°C 30分钟，65°C10分钟后再用酚和氯仿抽提，经Sephacryl S-300柱纯化后-2(TC保存。
2. PCR扩增IL-2基因取制备好的PBLcDNA10nl，加入5'和3'扩 增引物各lnl( 30pmo1)、 10X反应缓冲液5pl、 dNTP4pl、加水至50|al， 94°C 5分钟变性，力卩Pfu酶1U(2.5U)，进行30个循环反应.(94。C 45"、 55tM5"、 72"C1'20")。反应结束后，将反应产物用等体积苯酚/氯仿抽提一 次，乙醇沉淀。
3. IL-2cDNA的克隆为了鉴定PCR产物的准确性，须先将产物克 隆入pUC 18或pBluescriptDNA ， 经DNA序列测定确认为IL-2 cDNA无 误后再将这一片段回收，并与表达载体重组。故将PCR产物溶于TE，用 适当的限制性内切酶水解后，与用同样酶水解过的载体DNA重组，转化 TG1后涂于LB/AP平板，37'C培养过夜。
4. 质粒DNA小量抽提将一个单菌落接入含AP(50pg/ml)的3ml LB 中，37i:培养过夜。将菌液转移至1.5ml离心管中，5000rpm离心2分钟， 沉淀菌体。用100nl溶液I悬浮菌体，再加20(Hil溶液I1，温和颠倒混匀， 置于冰上，待溶液澄清后，加入溶液m，充分混匀。15000rpm 10 分钟离心，收集上清，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加2.5倍乙 醇混匀，沉淀。离心15000rpm 10分钟，将沉淀用70%乙醇洗一次，水 泵抽干，最后溶于20plTE，用200吗/ml RNase处理1小时，-20卩存放。
5. 质粒DNA的大量抽提
(1) 接种培养将一个单菌落接种于3mlLB(含AP)中培养至对数晚期 (OD600"0.6)，取500nl接种入50ml含抗菌素的LB中，同样培养至对数 晚期，再取15ml接种入含相应抗菌素的1.5LLB中，培养过夜。
(2) 质粒抽提将1.5L培养物离心5500rpml0分钟，收集菌体。用吸 水纸将离心管壁上残余液体擦干。将菌体悬浮于30ml溶液I中，置室温中 IO分钟。加液体Il60ml，混合均匀后置冰上10分钟。加溶液ni45ml，置 冰浴10分钟后，15000rpm离心IO分钟。纱布过滤后取上清，加等体积异 丙醇沉淀，15000rpm离心10分钟，用70%乙醇洗一次，真空干燥。将沉 淀溶于20mlTE，加入等体积5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置 IO分钟，4。C15,000rpm离心10分钟，取上清，用等体积异丙醇沉淀。离心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase至200pg/ml， 37°C 30分钟。加等体 积13%PEG(8000)/1.6M NaCl沉淀DNA，冰浴放30分钟。离心沉淀，干 燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇各抽提一 次。最后加1/10体积3MNaAc及2倍乙醇沉淀。.2(rC保存。用时再 离心沉淀，溶于TE。
(3) CsCl超离心纯化DNA: 如上述碱法抽提的DNA，经LiCl纯 化后，用于CsCl超速离心，按lg/ml的用量，加入固体CsCl， 3(TC溶解。 每10mlDNA加入0.8ml溴乙锭溶液(10mg/ml)， CsC溶液的最终密度是 1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙锭浓度约为704pg /ml。室温8000rpm 5 分钟，浮在溶液上的是溴化乙锭和蛋白质形成的复合物。将浮渣下的清亮 溶液用注射器吸入用于超离心的离心管中，用轻石蜡油补满其余部分，并 封口。 45000转/分离心24 48小时(20。C)。离心完毕，在普通光照下可 见两条DNA区带，下部区带由闭环质粒DNA组成，用针头插入此带， 吸出至1.5ml管中，用等体积的经水饱和的正丁醇反复抽提,直至粉红色从 水相和有机相中消失。将水相加3倍TE稀释，加2.5倍无水乙醇沉淀。离 心后用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE， -2(TC保存。
6. 限制性内切酶反应根据不同的限制性内切酶选择相匹配的缓冲 液。 一般取0.5 l|xg DNA，限制性内切酶 5U，反应体积20pl， 37°C 保温1 2小时，用1.2%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0.5 l叫/ml)鉴定 酶切结果。
7. 冻融法回收酶切片段在紫外灯下将DNA片段从琼脂糖凝胶中切 下来，加入10(HxlTE，在干冰乙醇内冻结后置37°C15分钟，反复三次， 15000rpm离心10分钟后吸出上清，加入1/10体积NaAc和2倍体积乙醇 沉淀，离心收集，沉淀经水泵抽干后，溶于TE，即可进行连接反应。
8. DNA连接将等克分子数的待连接DNA混合，加入5XT4连接酶 缓冲液4pl，加水至20nl，加入T4DNA连接酶2U， 12'C连接过夜，即可 用于转化。
9. 重组DNA的转化
(l)感受态细胞制备将培养过夜的受体菌25(Hil接种于50nlLB中，37°C1.5 3小时至对数中期，菌液置冰浴IO分钟，5000rpm离心5分钟， 沉淀菌体用1/2体积经预冷的100mM MgCI2悬浮，冰浴20分钟，4°C 5000rpm离心5分钟，将菌体悬浮于1/15 1/10体积的100mM CaCl2中， 冰浴中放60分钟，即可用于转化。
(2)重组DNA的转化将连接过夜的DNA加入100^1感受态细胞， 混匀，冰浴中放置40分钟，间或轻轻混匀，42'C2分钟，涂布于含抗菌素 的LB平板上，37°C培养过夜。 10.双链DNA测序
(1) 双链变性样品DNA约1.5-2(ag，溶于8jal ddH20，加2M NaOH 2pl， 置室温IO分钟，力[]3pl 3M NaAc中和，再加7nlddH20后，力卩60|iil乙醇 沉淀，离心15000rpm 10分钟，抽干后溶于10^1 ddH20。
(2) 退火反应l(HU变性模板，加2pl引物，2lal退火缓冲液，65°C， 5分钟，缓慢冷却至室温。
(3) 延伸反应将退火后的反应液加入lnlddH20标记混合物3^1、 T7聚合酶2pl(3U)、和0.5^1同位素(a-"P)标记的dATP，室温反应5分钟。
(4) 终止反应取上述反应液4.5^1至预先分装好的4管分别标记有 G、 A、 T、 C的终止混合物中(各2.5pl)，混匀，37°C 5分钟，加5|nl终止 液。在电泳上样前样品置75 8(TC2分钟变性。
第二步含IL-2重组逆转录病毒载体的组建。
将pLXSN用EcoR I和BamH I酶切，与经同样酶切的IL-2相连接，重组载 体经酶切鉴定后含有正确的插入片段，命名为L(IL-2)SN。
第三步产生含白细胞介素-2重组逆转录病毒的包装细胞的建立
逆转录病毒载体是一种很有效的基因转移系统。复制缺陷型逆转录病毒载体 经包装细胞包装，可产生出高滴度的病毒颗粒，并能高效感染靶细胞，通过整合 至宿主细胞基因组而获得长期稳定表达。本研究采用安全性较高的第二代包装细 胞PA317对含IL-2基因的缺陷型逆转录病毒载体L(IL-2)SN进行包装，产生出 具有高滴度且不具有复制能力的重组逆转录病毒。1. 磷酸钙-DNA共沉淀法
转染前一天，将lx106 PA317细胞从培养瓶分至6cm培养皿中，转染前先将 32|al CaCl2(2M)与220nl质粒DNA (IO吗)充分混匀，再加250^1 2xHBS，滴加 同时轻柔摇动，置室温30min，以形成细小均匀的沉淀颗粒。然后将上述溶液加 到含有细胞的培养皿，于37C°， 5%C02静置20min。再加无血清DMEM培养液， 培养3天后更换培养液。继续培养3天后用0. 5mg/mlG418进行筛选。约14天时 可见抗G418的细胞克隆形成，挑选单个克隆进行扩增。
2. 病毒滴度测定
病毒滴度测定以NIN313/TK—为指示靶细胞。lx105耙细胞培养1天后，加入 经过稀释的含病毒上清液，并加入Polybrene (8ng/ml)。 37°C， 5%(]02培养3天 后，更换培养液，并加入G418 (0.5mg/ml)进行筛选。10 14天后可见抗G418 细胞克隆形成，Giemsa染色后，计算克隆数确定病毒滴度。
3. 病毒上清的保存
选择病毒滴度大于lx104 CFU/ml的PA317克隆进行扩增培养，收集24小时 新鲜上清，于-70C。冻存备用。
4. 野生型病毒检测
4. 1 NIH3T3细胞扩增培养
将NIH3T3细胞以lxlOV孔接种入6孔板中，用DMEM培养液(含10%新生小牛 血清)在37。 C， 5%(]02中培养24小时。去除6孔板中培养液后，每孔加入0. 5ml 待检样品及1. 5ml DMEM培养液，并加入终浓度为8吗/ml的Polybrene，继续 37° C， 5%0)2培养，扩增传代1 3周。作为阳性对照，在6孔板中，每孔加入 0.5mlv)/AM培养上清，其余同上。在第一周末及第三周末分别收集NIH3T3细胞 24小时培养上清，过滤后用于标记拯救试验；同时消化部分培养细胞，用于聚 合酶链反应(PCR)。 4. 2 S+L—分析
将PG4或MiCL,细胞株以105个/孔接种于6孔板中，加2.5ml培养液，过夜 后每孔加入20|ag/ml的DEAE Dextran; 30min后去除Dextran，各孔加入0. 5ml 上清，其中阳性对照为Mo—MuLV病毒上清，以1:10， 1:102， 1:103， 1:104稀释， 另两孔为阴性对照及PA317细胞上清，37° C温育2h后去样品另加2. 5ml新鲜培养液，培养1 2周后观察结果。 4. 3聚合酶链反应(PCR)
用常规酚、氯仿法抽提细胞基因组DNA，以空白NIH3T3细胞的基因组DNA 为阴性模板，以v(/AM上清培养的NIH3T3细胞基因组DNA为阳性模板。建立常规 的PCR体系25)nl (模板DNA lpg、 L25mM dNTP 2^1、 10xBuffer 2.5^1、 e"K基 因引物2pl、 Taq酶2pl)，进行40次循环扩增反应(94° C:45" ， 64° C:45")， 最后72° C延长5分种。PCR产物在2免琼脂糖凝胶电泳上观察结果，阳性模板扩 增产物长度应为375bp。
PCR灵敏度检测将阳性模板DNA按1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106 稀释，并同时加入阴性模板DNA，使每pl溶液中DNA总量为l吗，而阳性模板 DNA依次为1:10一1、 l:l(T2、 1:1(T3、 1:1(T4、 1:10—5、 l:10、g，从上述溶液中各取 2plDNA作为模板进行PCR扩增。此实验将能从106个细胞中检测出1个带有朋y 基因的阳性细胞，灵敏度为1(T6。 4.4标记拯救试验
将lxl06Musdunni细胞接种于10cm培养皿中，置37° C， 5%(:02中培养24小 时。去除培养皿中培养液后，每孔加入2ml NIH3T3细胞培养上清(前述)及3ml DMEM培养液，并加入终浓度为8吗/ml的Polybrene，置37° C， 5%0)2培养2周。 为设立阳性对照，去除培养皿中培养液后，加入2mlii/AM培养上清培养的NIH3T3 细胞培养上清，其余同上。收集前述Musdurmi细胞培养上清，过滤后取lml加 入到在6孔板中培养的NIH3T3细胞，置37° C， 5%0)2中培养24小时，用含 G418(0.6ng/ml)的培养液筛选培养8 10天。在标记拯救试验中，如待测上清中 存在有复制能力的逆转录病毒，则可将Musdunni中的缺陷型逆转录病毒包装出 来，收集上清感染NIH3T3细胞，缺陷型逆转录病毒可整合到宿主基因组中，使 NIH3T3细胞带有Nec/基因，因此能在含G418的培养液中生长并形成克隆者为阳 性；不能生长者为阴性。
实施例1
NIH3T3细胞扩增培养 将NIH3T3细胞以lxl(f/孔接种入6孔板中，用DMEM培养液(含10%新生小牛 血清)在37° C， 5%C02中培养24小时。去除6孔板中培养液后，每孔加入0. 5ml待检样品及1.5ml DMEM培养液，并加入终浓度为8|ig/ml的Polybrene，继续 37° C， 5%(]02培养，扩增传代1 3周。作为阳性对照，在6孔板中，每孔加入 0.5mlvj/AM培养上清，其余同上。在第一周末及第三周末分别收集NIH3T3细胞 24小时培养上清，过滤后用于标记拯救试验；同时消化部分培养细胞，用于聚 合酶链反应(PCR)。
实施例2
标记拯救
将lxl06Musdunni细胞接种于10cm培养皿中，置37° C， 5%032中培养24小 时。去除培养皿中培养液后，每孔加入2ml NIH3T3细胞培养上清(前述)及3ml DMEM培养液,并加入终浓度为8pg/ml的Polybrene，置37° C, 5%0)2培养2周。 为设立阳性对照，去除培养皿中培养液后，加入2mli)/細培养上清培养的NIH3T3 细胞培养上清，其余同上。收集前述Musdurmi细胞培养上清，过滤后取lml加 入到在6孔板中培养的NIH3T3细胞，置37° C， 5%0)2中培养24小时，用含 G418(0.6pg/ml)的培养液筛选培养8、0天。在标记拯救试验中，如待测上清中 存在有复制能力的逆转录病毒，则可将Musdurmi中的缺陷型逆转录病毒包装出 来，收集上清感染NIH3T3细胞，缺陷型逆转录病毒可整合到宿主基因组中，使 NIH3T3细胞带有NeoB基因，因此能在含G418的培养液中生长并形成克隆者为阳 性；不能生长者为阴性。
权利要求
1.重组逆转录病毒的包装细胞的建立方法，其特征在于，该反转录病毒载体为缺陷型逆转录病毒载体LXSN。
2. 如权利要求l所述，其特征在于，缺陷型逆转录病毒载体LXSN含有白细胞 介素-2 cDNA。
3. 如权利要求2所述，其特征在于，白细胞介素-2cDNA含有信号肽。
4. 如权利要求3所述，其特征在于，含有信号肽的白细胞介素-2 cDNA由如下 步骤得到.-从人外周血分离得到单核细胞，经植物血凝素(PHA)刺激36小时后抽提总 mRNA。在体外合成cDNA，并以此为模板，使用含相应内切酶位点的白细胞介 素-2上下游引物，以PCR技术扩增出含信号肽的IL-2 cDNA。
5. 如权利要求l所述，其特征在于，所用包装细胞是第二代包装细胞PA317。
全文摘要
本发明提供了白细胞介素-2重组逆转录病毒的包装细胞的建立方法。采用安全性较高的第二代包装细胞PA317对含IL-2基因的缺陷型逆转录病毒载体L(IL-2)SN进行包装，产生出具有高滴度且不具有复制能力的重组逆转录病毒。
文档编号C12N15/26GK101555467SQ20081003569
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月7日 优先权日2008年4月7日
发明者钱关祥, 陈诗书 申请人:上海交通大学医学院;上海新生源医药研究有限公司